Instituto de Oncología y Radiobiología (INOR)
Unidad de Evaluación e Investigación de Productos Antitumorales
Departamento de Ensayos Preclínicos

Actividad antitumoral de extractos de plantas de la flora cubana frente a la Leucemia Linfocítica P-388

Dra. Yamila Colom Loo,¹ Lic. Mairelys Azcue Ferrera,² Lic. Rita M. Pérez Gil,³ Dra. Mabel Respall Robledo,⁴ Dr. Relman Ruiz García⁵ y  MSc. Waldo Quesada Cepero⁶

Resumen

La búsqueda de compuestos naturales con actividad antineoplásica es una de las prioridades actuales en la lucha contra el cáncer, en todos los países del mundo. El creciente empleo de la medicina verde en la prevención y cura de diferentes enfermedades ha llevado a la evaluación antitumoral de nuevos extractos de plantas, principalmente pertenecientes a la flora autóctona de cada país. En el presente trabajo se evaluó la actividad antitumoral de 27 extractos obtenidos de  plantas  de la flora cubana en el tumor señal murino Leucemia Linfocítica P-388 trasplantado en ratones B₂D₆F_1. Los animales recibieron tratamiento durante 9 días por vía intraperitoneal. En todos los casos se determinó el aumento del tiempo de sobrevida respecto al grupo control negativo, después de 30 días de observación. De los productos estudiados se observó actividad antitumoral en 2 extractos frente a la Leucemia  Linfocítica P-388, lo que las hace candidatas a ser estudiadas química y farmacológicamente con amplias perspectivas  de convertirse en posibles productos  para el tratamiento del cáncer.

Palabras clave: Actividad antitumoral, cáncer, extracto de plantas, tumor señal murino P-388.

 

Una de las prioridades del Sistema Nacional de Salud es realizar investigaciones que puedan conducir a la obtención de nuevos medicamentos para el tratamiento del cáncer, o para el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes aquejados de esta enfermedad.

La obtención de nuevos fármacos debe estar dirigida a garantizar la reducción de la diseminación de las células tumorales por el organismo (metástasis), responsable del fracaso de los tratamientos y a la búsqueda de productos que eleven la respuesta inmune del paciente deprimido debido al tratamiento o a la propia enfermedad.

En los últimos años se ha generado una intensa búsqueda de nuevos agentes antitumorales de diversas fuentes de origen, entre ellas, de la flora autóctona cubana. Las plantas han sido fuente de medicamentos de amplio uso en la quimioterapia del cáncer como los alcaloides de la Vinca y más recientemente el Taxol y las Camptothecinas.¹

Las quinonas tienen una importancia marcada en la búsqueda de sustancias antitumorales a partir de plantas, ya se han aislado compuestos tales como el Lapachol y la Jacaranona, con actividad frente a algunos tumores.²

Las plantas presentan una composición muy variada en su estructura y de ellas son diversos los compuestos activos que manifiestan efecto antitumoral. Por estas razones la búsqueda de agentes antitumorales a partir de plantas continúa siendo una tarea de interés en la obtención de mecanismos novedosos de actividad antitumoral.

Dado los resultados de estudios antitumorales in vitro de plantas de diferentes familias frente a líneas tumorales murinas y humanas,^3-7 en el presente trabajo se evalúa la actividad antitumoral de 27 extractos de plantas de la flora cubana, fundamentalmente de la familia Euphorbiaceaes, con el objetivo de obtener nuevos compuestos que puedan servir de base de posibles medicamentos antitumorales.

Métodos

Especie animal y línea. Se emplearon ratones machos de la línea B₂D₆F₁ entre 18-20 g de peso corporal, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Todos los animales fueron mantenidos en condiciones controladas de temperatura (21- 25° C), humedad relativa (50-70 %) y ciclos de luz de 12 h/día, alimentados a voluntad  con pienso en forma de pelotillas suministrado por CENPALAB y agua acidulada.

Preparación de los extractos. En este experimento se evaluaron 27 extractos de las familias Zingiberaceas, Papaveraceas, Malvaceas, Polipodeaceas, y Euphorbiaceaes, los que se codificaron según las normas establecidas en el  Laboratorio de Oncofarmacologia del INOR. Los extractos se obtuvieron de las hojas y frutos de las plantas recolectadas en el Jardín Botánico Nacional y  otras zonas de la Habana y clasificadas por la especialista del Jardín Botánico DraC. Cristina Panfet.

Extractos de bajo peso molecular (BPM). El material vegetal previamente lavado se secó en una estufa bajo corriente de aire a una temperatura menor de 40° C, se molió en un molino de cuchillas y se pesó. El material molido se extrajo previamente  con  éter de petróleo en una relación 1:2 (p:v) a temperatura ambiente con agitación  durante 24 h. Se filtró este extracto etéreo y se procedió a secar a temperatura ambiente el material vegetal. El material seco se extrajo con etanol al 95 % en una relación 1:10 (p:v) con agitación en una zaranda. Los extractos previamente filtrados se concentraron a sequedad  bajo presión reducida en un rotaevaporador a una temperatura menor de 40° C.

Extractos de alto peso molecular (APM). El material vegetal se cortó finamente, se pesó y lavó 2 veces, primero con agua corriente y después con agua destilada. Se procedió a  su secado con ayuda de una gasa. La extracción se realizó con agua destilada 10 % (p:v) durante 24 h a temperatura ambiente y con agitación en una zaranda. Esta extracción se realizó 2 veces. Los extractos se filtraron , se unieron, y concentraron por rotaevaporación a presión reducida en un rotaevaporador hasta un volumen de 1 L, a una temperatura menor de 40° C. La eliminación del agua restante se realizó por liofilización.

Selección de las dosis. Se realizó un estudio previo de toxicidad a cada extracto  con dosis de 400, 200 y 100  mg/kg definidas por el Laboratorio de Oncofarmacología del INOR, excepto para los extractos QT2B02, QT2B015 y QT2B38, en  que  se  emplearon dosis inferiores por dificultades con la solubilidad del extracto en la solución de cloruro sodio al 0,9 % (NaCl). A partir de los resultados obtenidos en estos  estudios, se seleccionaron las dosis que se emplearían en la evaluación  de la actividad antitumoral. Para cada uno de los extractos se utilizaron 3 dosis y NaCl al 0,9 % como solvente (tabla 1).

Tabla 1. Datos de los extractos ensayados

Extracto codificado	Familia	Zona de colecta	Parte de la planta	Tipo de extracto	Toxicidad	Dosis utilizadas en la evaluación antitumoral (mg/kg)
QT2B01	Euphorbiaceae	Centro Habana	hojas	APM	No tóxico	100, 200, 400
QT2B02	Euphorbiaceae	Centro Habana	hojas	APM	No tóxico	6,25, 12.5, 25 y 50
QT2B07	Zingiberacea	Plaza	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 400 mg	50, 100 y 200
QT2B08	Euphorbiaceae	Víbora	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg	12,5, 25 y 50
QT2B12	Malvacea	Guanabacoa	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 50 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B!3	Papaveracea	Plaza	hojas	APM	Ligeramente tóxico en dosis > 50 m/kg	6,25, 12.5, 25 y 50
QT2B14	Zingiberacea	Plaza	hojas	APM	Tóxico en dosis  ≥ 200 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B15	Euphorbiaceae	Centro Habana	hojas	APM	No tóxico	75, 150 y 300
QT2B16	Euphorbiaceae	Vibora	hojas	APM	No tóxico	100,200 y 400
QT2B18	Polipodeacea	Vedado	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 100 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B21	Polipodeacea	JBN	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 400 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B23	Euphorbiaceae	JBN	frutos	APM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B27	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 100 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B28	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	Ligeramente tóxico en dosis > 200 mg/kg	200, 100 y 50
QT2B30	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg/kg	25, 50 y 100
QT2B31	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 100 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B32	Euphorbiaceae	JBN	hojas y frutos	BPM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg/kg	25, 50 y 100
QT2B33	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	No tóxico	100, 200 y 400
QT2B34	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	No tóxico	100, 200 y 400
QT2B35	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	No tóxico	100, 200 y 400
QT2B36	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg/kg	25, 50 y 100
QT2B37	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 200 mg/kg	25, 50 y 100
QT2B38	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	No tóxico	8,25, 16,5 y 33
QT2B39	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	Tóxico en dosis ≥ 100 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B40	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	Tóxico en dosis ≥ 100 mg/kg	12,5, 25 y 50
QT2B41	Euphorbiaceae	JBN	hojas	APM	No tóxico	100, 200 y 400
QT2B42	Euphorbiaceae	JBN	hojas	BPM	No tóxico	100, 200 y 400

APM: alto peso molecular,  BPM: bajo peso molecular, JBN: jardín botánico nacional

Diseño experimental. A cada animal se le inocularon 1 x 10 ⁶  células tumorales de la Leucemia P-388 y a las 24 h se distribuyeron al azar en 5 grupos experimentales, 10 animales por grupo. Todos los animales se trataron  con las 3 dosis de cada extracto. Se conformó otro grupo control positivo con 5-fluoracilo (5FU)⁸ diluido en una solución de NaCl  0,9 %, a una concentración de 2 mg/mL  y en dosis de 20 mg/kg,  además, se trabajó con un grupo control negativo de 20 ratones, a los cuales se les administró NaCl al 0,9 %. Los productos se administraron por via intraperitoneal durante 9 días de tratamiento.

Los animales se mantuvieron en observación durante 30 días y se registró diariamente la sobrevida.           

La evaluación de la actividad antitumoral se realizó comparando el promedio de sobrevida de los grupos tratados respecto al promedio de sobrevida del grupo control negativo, Ps/t y Ps/c, respectivamente. El aumento de la supervivencia (AS), para todos los casos, se calculó mediante la fórmula:         

                Ps/t – Ps/c
 AS (%)    =     ——————— x 100
                   Ps/c

El criterio de actividad antitumoral se tomó cuando el valor de AS fue mayor de 25 %.

Método estadístico. Para  el procesamiento de los datos se  empleó el método estadístico de Kaplan-Meier, con un 95 % de intervalo de confianza (p<0.05).

Resultados

De los  17 extractos acuosos (APM) estudiados, sólo el codificado como QT2B18,   perteneciente a una especie de  la familia Polipodeacea  mostró actividad antitumoral frente a  la Leucemia Linfocitica  P-388.

En la tabla 2 se observa un efecto marcado en las dosis de 12,5 y 25 mg/kg, con diferencias significativas en los grupos tratados respecto al grupo control negativo (p<0,05), aunque los valores de aumento de sobrevida obtenidos fueron superiores al valor aceptado no superaron el valor del control positivo, pero es importante señalar que se trata de un extracto de origen natural y que en este caso, tuvo efecto sobre las células tumorales. Dato relevante, por ser esta línea tumoral murina, un tumor señal en los experimentos de tamizaje de productos antitumorales y ser una línea muy sensible para la evaluación de productos naturales.⁹

Tabla 2. Valores de promedio de sobrevida (Ps) y aumento del índice de sobrevida (AS) obtenidos en ratones B₂D₆F₁ portadores de la Leucemia Linfocítica P-388, bajo el efecto del tratamiento con el extracto QT2B18

Extracto/Dosis (mg/kg)	Promedio de sobrevida (Ps)	Aumento del índice de sobrevida (%)
QT2B18 (12,5)	13,60±1,12	55,4 *
QT2B18 (25 )	13,20±0,82	50,8 *
QT2B18 (50)	10,90±0,84	25,0
5FU (20 mg/kg)	19,20±0,54	119,42
Control NaCl 0,9 %	8,75±0,10	——

En la figura 1, se observa que los animales del grupo control negativo murieron  antes de los 10 días de observación, mientras que en los grupos tratados con el QT2B18 habían animales vivos después de los 20 días de observación.

Fig. 1. Actividad antitumoral del extracto QT2B18 en ratones B2D6F1 inoculados con la Leucemia Linfocítica P-388.

En la tabla 3 se aprecia que el extracto QT2B30, perteneciente a una especie de la familia Euphorbiaceae, el cual fue de los 10 extractos de BPM evaluados, mostró efecto antitumoral en la dosis mas baja (25 mg/kg) frente a la leucemia P-388. Se observó diferencia significativa en este grupo tratado respecto al  grupo control negativo (p<0,05) y se obtuvo en el primero, un valor de aumento de sobrevida mayor al valor aceptado (25 %).

Tabla 3. Valores de promedio de sobrevida (Ps) y aumento del índice de sobrevida (AS) obtenidos en ratones BDF₁ portadores de la Leucemia Linfocítica P-388 bajo el efecto del tratamiento con el extracto QT2B30

Extracto/Dosis (mg/kg)	Promedio de sobrevida (Ps)	Aumento del índice de sobrevida (%)
QT2B30 (25)	14,90 ± 1,43	35,4 *
QT2B30 (50)	11,40 ± 1,11	< 25
QT2B30 (100)	10,30 ± 1,40	< 25
5FU (20 mg/kg)	18,90 ± 0,84	71,80
Control (NaCl 0,9 %)	11 ± 0,40	——

Las curvas de sobrevida representadas en la figura 2 muestran que a los 20 días de observación habían animales vivos en el grupo tratado con la dosis menor (25 mg/kg), sin embargo en el resto de los grupos tratados  y en el grupo control negativo, los animales murieron alrededor de los 10 días. Estos resultados indican que el extracto QT2B30 puede mostrar actividad frente a este tipo de leucemia especifica, pero en dosis bajas.

Fig. 2. Actividad antitumoral del extracto QT2B30 en ratones B2D6F1 inoculados con la Leucemia Linfocítica P-388.

 

Discusión

El resultado de actividad antitumoral observada en el extracto de APM codificado como QT2B18, obtenido a partir de una especie de la familia Polipodeacea, no se correspondió con lo encontrado en la literatura revisada por los autores.

En especies de esta familia se informa actividad citotóxica y antitumoral solamente en compuestos de BPM, diterpenos y sulfolípidos,10 Sin embargo, un estudio etnobotánico realizado en Honduras en el año 1987, refiere los beneficios contra el cáncer de la decocción de la especie Polypodium leucotomos perteneciente a esta familia, utilizado por las comunidades indígenas de este país, aunque estudios realizados posteriormente en el Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos de América (EUA), con extractos obtenidos a partir del rizoma de esta especie no revelaron actividad antitumoral en células cancerosas. (Mahabir P Gupta, editor. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo (CYTED). Sub Programa de Química-Fina Farmacéutica. 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas. SECAB – CYTED.1995:452-3.)

El resultado obtenido con el extracto de BPM de una especie de la familia Euphorbiaceae codificado como QT2B30, si se correspondió con lo referido para esta familia, de la cual se han aislado  compuestos  como las lactonas diterpenos que pueden estar presentes en este  extracto de bajo peso molecular, y para los que se informa actividad  antitumoral frente a una  línea de leucemia humana.¹¹

Se puede concluir que la evaluación de la actividad antitumoral de extractos de plantas de la flora cubana logró 2 especies con  tal actividad en la Leucemia Linfocitica P-388, lo que las hace candidatas a ser estudiadas química y farmacológicamente con amplias perspectivas  de convertirse en posibles productos  para el tratamiento del cáncer. Se recomienda  realizar estudios para determinar la acción de estos extractos en otros modelos de tumores trasplantables.

Agradecimientos

Deseamos agradecer a los técnicos, Melba Betancourt, Julio Carvajal, Lissbet Pimienta, Concepción Brito y María Luisa Acevedo del Laboratorio de Oncofarmacología y del Laboratorio de Química y Toxicología, de la Unidad de Evaluación de Productos Antitumorales, su participación  en este trabajo.

Summary

Anti-tumor action of Cuban plant extracts against lymphocytic leukemia P-388

The search for natural compounds having anti-neoplastic action is one of the present priorities in the struggle against cancer all over the world. The increasing use of herb medicine in preventing and curing several diseases has led to the evaluation of the anti-tumor properties of new plant extracts, mainly from the indigenous flora of each country. The present paper assessed the anti-tumor action of 27 extracts from Cuban plants on murine signal tumor lymphocytic leukemia P-388 transplanted into B2D6F1 mice that were treated intraperitoneally for 9 days. The rise in survival time compared to the negative control group after 30 day-observation period was determined in all the cases. Of the studied products, anti-tumor action against lymphocytic leukemia P-388 was detected in two extracts, which will probably be studied from the chemical and pharmacological viewpoints, with great possibilities of becoming would-be products for the treatment of cancer.

Key words: Anti-tumor activity, cancer, plant extracts, murine signal tumor P-388.

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Recibido: 30 de noviembre de 2004. Aprobado:  22 de julio de 2005.
Dra. Yamila Colom Loo. Instituto de Oncología y Radiobiología (INOR). Unidad de Evaluación e Investigación de Productos Antitumorales. Departamento de Ensayos Preclínicos. Calle 29 y E, Vedado, Plaza de La Revolución. La Habana, Cuba.
Telef.-55-25-89 e-mail: [e-mail]

¹Médico Veterinaria. Aspirante a Investigadora.
²Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Aspirante a Investigadora.
³Licenciada en Química. Investigadora Auxiliar.
⁴Médico Veterinaria.
⁵Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
⁶Máster en Radioquímica. Aspirante a Investigador.

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