Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).

Desarrollo y validación de dos métodos espectrofotométricos para la cuantificación de antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa en la crema de aloe al 50 %

Lic. Jacqueline Aylema Romero Díaz,1 MSc. Caridad Margarita García Peña,2 Lic. Rosa Menéndez Castillo,3 Téc. Vivian Martínez Espinosa.4

RESUMEN

Se realizó la validación de dos métodos espectrofotométricos que posibilitan cuantificar antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa en la crema de Aloe al 50 %, pues la literatura no cuenta con métodos oficiales que permitan cuantificar dichos compuestos en esta crema. Se determinó que ambos métodos cumplían con todos los requisitos de validación propuestos para el estudio de estabilidad del producto terminado: linealidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), exactitud y especificidad.

Palabras clave: Métodos espectrofotométricos, antracenderivados totales, análisis, polisacáridos en base manosa, aloe, validación.

Aloe vera L. ( Aloe barbadensis Miller) planta suculenta originaria de África septentrional e introducida en las Antillas y en América Central, ha sido utilizada ampliamente en la medicina popular y explotada industrialmente en la elaboración de cosméticos, bebidas y medicamentos, además de la comercialización de las diversas materias primas obtenidas de sus hojas. 1

La crema de Aloe presenta entre sus componentes principales antracenderivados totales y polisacáridos a los que se les atribuye acción como cicatrizantes, emolientes y humectantes.1

La validación de un método es aquel proceso por el cual se establece mediante estudios de laboratorio que su capacidad satisface los requisitos para las aplicaciones deseadas; esta capacidad se expresa en términos de parámetros de análisis, donde se tiene en cuenta la linealidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), exactitud, especificidad, sensibilidad, entre otros, en dependencia del objetivo que se persiga 2,3

En la actualidad reviste gran importancia la validación de métodos, procesos, etc., que permitan mayor confiabilidad en los resultados, fundamentalmente cuando se trabaja con productos naturales, donde es necesario obtener datos y resultados experimentales que demuestren la aptitud para el uso que se destina; es por ello, que nos trazamos como objetivo la validación de dos métodos espectrofotométricos que permiten cuantificar los compuestos según referencias bibliográficas, y de esta manera proponer ambos métodos para el estudio de estabilidad del producto terminado.

MÉTODOS

Como material se empleó la crema de Aloe al 50 %. A partir del producto terminado se prepararon las muestras para el proceso de validación de los dos métodos espectrofotométricos para cuantificar antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa, los cuales se describen a continuación.

Método para determinar antracenderivados totales:4,5

Se pesaron 0,5 g de crema, posteriormente se disolvió en 10 mL de Metanol, se transfirió el sobrenadante a un balón de 100 mL acoplado a un condensador allihn, se añadieron 0,6 g de cloruro férrico y 6 mL de ácido clorhídrico, se calentaron hasta ebullición y se reflujaron durante 4 horas. Se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Después la solución se transfirió cuantitativamente a un embudo separador de 250 mL, se lavó el balón primeramente con 10 mL de agua y después con 30 mL de éter etílico, se adicionaron los líquidos de lavados a la solución principal en el embudo separador, se agitó durante 5 minutos y la fase etérea se recibió en un embudo separador de 250 mL. Posteriormente se extrajo la muestra 2 veces con dos porciones de 15 mL de éter etílico, con agitación durante 5 minutos, se reunieron todos los extractos etéreos y se lavaron con 30 mL de agua 3 veces.

Se efectuaron las extracciones con agitación cuidadosa durante 5 minutos de la fase etérea con 2 porciones de 10 mL de solución alcalino amoniacal. Las fracciones acuosas así obtenidas se reunieron en un matraz aforado de 25 mL, se enrasaron con la solución alcalina amoniacal y se agitaron.

En 11 matraces aforados de 10 mL se transfirieron las cantidades de solución patrón de Cloruro de cobalto indicadas, con el objetivo de realizar la comparación para fotometría, se completó el volumen con agua destilada, se empleó como blanco la solución que no contiene cloruro de cobalto:

VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE CLORURO DE COBALTO DE 50 g/L mL	CONCENTRACION DE CLORURO DE COBALTO % m-v	CONCENTRACION EQUIVALENTE DE ACIDO CRISOFÁNICO mg/100mL
0(1)	0,0	0
3	0,6	0,645
5	1,0	1,075
6	1,2	1,290
7	1,4	1,505
9	1,8	1,940
10	2,0	2,000
11	2,2	2,365
13	2,6	2,795
15	3,0	3,225

Se realizó la medición fotométrica en un espectrofotómetro ajustado a 525 nm, empleando cubetas de vidrio con un espesor de 10 mm y utilizando la solución amoniacal como blanco.

Se determinó la concentración de ácido crisofánico correspondiente a la absorbencia de la solución de la porción de ensayo.

X = C x V 2 x 1.59
V 1

Donde C: concentración de ácido crisofánico en mg/100 mL, obtenida de la curva de calibración, V 1: volumen de la muestra (mL), V 2: volumen de dilución final (mL);1.59: masa molecular promedio de antraglicósidos / masa molecular promedio de agliconas.

Método espectrofotométrico para cuantificar polisacáridos en base manosa: 4,5

Se pesaron 0,2 g de crema, posteriormente se disolvió en 25 mL de diluente (M 1 ), aplicándose vortex por 10 minutos, posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 5000 rpm, se trasvasaron 5 mL a un matraz aforado de 10 mL completando volumen con solución diluente (M 2 ).

Se pesaron 50 mg de manosa y se trasvasaron a un matraz aforado de 100 mL, se completó el volumen con diluente salino. De la solución (S 1), se tomaron alícuotas de 1 (20 mg), 2 (40 mg), 3 (60 mg), 4 (80 mg) y 5 (100 mg) mL que se trasvasaron a matraces aforados de 25 mL, y se completó volumen con diluente salino (S 2).

Para realizar el desarrollo de color se tomaron 2 mL de la solución (M 2) y 2 mL de la solución (S 2), se adicionaron 1 mL de Fenol al 5 %, posteriormente se agitaron, luego se adicionaron 5 mL de ácido Sulfúrico (principio activo) y se agitaron, se dejaron en reposo durante 20 minutos y posteriormente se procedió a leer en el espectrofotómetro.

Se tomaron 2 mL de agua destilada para preparar el blanco, se adicionaron 1 mL de Fenol al 5 %, posteriormente se agitaron, luego se adicionaron 5 mL de ácido Sulfúrico (principio activo) y se agitaron, se dejaron en reposo durante 20 minutos y posteriormente se procedió a leer en el espectrofotómetro.

Se realizó la medición fotométrica en un espectrofotómetro ajustado a 490 nm, se emplearon cubetas de vidrio con un espesor de 10 mm.

Se determinó el porciento de polisacáridos (en base a manosa) en la muestra de ensayo:

% = (Am – A) x 0.0031

B x Pm

Donde: Am: Absorbancia de la muestra; A y B se obtienen de la curva de calibración de la sustancia de referencia química (con un coeficiente de correlación igual o mayor que 0.99); Pm: Pesada de la muestra en gramos; 0.0031: Factor matemático para el cálculo.

Los parámetros evaluados en el proceso de validación fueron:

Linealidad: se prepararon cinco soluciones muestras, cada una por triplicado, correspondiente al 60, 80, 100, 120 y 140 % de la cantidad teórica declarada indicado en cada método y se determinó la absorbancia de cada una. Posteriormente se construyeron curvas de absorbancia contra concentración y se efectuó un análisis de regresión, calculando el coeficiente de regresión (r), el coeficiente de determinación (r2), coeficiente de variación de los factores de respuesta (CVf), las pendientes, interceptos y significación de las pendientes e interceptos. El criterio establecido es: CVf = 1,5 %; r = 0,99; r 2 = 0,98; intercepto que no sea significativamente diferente de cero y la pendiente significativamente igual a 1.6
Precisión: este parámetro incluye la repetibilidad y precisión intermedia. Se realizó una prueba de Fischer y una prueba t de Student.3
Repetibilidad: se repitieron los métodos espectrofotométricos señalados anteriormente, seis veces cada uno, para la muestra correspondiente al 100 %, por el mismo analista, el mismo día y con el mismo equipo. El criterio establecido es: CV = 1,5 %.2,3
Precisión intermedia: se efectuó con la muestra correspondiente al 100 %, por triplicado, por dos analistas, dos días diferentes. El criterio establecido es: CV = 3,0 %.6
Exactitud: Se partió de una muestra de la que se tomaron 3 alícuotas y se les añadieron cantidades crecientes de patrón correspondiente al 80, 100 y 120. Los resultados se expresaron como porcentaje de recobro (R) y coeficiente de variación (CV). El criterio establecido es: R=97-103 %; CV = 3,0 %.
Especificidad: se analizaron muestras que contenían solamente las sustancias de interés, otras que contenían placebo y otras que se correspondían a las muestras. Todos los ensayos se efectuaron por triplicado y como criterio se establece que no debe existir absorbancia significativa del placebo en la longitud de onda de trabajo.2,3

Todos los resultados obtenidos fueron procesados de forma automatizada, con el empleo del programa estadístico Stat para Windows, se realizó el análisis de regresión de la curva de calibración para determinar la significación de las pendientes y los interceptos.

RESULTADOS

En el primer parámetro evaluado que fue la linealidad, se obtuvieron valores de coeficientes de correlación r igual a 0,99988 y 0,99281, para el método de cuantificación de antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa respectivamente, así como coeficientes de variación de los factores de respuesta de 0,84 % para el primer caso y 2,97 % para el segundo.

El análisis estadístico de regresión mediante Stat para Windows ofreció al método de cuantificación de antracenderivados totales, un intercepto que no es significativamente diferente de cero: - 0,0042 con un error estándar de 0,004 y una probabilidad de 0,3859, o sea, mayor que 0,05. La pendiente resultó ser significativamente igual a uno: 3,34144 con un error estándar de 0,009 y una probabilidad menor que 0,05, o sea, 0,0001.

Para el método de cuantificación de polisacáridos en base manosa el intercepto no es significativamente diferente de cero: 0,0343 con un error estándar de 0,0012 y una probabilidad de 0,4589 (> 0,05). La pendiente es significativamente igual a uno: 3,625 con un error estándar de 0,0189 y una probabilidad de 0,0096 (< 0,05).

Para la repetibilidad (tabla 1) se apreciaron valores de CV=1,96 y 1,33 % para el método de antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa respectivamente. La precisión intermedia del método para cuantificar antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa, pueden apreciarse en las tablas 2 y 3, respectivamente.

Tabla 1. Estudio de la repetibilidad de los métodos analíticos

Antracenderivados totales	Polisacáridos (en base manosa)
4,73	0,431 %
4,80	0,441 %
4,93	0,449 %
4,74	0,440 %
4,84	0,438 %
4,99	0,433 %
Xmedia = 4,84	Xmedia = 0,4386 %
C.V = 1,96 %	C.V = 1,33 %

Tabla 2. Estudio de precisión intermedia del método para cuantificar antracenderivados totales

Analista 1		Analista 2
Día 1	Día 2	Día 1	Día 2
4,88	4,73	4,72	4,82
4,60	4,80	4,98	4,74
4,52	4,93	4,92	4,62
4,66	4,74	4,61	4,93
4,68	4,84	4,67	4,75
4,88	4,99	4,74	4,82
Xmedia = 4,70	Xmedia = 4,84	Xmedia = 4,77	Xmedia = 4,78
C.V = 2,86 %	C.V = 1,96 %	C.V = 2,77 %	C.V = 1,98 %
F calculado = 1,38 F tabulado (10,10 / 0,05) = 2,97 t calculado = 1,20 t tabulado (22 / 0,05) = 2,07

Tabla 3. Estudio de precisión intermedia del método para cuantificar polisacáridos en base manosa

Analista 1		Analista 2
Día 1	Día 2	Día 1	Día 2
0,421 %	0,429 %	0,439 %	0,431 %
0,432 %	0,415 %	0,432 %	0,441 %
0,424 %	0,421 %	0,427 %	0,449 %
0,419 %	0,430 %	0,431 %	0,440 %
0,422 %	0,420 %	0,434 %	0,438 %
0,431 %	0,424 %	0,430 %	0,433 %
Xmedia = 0,4248 %	Xmedia = 0,423 %	Xmedia = 0,4321 %	Xmedia = 0,4386 %
C.V = 1,16 %	C.V = 1,23 %	C.V = 0,86 %	C.V = 1,33 %
F calculado = 1.14 F tabulado (10,10 / 0,05) = 2,97 t calculado = 1.74 t tabulado (22 / 0,05) = 2,07

Por su parte la exactitud, brindó valores de coeficientes de recobro R de 98,45 y 99,50 %, así como CV de 0,67 y 0,22 %, para el método analítico de cuantificación de antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa, respectivamente.

Finalmente se determinó la especificidad de los métodos donde se obtuvo como resultado al aplicar ANOVA 1, para el 95 % de confianza, que no existían diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios de absorbancia de las sustancias de referencia y las muestras y la del placebo con dichas sustancias, lo cual demuestra que el placebo no absorbió significativamente en la longitud de onda de trabajo, pues las absorbancias fueron de 0,006 para el método de antracenderivados totales y 0,008 para el de polisacáridos en base manosa, valores muy cercanos a cero.

DISCUSIÓN

Al analizar los resultados obtenidos en la linealidad se pudo constatar que los valores de coeficientes de correlación r para los dos métodos evaluados, se acercaron bastante a la unidad, además de obtener coeficientes de determinación,2 coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf, pendientes e interceptos dentro de los límites exigidos. Todo lo anterior nos permite afirmar que existe una buena correlación entre la concentración y la respuesta obtenida (valores de absorbancia), lo cual demuestra linealidad en el rango de concentraciones estudiadas.

La precisión, evaluada como repetibilidad y precisión intermedia, mostró resultados satisfactorios, pues los coeficientes de variación determinados en ambos métodos cumplieron con el criterio de aceptación. Se realizó la prueba de Fischer, donde se apreció que no existían diferencias estadísticamente significativas entre la precisión alcanzada por ambos analistas. También se aplicó la prueba t de Student, la cual reveló la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre las medias obtenidas por los analistas. El cumplimiento de ambos estudios nos permite afirmar que el método es preciso.

Otro aspecto importante que se tuvo en cuenta en el proceso de validación fue la exactitud, la cual se expresa por el coeficiente de recobro R y el coeficiente de variación CV. Como se puede evidenciar, los métodos propuestos son exactos, ya que los valores de porcentajes de recobro y coeficientes de variación se encuentran dentro del intervalo establecido.

En el último parámetro medido (especificidad) hay que señalar que los dos métodos son específicos, pues se comprobó al aplicar ANOVA 1, para un 95 % de confianza, que el placebo no absorbió de forma significativa en la región de trabajo, pues las absorbancias fueron casi cero.

Todo el estudio desarrollado nos permite afirmar que los métodos espectrofotométricos propuestos para la cuantificación de antracenderivados totales y polisacáridos en base manosa, validados para el estudio de estabilidad de la crema de Aloe al 50 % son fiables, pues demuestran mantener los criterios fundamentales de linealidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), exactitud y especificidad.

Summary

Development and validation of two spectrophotometric methods to quantify total antracen-derivatives and polysaccharides in Mannose base in 50 % Aloe cream

A validation of two spectrophotometric methods allowing to quantify total antracen-derivatives and polysaccharides in Mannose base in 50 % Aloe cream, since in literature there isn’t official methods allowing to quantify such compounds in this cream.  It is determined that both methods fulfiled validation criteria proposed fot stability study of finished product (linearity,precision, repetibility, and intermediate pecision, accuracy, and specificity)

Key words: Spectrophotometric methods, total antracen-derivatives, analysis, Mannose base polysaccharides, Aloe, validation.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Skousen Max B. Sábila: salud, belleza y vitalidad. USA: Universal Concepts;1980.

2. United States Pharmacopoeial Convention, USP 29. Validation of compendial methods. 29 ed. Rockville: Mack Printing;2006.

3. Analytical Procedures and Methods Validation Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. FDA/Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for Industry;2001.

4. Farmacopea Soviética X, artículo 42-1443-80; Especificación # 308-68.1988.

5. Analytical Procedure and Methods Validation. Draft Guidance. Guidance for Industry (August 2000).

6. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical procedures: Methodology. Geneva:ICH-Q2B;1996.

Recibido: 27 de febrero de 2007. Aprobado: 25 de abril de 2007.
Lic. Jacqueline Aylema Romero Díaz. Ave. 26 No. 1605 e/ Boyeros y Puentes Grandes. Plaza de la Revolución. Teléfono: 8811944 ext. 21. E-mail: [e-mail], [e-mail].

1Licenciada en Bioquímica. Reserva científica.
2Master en Tecnología y Control de Medicamentos. Investigador Agregado.
3Licenciada en Química. Investigador Auxiliar.
4Técnico Medio en Tecnología Farmacéutica.