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INTRODUCCIÓN
El uso de la rata con fines científicos e investigativos se remonta al siglo XVI; sin embargo, su desarrollo como modelo experimental aparece hacia 1906.1 Según el último informe del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de España, sobre usos de animales en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia, muestra que del total de animales utilizados en dicho país más de 40 % corresponde al grupo de los roedores. Después del ratón (Mus musculus) la especie más empleada es la rata (Rattus norvegicus). 2) Las ratas de laboratorio presentan un período de gestación relativamente corto (21-22 días), con un número alto de crías, similitud bioquímica con el ser humano y su genética está ampliamente estudiada.3 Los usos de este mamífero con fines científicos incluyen estudios neurobiológicos, del desarrollo y la fertilidad.4
Existen investigaciones en las cuales es imprescindible conocer el tiempo exacto de la gestación de los animales.4,5,6,7 El apareamiento programado es la técnica de elección con tales fines.6,8
En la actualidad, uno de los métodos empleados para diagnosticar la preñez en ratas es la palpación transdérmica del útero, aunque este solo muestra resultados efectivos entre el día 10 y 12 de la gestación, además el éxito de la maniobra es variable. 9) También existen otros indicadores de preñez como: el aumento del volumen abdominal (día 13), el desarrollo mamario (día 14) y el aumento del consumo de alimentos.8,10 No obstante, estos métodos e indicadores de preñez, exigen en su mayoría un nivel de experticia no despreciable por parte del investigador para llegar al diagnóstico definitivo de la misma. Por otra parte, mediante el método ultrasonográfico se ha podido confirmar la preñez a partir del día 9 de la gestación, pero tiene como inconveniente la necesidad de anestesiar al animal y el costo del equipo ultrasonográfico.4,8,11
Paronis et al.4 lograron una efectividad de 100 % en el diagnóstico de preñez de ratas Wistar a partir del peso corporal entre los días 14 y 19 de gestación. No obstante, sería favorable la obtención de un diagnóstico de la gestación en días más tempranos. En estudios con ratones wildtype C57BL6/6J, Heyne et al.6 realizaron una investigación en la que lograron diagnosticar el día exacto de la preñez a partir de la ganancia de peso corporal entre los días 7 y 10, apoyados en el método de apareamiento programado. Lo que abre la interrogante de si se pueden esperar resultados similares en ratas.
En aquellas investigaciones que se realizan en períodos específicos de la gestación es imprescindible el diagnóstico temprano y certero de la preñez para la correcta toma de decisiones. Además, se evita el seguimiento y la manipulación innecesaria de los roedores. Teniendo en cuenta las deficiencias de los métodos diagnósticos e indicadores de preñez enunciados, la determinación del peso corporal en ratas potencialmente gestadas sobresale como una opción no despreciable. Este enfoque se apoya, sobre todo, en la naturaleza no invasiva de la técnica y el bajo grado de complejidad. El peso es un dato de fácil obtención, además de ser uno de los indicadores de la gestación. Por lo que su evolución en el transcurso de los días pudiera ser esencial en la búsqueda de un diagnóstico definitivo. No obstante, se hace necesario determinar el día de la gestación a partir del cual la diferencia de peso corporal permita hacer un diagnóstico certero de la preñez de las ratas. Esto evitaría la manipulación innecesaria de las mismas, con la consiguiente disminución del estrés y mejora de su bienestar.
El objetivo del presente estudio es determinar en qué día de la gestación el aumento del peso corporal alcanza la relevancia suficiente para establecerse el diagnóstico de preñez en ratas Wistar heterocigóticas.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se desarrolló un estudio observacional, prospectivo, de corte longitudinal en el Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón", de noviembre de 2022 a enero de 2023.
De una población constituida por ratas con una edad de 12 semanas de la línea Wistar, se seleccionaron al azar 37 hembras vírgenes y 8 machos. Los animales fueron suministrados por el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB).
Las hembras se dividieron en dos grupos para el estudio, grupo RG: 24 ratas gestadas y grupo RNG: 13 ratas no gestadas. Ambos grupos se mantuvieron en condiciones convencionales controladas, con alimentación ad libitum, el cual consistió en pienso para ratas producido en el CENPALAB y que cubrió sus necesidades nutricionales, incluyendo el período de gestación. Se mantuvo ciclo de luz-oscuridad de 12 h, humedad relativa de entre 40 % y 70 % y temperatura de 21 °C.
Al grupo RG se le realizó lavado vaginal con suero fisiológico, dándole seguimiento al ciclo estral mediante la observación de la muestra húmeda en el microscopio óptico. Una vez que se encontraban en estro, fueron colocadas en las cajas de los machos a razón de 2 hembras por macho, a las 19:00 horas. Al día siguiente en horas tempranas de la mañana entre 7:00 am y 7:30 am, se comprobó la cópula mediante lavado vaginal con suero fisiológico y se tomó la presencia de espermatozoides en la lámina como día 0 de la gestación.12 Ambos grupos fueron pesados en los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16 con una balanza para animales calibrada marca Gallenkamp.
Variables estudiadas:
Media de los pesos corporales en los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16.
Variación del peso corporal en los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16.
Variación del peso corporal en porciento en los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16.
Análisis Estadístico
Los valores correspondientes a los pesos corporales fueron recolectados en una tabla de Microsoft Excel y procesados en el sistema SPSS versión 22 para Windows. Los estadígrafos descriptivos Media, Desviación Estándar (DE) se calcularon para cada variable y grupo. En la comparación de las medias de cada variable entre los grupos se utilizó una prueba T para muestras independientes.
Se consideraron resultados significativos aquellos cuya p˂0,05.
La presente investigación forma parte de un proyecto que fue aprobado por el Consejo Científico y el Comité de Ética de la Investigación Institucional. Se cumplieron las normas éticas nacionales e internacionales establecidas para el tratamiento de animales de experimentación.13
El presente trabajo recibió la aprobación del Comité de Ética de la Investigación Institucional y del Consejo Científico, el mismo pertenece al proyecto de "Evaluación de desbalance glomérulo tubular con preponderancia tubular en un biomodelo de crecimiento intrauterino retardado.”
RESULTADOS
Comparación de las medias de los pesos corporales
En el día 0 no existe diferencia significativa entre los pesos (Tabla 1), dicha diferencia aparece el día 2 con una p ˂ 0,05. Mientras en los días 6, 9, 13 y 16 el valor de p ˂ 0,01. El hallazgo se interpreta como la expresión de la ganancia de peso en las RG.
Tabla 1 Media del peso corporal en ratas gestadas (RG) y ratas no gestadas (RNG) a los días 0; 2; 6; 9; 13 y 16
| Días | Media(g) | DE | X(g) | |
| Día 0 | RG RNG | 246 232 | ± 30,0 ± 35,1 | [216 |
| Día 2 | RG RNG | 263* 232 | ± 30,0 ± 28,9 | [233 |
| Día 6 | RG RNG | 266** 236 | ± 29,6 ± 27,3 | [236 |
| Día 9 | RG RNG | 282** 236 | ± 32,8 ± 30,1 | [249 |
| Día 13 | RG RNG | 287** 238 | ± 33,4 ± 39,4 | [254 |
| Día 16 | RG RNG | 312** 243 | ± 30,0 ± 43,2 | [282 |
**:p˂0,01 *:p˂0,05. DE: desviación estándar, X: rango de desviación
estándar del peso en gramos. T-Student.
Variación del peso corporal en gramos a los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16
El Figura 1 parte de una variación de 0 g de peso el día cero de la gestación. Al transcurrir los días, se obtiene una ganancia de peso tanto en el grupo de las ratas preñadas como en el grupo de las no preñadas; sin embargo, la velocidad de ganancia de peso es superior en las ratas preñadas, dicha velocidad es más marcada a partir del día 6.
Figura 1 Variación del peso corporal en ratas gestadas (RG) y ratas no gestadas (RNG) a los días 0, 2, 6, 9, 13 y 16
Al día 2, las RG habían aumentado como promedio 9,93 g, mientras las RNG habían aumentado un promedio de 2,18 g; sin embargo, la desviación estándar para las RNG es de ± 9,84 g; por lo que tenemos un aumento máximo promedio de peso de 12 g hacia el día 2 en las RNG. Por otra parte, la desviación estándar de las RG es de ± 6,03 g; lo indica un aumento mínimo promedio 3,90 g hacia el día 2 en las RG; entonces este día debido a la amplitud del rango de variaciones, aún es un momento muy temprano para definir preñez mediante el peso corporal. De ahí que intentar el diagnóstico mediante el peso en este momento resulta en una manipulación innecesaria del animal.
Al día 6 las RG habían aumentado como promedio 19,1 g; mientras las RNG habían aumentado un promedio de 7,42 g; sin embargo, la desviación estándar para las RNG es de ± 11,4 g; lo que indica un aumento máximo promedio de 18,8 g hacia el día 6 en las RNG. Por otra parte, la desviación estándar de las RG es de ± 10,2 g; lo que se corresponde con un aumento mínimo promedio de 8,90 g hacia el día 6 en las RG; debido a la amplitud del rango de variaciones continúa siendo una etapa muy temprana para definir la preñez mediante el peso corporal.
Al día 9 las RG aumentaron su peso, como promedio en 36,1 g; mientras que las RNG habían aumentado un promedio de 9,17 g; lo que marca una diferencia significativa para una p ˂ 0,01; la desviación estándar para las RNG es de ± 11,8 g; lo que se corresponde con un aumento máximo promedio de 21,0 g hacia el día 9 en las RNG. Por otra parte, la desviación estándar de las RG es de ± 8,62 g; lo que indica un aumento mínimo promedio de 27,5 g hacia el día 9 en las RG. A partir de los resultados se evidencia una separación importante en los márgenes de peso corporal entre grupos. Las hembras Wistar gestadas, por norma general aumentaron más de 27,5 g hacia el día 9.
Al día 13, las RG habían aumentado como promedio 44,3 g; mientras las RNG habían aumentado un promedio de 10,8 g; sin embargo, la desviación estándar para las RNG es de ± 16,2 g; lo que se corresponde con un aumento máximo promedio de 27 g hacia el día 13 en las RNG. Por otra parte, la desviación estándar de las RG es de ± 14,3 g; lo que coincide con un aumento mínimo promedio de 30 g hacia el día 13 en las RG. En este caso la diferencia en las variaciones promedio de pesos entre grupos es significativa para una p ˂ 0,01; además se observa una separación entre los márgenes de peso corporal en ambos grupos.
Al día 16, las RG habían aumentado como promedio 67,1 g; mientras las RNG aumentaron un promedio de 15,3 g; sin embargo, la desviación estándar para las RNG es de ± 15,4 g; lo que indica un aumento máximo promedio de 30,7 g hacia el día 16 en las RNG. Por otra parte, la desviación estándar de las RG es de ± 13,2 g; lo que se corresponde con un aumento mínimo promedio de 53,9 g hacia el día 16 en las RG.
Desde el día 9 hasta el 16, la diferencia entre los promedios de aumento de peso de ambos grupos fue significativa, para una p˂0,01; además de observarse la evidente separación entre los márgenes de peso corporal entre grupos.
Variación del peso en porciento
El análisis de la variación del peso en porciento (Tabla 2) no difiere mucho del análisis de la variación del peso en gramos. A partir del día 6 se aprecian diferencias significativas en los porcientos. En el día 9, las RG han aumentado su peso corporal en 15,0 % como promedio, mientras las RNG lo han aumentado en 4,40 %. Resultando en una diferencia significativa, para una p˂0,01.
Tabla 2: Media de la ganancia del peso (%) en ratas gestadas (RG) y ratas no gestadas (RNG) los días 0; 2; 6; 9; 13 y 16
| Grupo | Media (%) | DE | |
| Día 0 | RG RNG | 000 000 | ± 0,00 ± 0,00 |
| Día 2 | RG RNG | 4,01 1,27 | ± 2,56 ± 4,59 |
| Día 6 | RG RNG | 7,96 |
± 4,79 ± 5,80 |
| Día 9 | RG RNG | 15,0 |
± 4,62 ± 6,12 |
| Día 13 | RG RNG | 18,5 |
± 6,66 ± 7,53 |
| Día 16 | RG RNG | 28,0 |
± 7,57 ± 7,36 |
**:p˂0,01 *:p˂0,05
DISCUSIÓN
En un estudio realizado por SB Corvino et al.14 con ratas Wistar gestadas se obtienen las diferencias de pesos siguientes con respecto al día cero: día 7=18,5 g; día 14=43,7g; día 20=94,8 g; estos resultados son similares al del presente estudio para los días 6 y 13.
Un trabajo realizado por Stramek et al. con ratas de la línea Lister-Hooded muestra una ganancia de peso en las gestantes de 4 % al día 1,5 coincidiendo con los resultados del presente estudio para el día 2.
Para Stramek las ganancias de peso desde el día 1 son significativas5. Sin embargo, en la presente investigación, si tomamos como referencia la variación en porciento la significación aparece en el día 6 de la gestación. Los días 2 y 6 aparecen representados con una desviación estándar muy amplia en la variación del peso. Esto le resta precisión al diagnóstico de la preñez basado solo en el peso corporal desde el día 1 hasta el día 6. Al comparar los resultados con los de Stramek se debe tener en cuenta que se manejan líneas de ratas distintas.
En un estudio realizado por DeVon J. en ratones se obtiene que a partir del día 7,5 ocurre una ganancia marcada del peso corporal en los animales gestados. No obstante, el autor termina por concluir que el análisis del peso corporal para esta etapa y la observación del tapón vaginal por sí solos no son buenos indicadores para la confirmación de preñez.8 Este resultado guarda cierta relación con los del presente estudio, donde el peso corporal antes del día 6 es un dato de poca ayuda en el diagnóstico de la preñez, por lo que se puede decir que en etapas muy tempranas de la gestación el peso corporal no parece ser una herramienta útil.
Según Stramek et al. hacia el día 8 las ratas preñadas habían aumentado su peso en 15 %;5 el mismo resultado se obtuvo para el día 9 del presente estudio. En ambos casos la diferencia de peso es significativa.
En una investigación de Heyne et al. con 275 ratones C57BL6/6J es analizada la ganancia de peso entre los días 7,75 y 10, obteniéndose que 100 % de los animales preñados habían ganado más de 1,75 g y solo el 10,5 % de los no preñados (falsos positivos) superaba esta cifra, pudiendo ser demostrada la validez del método en este caso.6
Los resultados expuestos en esta investigación indican que la validez del método de la ganancia del peso corporal es efectivo desde el día 9, ya que a partir de ese momento es apreciable la diferencia entre los pesos mínimos de las ratas gestadas y los máximos de las no gestadas. No se debe descartar la posibilidad de que el método sea aplicable a los días 7 y 8, para lo cual sería útil realizar otras investigaciones con un mayor número de animales.
Limitaciones
Se consideran limitaciones del estudio que la muestra no es amplia, por lo que es recomendable la realización de estudios similares, con el fin de afianzar los resultados obtenidos.
