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Revista Cubana de Plantas Medicinales

versión On-line ISSN 1028-4796

Rev Cubana Plant Med vol.17 no.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2012

 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Actividad biológica de los aceites esenciales de Acmella ciliata (Kunth) Cass.

 

Biological activity of essential oils from Acmella ciliata (Kunth) Cass.

 

 

Quim. Carlos Andrés Rincón Mejía, Dr. C. Jhon Carlos Castaño Osorio, MSc. Eunice Ríos Vázquez

Universidad del Quindío. Colombia.

 

 


RESUMEN

Introducción: Acmella ciliata (Kunth) Cass. es una arvense nativa del norte de Suramérica conocida por su contenido de alcamidas alifáticas, se usa popularmente como anestésico y analgésico contra los dolores de muelas y de garganta.
Objetivos
: obtener, analizar y evaluar la actividad biológica de los aceites esenciales de las flores y hojas de Acmella ciliata (Kunth) Cass.
Métodos
: se obtuvieron los aceites esenciales de Acmella ciliata por hidrodestilación e hidrodestilación asistida por microondas, y se analizaron por cromatografía de gases acoplados a un espectrómetro de masas. La actividad biológica de los aceites esenciales se determinó mediante el método modificado de pozos de agar, se evaluaron sus actividades antimicrobianas frente a 5 bacterias y 1 hongo, junto con pruebas de toxicidad en Artemia salina.
Resultados
: la hidrodestilación asistida por microondas fue la técnica con mejores rendimientos en la extracción de los aceites esenciales de Acmella ciliata. Sus fracciones volátiles contienen una alta proporción de sesquiterpenos como el trans-β-cariofileno, su componente mayoritario. Los aceites esenciales a 2 concentraciones diferentes (25 y 15 mg/mL) presentaron una marcada actividad antimicrobiana frente a las bacterias grampositivas Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis; además exhibieron una baja toxicidad contra Artemia salina, con dosificaciones letales medianas de 176,156 ppm y 100,104 ppm para el aceite esencial de las hojas y flores, respectivamente.
Conclusiones
: los aceites esenciales de Acmella ciliata son productos que presentan un alto contenido de terpenoides, con marcada acción antimicrobiana frente bacterias grampositivas (Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis) y baja toxicidad en Artemia salina.

Palabras clave: Acmella ciliata, trans-β-cariofileno, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, dosificación letal mediana, productos con acción antimicrobiana.


ABSTRACT

Introduction: Acmella ciliata (Kunth) Cass. is a native weed of northern South America known by its aliphatic alkamide content and used as an anesthetic and analgesic for toothache and sore throat.
Objective
: to obtain, to analyze and to evaluate the biological activities of essential oils from Acmella ciliata (Kunth) Cass flowers and leaves.
Methods
: Acmella ciliata essential oils were obtained by hydrodistillation and microwave-assisted hydrodistillation and analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The biological activity of both essential oils was determined by using the modified agar-well diffusion assay, evaluating their activities against five bacteria and one fungus, along with tests of toxicity in Artemia salina (Lethal Dose 50).
Results
: microwave-assisted hydrodistillation was the technique with the best performances in the extraction of Acmella ciliata. essential oils. Their volatile fractions contain a high proportion of sesquiterpenes such as β-trans-caryophyllene, the major component. Essential oils at two different concentrations (25 mg/mL and 15 mg/mL) showed a strong antimicrobial activity against gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, in addition they exhibited low toxicity against Artemia salina, presenting mean lethal doses of 176, 156 and 100,104 ppm for the essential oils from leaves and flowers, respectively.
Conclusions
: Acmella ciliata essential oils are products with high content of terpenoids and marked antimicrobial activity against gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis) and low toxicity against Artemia salina.

Key words: Acmella ciliata, β-trans-caryophyllene, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, lethal dose 50, products with antimicrobial action.


 

 

INTRODUCCIÓN

Acmella ciliata (Kunth) Cass es nativa del norte de Suramérica y se ha naturalizado en las islas Célebes, India, Sumatra y Tailandia. En la más antigua documentación de esta especie se alude erróneamente como Spilanthes ciliata.1 Esta especie Arvense o mal llamada "maleza" es un famoso remedio popular para el dolor de muelas y garganta, así como para las infecciones de las encías. Se ha sabido que la masticación de sus hojas y flores tienden a adormecer la boca y así aliviar temporalmente el dolor dental y oral.2 Los compuestos bioactivos a los que se le atribuyen estos efectos son las alcamidas alifáticas, que han demostrado su eficacia como compuestos medicinales, saborizantes e incluso en control biológico, por lo que son un grupo de metabolitos de gran interés actual.3

El análisis por cromatografía de gases de los aceites esenciales de tallos, hojas e inflorescencias de Acmella ciliata ha mostrado la especificidad de sus órganos en el desarrollo de su fracciones volátiles.4 También se ha reportado su acción insecticida y antibacteriana, aun así, no existen muchos detalles acerca de investigaciones farmacológicas llevadas a cabo para A. ciliata.5

En esta investigación, por ende, se buscó realizar un paralelo entre la composición química de los aceites esenciales de las flores y hojas de A. cilliata obtenidos y su respectiva actividad biológica, así como la viabilidad en su extracción.

 

MÉTODOS

Recolección y secado del material vegetal

Las flores y hojas de Acmella ciliata se recolectaron a las 6:00 a.m. en la Universidad del Quindío, municipio de Armenia, Colombia, a una altitud de 1 483 m sobre el nivel del mar y una temperatura entre 20 y 24 ºC. El espécimen vegetal que sirvió de material de referencia entró al herbario de la Universidad del Quindío (HUQ) con el número 32750. Ambos órganos se secaron por separado en una estufa con circulación de aire a 35 ºC durante 24 h. Es de aclarar que el estudio se efectuó conforme a las reglamentaciones y los principios éticos existentes para la investigación en animales, los estudios clínicos y los derechos de biodiversidad.

Obtención de los aceites esenciales por hidrodestilación (HD) e hidrodestilación asistida por microondas (MWHD)

Se utilizaron 50 g de material vegetal seco. Las destilaciones se realizaron en un equipo de hidrodestilación del tipo Clevenger y en un equipo de destilación simple adaptado a un horno microondas convencional marca Samsumg modelo MW1260WA, con una potencia de 1,55 kw. Los aceites esenciales obtenidos se extrajeron del hidrolato por separación líquido-líquido con diclorometano y secado sobre sulfato de sodio anhidro; se almacenaron en viales ámbar a 4 ºC hasta la realización de los respectivos análisis. Los rendimientos en la extracción se evaluaron por triplicado a tiempos de 30, 45, 60, 75 y 90 min, operando siempre bajo las mismas condiciones,6 según la ecuación siguiente:

Análisis fisicoquímicos del aceite esencial

Se determinó el peso específico, índice de refracción y pH.

Análisis cromatográficos del aceite esencial

Se disolvieron 50 µL del aceite esencial (AE) en 1 mL de diclorometano, se inyectaron en un cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas marca Shimadzu GC-MS QP-2010; sistema equipado con autoinyector AOC-20i, automuestreador AOC-20s, inyección split-splitless, modo de ionización EI/SCI/NCI, sistema de inserción directa controlado por el software GCMS solution, columna Rtx-CLPesteicides Restek (30 m´0,25 mm DI, 0,25 µm espesor de película) y base de datos de fragmentogramas Wiley, 7ma. Edición, 2003. La temperatura del horno se programó de 40 ºC (15 min) hasta 250 ºC a 5 ºC/min. Se utilizó como gas helio (99,9995 %) de grado 5,0 UAP, con una velocidad lineal de 35 cm/s; las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de transferencia se mantuvieron a 230 y 285 ºC, respectivamente. Se empleó n-tetradecano como patrón interno.

Actividad biológica

Actividad antimicrobiana

Se usaron Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus, Staphylococus epidermidis y Candida albicans (ATCC 9808). Las bacterias se obtuvieron de aislados clínicos provenientes de la Clínica Central del Quindío, los cuales se identificaron en el Centro de Investigaciones Biomédicas de la Universidad del Quindío.

Preparación del inóculo

Las bacterias y levaduras congeladas en medio más glicerina, se activaron agregando 20 µL de los microorganismos en 5 mL de caldo nutritivo (tioglicolato para bacterias y PYG para levaduras) e incubando a 37 ºC (bacterias) y 30 ºC (levaduras) hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. El inóculo se preparó tomando la cantidad necesaria del microorganismo en estudio (previamente activado) y disolviéndolo en caldo o solución salina hasta lograr una turbidez comparable al patrón de turbidez 0,5 McFarland; esta comparación se llevó a cabo visualmente utilizando un fondo blanco con líneas negras contrastantes y fuente de luz adecuada.7

Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceite esencial mediante el método modificado de pozos de agar

Se prepararon diferentes emulsiones del aceite esencial, a 2 concentraciones: 25 mg/mL y 15 mg/mL en Tween 20 a 5 %. Se hizo el frotis del inóculo sobre cada una de los agares selectivos estipulados para los microorganismos. Posteriormente, se hicieron los pozos sobre la superficie de los agares con ayuda de un sacabocados estéril de 3 mm de diámetro, y en cada uno de ellos se vertieron 25 µL de la solución de aceite esencial, blancos y controles positivos. Se dejó reposar por 15 min; las cajas se incubaron a 37 ºC y al cabo de 24 h se leyeron los resultados. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento microbiano se expresó en milímetros.8

Dosis letal media (DL50)

La determinación de toxicidad en Artemia salina se realizó por exposición de los crustáceos a concentraciones decrecientes (1 000, 750, 500, 250, 125, 50, 25, 12,5 ppm) de los aceites esenciales de A. ciliata. A cada pozo de una placa de 24 pozos, se le adicionó 1 mL de la solución salina que contenía 10 A. salina. Luego se transfirieron 1 mL de cada disolución (por triplicado). Se hizo un control por muestra. Finalmente se agregó solución salina hasta completar 3 mL. Se adicionó una gota de suspensión de levadura (3 mg de levadura seca disuelta en 5 mL de agua de mar) como alimento. Se hizo la lectura de artemias muertas por cada dilución a diferentes tiempos. Los resultados se procesaron por el programa STATGRAPHICS Plus Versión 5.1 transformando los porcentajes de mortalidad en probits, los cuales se utilizaron para calcular la DL50 del aceite esencial.

 

RESULTADOS

Obtención de los aceites esenciales por hidrodestilación e hidrodestilación asistida por microondas

Las cinéticas presentadas en las figuras 1 y 2 muestran la eficacia de la hidrodestilación asistida por microondas sobre la hidrodestilación en la extracción del aceite esencial de los órganos utilizados. Por ambos métodos, el tiempo con un mayor rendimiento es 90 min, con un rendimiento porcentual para el aceite esencial de las hojas de 0,163 % y para el aceite esencial de las flores de 0,11 %.

 

 

Análisis fisicoquímicos del aceite esencial

Tanto el aceite esencial de las hojas como el de las flores presentan una coloración amarilla tenue. Las propiedades fisicoquímicas de estos aceites son descritas en la tabla 1. Ambos aceites presentaron un pH ácido, que constituye un factor clave para su actividad bactericida.

Análisis cromatográfico de los aceites esenciales

La identificación de los componentes, los tiempos de retención y porcentajes de abundancia son reportados en las tablas 2 y 3. Los sesquiterpenos, así como los terpenoides oxigenados son los metabolitos volátiles con mayor abundancia en el aceite esencial de las hojas. Los compuestos mayoritarios encontrados son trans-β-cariofileno (26,813 %), D-germacreno (23,412 %) y óxido de cariofileno (9,271 %). El aceite esencial de las flores contiene monoterpenos cíclicos y acíclicos, sesquiterpenos y terpenoides oxidados (tabla 3). Sus componentes mayoritarios son trans-β-cariofileno (24,040 %), β-felandreno (17,143 %) y óxido de cariofileno (11,907 %).

Tabla 2. Composición química del aceite esencial de las hojas de Acmella ciliata

No. Pico

Tiempo de retención (min)

Componente

Abundancia (%)

1

13,273

β-felandreno

0,497

2

13,587

α-pineno

0,960

3

23,793

β-bourboneno

0,702

4

24,669

trans-β-cariofileno

26,813

5

25,564

α-humuleno

2,121

6

26,251

D-germacreno

23,412

7

26,633

3-trideceno

3,463

8

26,697

trans- α-bisaboleno

3,303

9

26,680

1-metil-(5-metil-1-metileno-4- hexenil) ciclohexano

3,424

10

27,249

δ-cadineno

1,240

11

27,435

2,2,7,7,tetrametiltriciclo[6.2.1.0(1,6)]undec-4-en-3-ona

0,820

12

27,671

α-humuleno

1,378

13

27,990

óxido de cariofileno

0,904

14

28,139

β -farneseno

1,673

15

28,574

espatulenol

4,994

16

28,728

óxido de cariofileno

9,271

17

30,342

triétil citrato

4,601

18

30,492

ar-tumerona

3,517

19

31,049

androstan-17-ona, 3-etil-3-hidroxi

1,121

20

31,331

curlona

1,068

21

34,270

2-Butenal, 2-metil-4-(2,6,6-trimetil-1-ciclohexen-1-ilo)

0,691

22

39,502

fitol

1,175

 

 

Tabla 3. Composición química aceite esencial de las flores de Acmella ciliata

No. Pico

Tiempo de
 retención (min)

Componente

Abundancia (%)

1

10,131

α-pineno

0,543

2

11,442

sabineno

6,610

3

12,069

β-mirceno

1,236

4

12,438

ciclohexano, 1-metileno-4-(1-metiletenil)

1,605

5

13,246

β-felandreno

17,143

6

13,566

ocimeno

12,465

7

17,935

1-terpinen-4-ol

0,380

8

18,203

2-ciclohexen-1-ona, 4-(1-metiletil)

1,387

9

23,944

β-elemeno

0,334

10

24,201

α-gurjuneno

0,642

11

24,699

trans<