INTRODUCCIÓN
La industria minero-metalúrgica constituye una de las principales fuentes de contaminación ambiental por metales pesados. Estos elementos no pueden ser degradados ni biológica ni químicamente (Ali, Khan e Ilahi 2019). Una vez introducidos a los ecosistemas pueden incorporarse a las cadenas de alimentación y aumentar su toxicidad, debido al incremento de su concentración de un nivel trófico a otro, fenómeno denominado biomagnificación (Bazan y Galizia 2018).
Algunos iones metálicos, como el níquel y el cobalto, son esenciales para la célula a concentraciones trazas, sin embargo, a concentraciones elevadas pueden resultar tóxicos y afectan la viabilidad de los organismos (Argudín, Hoefer y Butaye 2019). Solo los microorganismos resistentes a metales pueden sobrevivir en presencia de elevadas concentraciones de estos compuestos, porque muestran mecanismos moleculares como la captura de iones por la célula, sistemas de expulsión de los metales y transformaciones mediadas por enzimas, que les permiten contrarrestar sus efectos tóxicos (Igiri et al. 2018).
El surgimiento y evolución de especies microbianas resistentes a metales ocurre como consecuencia de su adaptación a ambientes con elevadas concentraciones de estos elementos, tanto de origen antrópico como natural. Entre ellos se encuentran los suelos ultramáficos (serpentina), que poseen elevadas concentraciones de metales como níquel, cobalto, cromo y son deficientes en nutrientes esenciales (Schedlbauer 2015).
Estos suelos son fuente potencial de microorganismos resistentes a metales y productores de metabolitos con actividad biológica, con potencialidades para ser aplicados en el diseño de tecnologías para el saneamiento ambiental (Govin, Coto y Marrero 2015). Además, constituyen ecosistemas ideales para el estudio de la genética de adaptación al hábitat y evolución de nuevas ecovariedades microbianas (Díaz 2013).
Los microorganismos resistentes a metales o sus determinantes genéticos pueden ser utilizados en la bioextracción de metales, en la restauración de ambientes contaminados con metales y como bioindicadores de la contaminación por metales pesados (Marzan et al. 2017). Esta temática es de importancia para Cuba debido a que la industria niquelífera constituye uno de los principales renglones de la economía cubana.
La región minera de Moa (Holguín) contiene los mayores y más antiguos depósitos de serpentina de la isla (Reeves et al. 1999), los cuales se encuentran entre las principales reservas de níquel y cobalto del mundo (Valcarce y Rojas 2017). La industria minero-metalúrgica que se desarrolla en esta zona genera residuos contaminantes, que se acumulan diariamente ocasionando un severo impacto ambiental. Los escombros lateríticos son residuales mineros con valores de níquel inferiores al 0,9 % y desde el punto de vista industrial constituyen las lateritas fuera de balance; por lo que no pueden ser procesados por tecnologías convencionales (Marrero, Coto y Schippers 2016).
Se estima que existe más de noventa millones de toneladas de escombros almacenados en Moa (Palacios y García 2014), estos ecosistemas con altas concentraciones de metales pesados constituyen un ambiente ideal para el aislamiento de bacterias resistentes. El presente estudio tuvo como objetivo caracterizar bacterias resistentes a metales pesados aisladas de escombros lateríticos de Moa.
MATERIAL Y MÉTODO
Escombro laterítico
Se empleó el escombro laterítico de Camarioca Norte Zona 12 (E- Zona 12). La composición química de este material se presenta en la Tabla 1.
Aislamiento de bacterias resistentes a níquel de escombros lateríticos
Para el aislamiento de bacterias resistentes a níquel se pesó 1 g (2,5 mm de tamaño de partícula) del escombro laterítico y se adicionó a erlenmeyers que contenían 100 mL de caldo Luria Bertani (LB), suplementados con 5,0 mmol.L-1 de Ni (II). Los erlenmeyers se incubaron durante 48 h a 150 r.min-1 a 28°C. A partir de estos cultivos, se inocularon 100 µL en placas Petri con medio LB sólido suplementadas con 5,0 mmol.L-1 de Ni (II). Las placas se incubaron durante 24 h a 30 °C. Una vez que se observó el crecimiento se realizó la depuración de los cultivos.
Identificación de los aislados bacterianos
Para la identificación de los dos aislados se consideraron los criterios del Manual de Bergey (Logan y De Vos 2007). Se tuvieron en cuenta las características micromorfológicas, tintoriales y culturales. Esta información se complementó con las pruebas bioquímicas: citocromo oxidasa, catalasa, reducción de nitrato, hidrólisis del almidón y gelatina; dichas pruebas se realizaron siguiendo las indicaciones de Harrigan y McCance (1968). Igualmente, se determinaron los patrones de asimilación de diferentes azúcares a través del empleo de la galería de identificación API 50CHB.
Resistencia a metales pesados
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) a metales pesados en medio mínimo Tris sólido
La concentración mínima inhibitoria a Ni (II), Co (II), Cr (VI) y Al (III) se determinó en el medio mínimo Tris (MMT), siguiendo la metodología aplicada por Mergeay y otros colaboradores (1985). Las placas se incubaron a 28 °C y el crecimiento se siguió diariamente durante siete días.
Curva dosis-respuesta a metales pesados en medio mínimo
A partir de un inóculo estandarizado (ajustando al tubo 0,5 de la escala de McFarland) de cada aislado se inocularon tubos que contenían MMT estéril y concentraciones crecientes de los metales pesados: Ni(II), Co (II), Cr (VI) y Al (III). Los cultivos se incubaron a 30 °C, 150 r.min-1, durante 18 h y se determinó el crecimiento mediante la absorbancia a una λ=600 nm. La experiencia se realizó por triplicado.
Determinación del mecanismo de resistencia a níquel (inducido/constitutivo)
El mecanismo de resistencia a níquel se determinó siguiendo la metodología aplicada por Marrero y demás investigadores (2007). Se prepararon dos precultivos de 5 mL de MMT líquido para cada aislado; a uno de los dos se le adicionó níquel (concentración final de 0,5 mmol.L-1). Los precultivos se incubaron en agitación en zaranda orbital a 30 °C y 150 r.min-1 durante 18 h.
Las células provenientes del precultivo en presencia del metal se consideraron como “inducidas” y las cultivadas en ausencia del metal como “no inducidas”. Los dos precultivos se inocularon en erlenmeyers (250 mL) con 100 mL de MMT suplementado con Ni (II) (5 mmol.L-1). Se tomaron muestras a las 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 24 h, 26 h, 30 h y 35 h, a las que se determinó el crecimiento mediante la absorbancia a una λ=600 nm. La experiencia se realizó por triplicado.
Evaluación de la resistencia a antibióticos
La resistencia a antibióticos se determinó mediante el método de difusión en agar (Bauer et al. 1966). Se evaluaron los antibióticos: Ampicilina (10 μg), Co-Trimoxazol (25 μg), Azitromicina (15 μg), Polimixina (300 IU), Ciprofloxacina (5 μg), Kanamicina (30 μg), Penicillina (10 IU), Cefoxitina (30 μg), Amikacina (30 μg), Meropenem (10 μg), Cloranfenicol (30 μg), Gentamicina (120 μg), Piperacilina (30 μg) y Tetraciclina (30 μg).
Análisis biométricos
La comparación de las medias, de los valores de absorbancia del crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de metales (curva dosis-respuesta), se determinó mediante un análisis de varianza de clasificación simple seguido de una prueba de Tukey de comparación múltiple de medias. Previamente se verificó el cumplimiento de las premisas de normalidad y homogeneidad de varianzas, con el empleo de las pruebas de Shapiro Wilks y Levene, respectivamente.
Las comparaciones entre el crecimiento de los cultivos inducidos y no inducidos en presencia del metal se realizó mediante una prueba t de Student (p<0,05). Todos los análisis se realizaron con el empleo del programa STATISTICA versión 8.0 (StatSoft 2007).
RESULTADOS
Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a Ni (II) a partir del escombro laterítico
En las placas Petri con medio LB sólido suplementado con níquel (5,0 mmol.L-1) se aislaron dos bacterias que se denotaron EL-1 y EL-2 (EL: escombro laterítico). Los dos aislados mostraron una morfología bacilar, Gram positivos y forman endospora (posición subterminal). Por estas características micromorfológicas y tintoriales fueron ubicados dentro de la clase Bacilli. Los dos aislados bacterianos mostraron una respuesta negativa a la prueba citocromo oxidasa, en cambio fueron catalasa positiva y redujeron nitrato.
El API 50CHB permitió determinar el patrón de asimilación de diferentes azúcares. Los aislados asimilaron nueve azúcares como fuente de carbono: D- glucosa, D-fructosa, arbutina, salicina, esculina, D-maltosa, D- trealosa, almidón y glicógeno; mientras que el aislado EL-2, además, asimiló la D- manosa y N-acetyl glucosamina. Estos resultados indican que los dos aislados constituyen cepas diferentes. Teniendo en cuenta las indicaciones del Manual de Bergey las dos bacterias fueron ubicadas en el género Bacillus (Logan y De Vos 2007).
Resistencia a Ni (II), Co (II), Cr (VI) y Al (III)
La Tabla 2 muestra los valores de CMI obtenidos al enfrentar las cepas en estudio a concentraciones crecientes de Co(II), Ni(II), Cr(VI) y Al(II) en medio mínimo Tris sólido. Las dos cepas crecieron en concentraciones iguales o superiores de los 0,5 mmol.L-1 de todos los metales evaluados.
Los mayores niveles de resistencia se observaron en presencia de níquel (25 mmol.L-1). El resto de los metales ejercieron un mayor efecto negativo en el crecimiento bacteriano. Las dos cepas mostraron un comportamiento similar en cuanto a la resistencia: Ni (II)> Co (II)> Al (III)> Cr (VI). La cepa EL-2 mostró mayor resistencia a los metales Co (II), Cr (VI) y Al (III) con respecto a la cepa EL-1. Estos resultados indican que las dos cepas son multirresistentes a metales.
En el medio líquido las dos cepas fueron resistentes a los cuatro metales (curva dosis-respuesta). En este medio, la toxicidad de los iones metálicos fue mayor a la que se observó en el medio sólido. La cepa Bacillus sp. EL-2 reveló mayores valores de absorbancia con respecto a la cepa Bacillus sp. EL-1 en presencia de los diferentes metales. Las dos cepas crecieron hasta 10 mmol.L-1 de Ni (II) (Figura 1A). Para el resto de los metales: cobalto (Figura 1B), cromo (Figura 1C) y aluminio (Figura 1D) la cepa EL-1 manifestó crecimiento hasta 2 mmol.L-1; 0,2 mmol.L-1 y 1 mmol.L-1 de estos metales en ese orden; mientras que para la cepa EL-2 fue 1,25 mmol.L-1; 0,15 mmol.L-1 y 0,75 mmol.L-1, respectivamente.
Mecanismo de resistencia a Ni (II)
En la cepa Bacillus sp. EL-1 la fase de adaptación de los cultivos no inducidos fue de aproximadamente ocho horas, resultando cuatro veces mayor a la duración de la fase de adaptación, de los cultivos inducidos correspondientes (Figura 2A). Se observaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia del cultivo inducido y las del no inducido a partir de las 4 h de incubación y hasta aproximadamente las 24 h. Estos resultados indican que la cepa EL-1 exhibe un mecanismo inducido de resistencia a Ni (II), es decir, en presencia del metal se induce la expresión de la maquinaria enzimática responsable de este fenómeno.
En el crecimiento de los cultivos (células inducidas y no inducidas) de la cepa Bacillus sp. EL-2 no se observaron diferencias significativas y el tiempo de adaptación fue aproximadamente igual en ambos casos: 2 h (Figura 2B). Estos resultados indican que la cepa EL-2 presenta un mecanismo de resistencia constitutivo.
Resistencia a antibióticos
La Tabla 3 exhibe los resultados de la susceptibilidad de las cepas frente a antibióticos que se evaluaron. Las dos cepas mostraron un predominio de la susceptibilidad a estos agentes antimicrobianos. Las dos cepas fueron sensibles a nueve antibióticos: Meropenem, Azitromicina, Polimixina, Ciprofloxacina, Kanamicina, Gentamicina, Amikacina, Cloranfenicol, Piperacilina, y Tetraciclina; mientras que mostraron resistencia a todos los antibióticos de la familia de los β- lactámicos que se evaluaron.
DISCUSIÓN
Las regiones mineras se reconocen como uno de los ambientes más atractivos para el aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados (Adekanmbi et al. 2019). Se consideran ecosistemas extremos por sus características químicas y constituyen un sistema ideal para realizar estudios genéticos de la adaptación al hábitat y evolución de nuevas ecovariedades microbianas (Díaz 2013). El género Bacillus se informa como uno presente en los ambientes mineros (Yik et al. 2018).
La resistencia bacteriana a metales pesados, sus mecanismos y determinantes genéticos, han recibido especial atención debido a que estos microorganismos resistentes tienen una función principal en la restauración de diferentes ecosistemas contaminados (Nwagwu et al. 2017). Los determinantes genéticos de resistencia a metales pesados pueden ser aplicados en procesos como: 1) la biorremediación de ambientes contaminados con metales; 2) la bioextracción de metales, directamente desde los minerales o por recobrado de metales desde efluentes de procesos industriales y 3) como biosensores para el monitoreo ambiental (Farooq et al. 2010).
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la menor concentración de un agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento (Madigan, Martinko y Parker 2019). Los altos niveles de resistencia a níquel de los aislados se deben, fundamentalmente, al método selectivo de aislamiento. Además, son el reflejo de la biodisponibilidad que tiene este metal en el mineral y su toxicidad. En el caso del cobalto fue uno de los metales que más afectó el crecimiento microbiano en este estudio. Esto se debe principalmente a su efecto genotóxico, que provoca daños directos en el ADN e inhibe sus mecanismos de reparación, al mismo tiempo induce estrés oxidativo (Bresson et al. 2013), de ahí que son escasos los informes de bacterias resistentes a cobalto.
En el caso del aluminio, su biodisponibilidad en el suelo y agua es baja debido a que se adsorbe a las superficies minerales, su asociación con materia orgánica e insolubilidad de los complejos hidróxidos se forman cuando el pH es cerca de la neutralidad (Garcidueñas y Cervantes 1996). Esto explica que a pesar de que la concentración de aluminio presente en el mineral sea mayor que el resto de los metales evaluados, su biodisponibilidad es menor.
El cromo se encuentra en las fases cristalinas y residual (Hernández et al. 2009) por lo que la biodisponibilidad de este es menor, con respecto a los metales Ni (II) y Co (II). Igualmente, el cromato es altamente tóxico y provoca daños oxidativos en la célula (Barzanti et al. 2007). De ahí que los aislados mostraron valores de CMI de este ión de 0,5 y 1 mmol.L-1.
La multirresistencia a metales pesados de la microbiota autóctona de suelos de serpentina se informó por Abou-Shanab, Van Berkum y Angle (2007) en un ecosistema en Estados Unidos. Los aislados mostraron resistencia a Ni (15 mmol.L-1) y a Co (10 mmol.L-1), atribuyendo estos resultados de resistencia a los altos contenidos del metal en el suelo del cual fueron aisladas. En Cuba de la zona Yagrumaje Norte, Moa, Holguín se aislaron cepas de Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes y Ochrobactrum antropii que mostraron resistencia a Ni (II) y Co (II) (Govin, Coto y Marrero 2015).
La biodisponibilidad de los cationes metálicos se incrementa en medio acuoso, por esta razón su toxicidad es mayor con respecto al medio sólido. Esto explica los valores inferiores de resistencia bacteriana a los metales evaluados en el medio líquido, con respecto al medio sólido. Estas diferencias fueron informadas también por Marrero (2008) en la cepa Serratia marcescens C-1 aislada del yacimiento laterítico Punta Gorda, Moa, Holguín. Esta cepa resistió 20 mmol.L-1 de níquel en medio mínimo Tris sólido, mientras que en el medio líquido la cepa mostraba crecimiento hasta 8 mmol.L-1 del metal.
También Díaz (2013) caracterizó una colección bacteriana compuesta por siete cepas de Serratia marcescens aisladas del yacimiento laterítico Punta Gorda, Holguín, las que presentaron valores de CMI a níquel que oscilaron entre 15 mmol.L-1 y 25 mmol.L-1 en el medio mínimo Tris sólido, mientras que en el medio líquido resistían de 3,5 mmol.L-1 a 7 mmol.L-1 de níquel.
La resistencia bacteriana a metales puede estar determinada por mecanismos de resistencia expresados constitutivamente o inducidos por la presencia del metal (Nies 2000). Los mecanismos inducibles de resistencia a metales han evolucionado como consecuencia de la adaptación de las células al reto que representa la presencia de estas especies químicas tóxicas en su hábitat natural (Banjerdkij, Vattanaviboon y Mongkolsuk 2003). Las cepas Bacillus sp. EL-1 y Bacillus sp. EL-2 muestran mecanismos diferentes de resistencia a Ni.
La mayoría de los mecanismos involucrados en la resistencia a metales que confieren elevados valores de resistencia frente a estas especies tóxicas son inducidos por la presencia del metal (Marrero 2008; Díaz 2013). Entre los ejemplos de microorganismos resistentes a Ni (II) que poseen un mecanismo constitutivo de resistencia se encuentra Arthrobacter sp. RM1/6. Esta cepa exhibe mecanismos constitutivos de resistencia a Ni(II) (20-25 mmol.L-1), Co(II) (2-5 mmol.L-1), Zn(II) (2 mmol.L-1) y Cr(III) (3-5 mmol.L-1) (Margesin y Shinner 1996).
El estudio de los mecanismos inducibles de resistencia a metales posibilitó el empleo de estos microorganismos como biosensores. La presencia de mecanismos inducibles de resistencia a Cd(II), Zn(II), Cu(II), Cr(III), Co(II), Ni(II), Tl(II), Pb(II) y Hg(I) en Cupriavidus metallidurans permitió la creación de biosensores a partir de células completas de este microorganismo. Estos fueron inducidos al entrar en contacto con suelos, residuos, minerales o cenizas con elevadas concentraciones de estos metales, en dependencia de su biodisponibilidad para la célula (Diels et al. 2009).
Mediante el empleo de técnicas de genética molecular, la región reguladora de diferentes sistemas inducibles de resistencia a metales se fusionó a los genes lux desarrollando sensores bacterianos que producen bioluminiscencia, en dependencia de la concentración del ion metálico. Entre ellos se incluyen los sistemas de resistencia a Hg(I), capaces de detectar concentraciones de hasta 0,5 mM de este metal, sensores para antimonito y arsenito, Zn(II), Cd(II) y Pb(II) (Nies 2003). Este tipo de sensores también podría ser utilizado en la medición de la genotoxicidad de los metales pesados en diferentes ecosistemas.
Estos resultados resaltan el valor práctico de estas bacterias por su posible aplicación como biosensores ambientales. También las hace interesantes para ser incluidas en estudios genéticos de la resistencia a metales pesados.
El estudio de los patrones de resistencia a antibióticos en bacterias aisladas de ecosistemas con altas concentraciones de metales pesados resulta un aspecto importante a evaluar. Los determinantes genéticos involucrados en la resistencia a metales pueden estar localizados físicamente en el mismo elemento genético (plásmido) donde están los genes que confieren resistencia a antibióticos (Pal et al. 2015; Azam et al. 2018).
En este caso, la presencia de metales puede constituir una presión selectiva permanente, recalcitrante y ampliamente distribuida con importancia clínica y medioambiental. Asimismo, contribuye potencialmente en el mantenimiento y dispersión de algunos de los factores que determinan la resistencia a antibióticos (Sidhu et al. 2015).
En este estudio las dos cepas fueron sensibles a la mayoría de los antibióticos evaluados. Estos resultados están en concordancia con el estudio realizado por Samanta y otros investigadores (2012), quienes aislaron bacterias pertenecientes al género Bacillus, resistentes a níquel, cobalto, cromo y cadmio, a los que les evaluaron la resistencia frente a once antibióticos (cloranfenicol, estreptomicina, tetraciclina, norfloxacina, rifampicina, kanamicina, meticilina, co-trimoxazol, neomicina, ampicilina y ácido nalidíxico). Estos aislados mostraron un predominio de la sensibilidad, aunque fueron resistentes a kanamicina, ampicilina y meticilina.
La resistencia a los betalactámicos de las dos cepas aisladas del escombro laterítico puede deberse a la presencia en el ecosistema de otros microorganismos con la capacidad de producir estos metabolitos. La presión ejercida por microorganismos productores de antibióticos podría conducir a la dispersión de genes de resistencia localizados en plásmidos y transposones, los cuales contienen no solo determinantes genéticos de resistencia a antibióticos, sino también otros marcadores de selección, como la resistencia a metales pesados (López, Torres-Caycedo y Prada-Quiroga 2015).
CONCLUSIONES
Los escombros lateríticos constituyen un ambiente adecuado para el aislamiento de bacterias resistentes a metales pesados. Las dos cepas de Bacillus sp. se caracterizan por resistir a Ni (II), Co (II), Cr (VI), Al (III), tanto en medio líquido como en medio sólido. Además, presentan mecanismos de resistencia a níquel diferentes lo que las hace atractivas para ser aplicadas en la biotecnología de los metales. El considerable predominio de la susceptibilidad a antibióticos entre las cepas aisladas de Moa constituye un elemento a favor en sus posibles aplicaciones biotecnológicas para ser empleadas en la biorremediación de ecosistemas contaminados con metales pesados.