ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio del potencial de obtención de metano en tres pastos vacunos pre-tratados con enzimas

Dr.C. Carlos M. Martínez Hernández^{I  *} 

Dr. Hans Oechsner^II 

Dra. Annett Reinhard^II 

Dr. Yaser García López^I 

MSc. Arnaldo Martínez Hernández^I 

^IUniversidad Central “Marta Abreu” de las Villas, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.

^IIUniversidad de Hohenheim, Landensanstalt fur Agrartechnik und Bioenergie, Stuttgart, Germany.

RESUMEN

En este trabajo se realizó un estudio del efecto de pre-tratamiento con la enzima (ZY maXX XL 200) a tres diferentes substratos agrícolas (pasto mulato, pasto natural y variedad CT-115) y su influencia sobre el potencial de producción de metano. Se aplicaron dosis de 100 µl/jeringas por 350 mg de substratos en 30^-1 mL de inóculo vacuno. Los resultados de los substratos biodigestados fueron comparados con los obtenidos sin la adición de la enzima. En todos los casos, se lograron incrementos significativos en el rendimiento específico de metano. Los mejores resultados se obtuvieron con el pasto mulato (0,268 m³ CH₄/kg VS), seguidos del CT-115 (0,258 m³ CH₄/kg VS) y culminando con el pasto natural (0,254 m³ CH₄/kg VS); no obstante, se observaron incrementos significativos cuando se utilizó el pre-tratamiento con enzimas y un inóculo, comparados con las combinaciones que no fueron aplicados el pre-tratamiento. Por otra parte, se demostró que el pH evolucionó de una manera similar en las biomasas que utilizaron el pre-tratamiento con enzima y sin este.

Palabras clave: biomasa; residuos agrícolas; pre-tratamiento con enzimas

INTRODUCCIÓN

La mayoría de las fuentes bibliográficas reportan que las diferencias en la cinética, potencial y rendimiento del metano están en dependencia del tipo de sustrato utilizado (^{Forster et al., 2012}). Los métodos de pre tratamientos de los sustratos tienen como objeto el mejoramiento de las cualidades del proceso de digestión anaeróbica de estos, al alterar sus propiedades físicas, químicas y biológicas, mejorarando la disponibilidad de los componentes de los sustratos para incrementar el proceso de hidrólisis en la digestión anaerobia, el cual es la etapa limitante de los sustratos lignocelulósicos. Existen diferentes tipos de pre-tratamientos utilizados en los sustratos, los cuales se pueden clasificar en básicos y especiales. Dentro de los básicos están aquellos que tienen la finalidad en disminuir el tamaño de las partículas (trituración, molinado, tamizado). Dentro de los especiales se pueden mencionar (tratamientos térmicos, químicos, utilización de ultrasonido, radiación por microondas y los biológicos (utilización de enzimas, hongos y bacterias).

Sin embargo, estos muestran ciertas particularidades, tales como: incremento de los costos de manipulación, aumento de los requisitos legislativos para la estabilización y la remoción de posibles patógenos dañinos, tendencia al manejo de menores límites de nitrógeno, lo cual permite el manejo de la edad de estos sustratos, y el crecimiento de la biodegradabilidad de sustratos activados (^{Zhong et al., 2011}). No obstante, se hace necesario un análisis de los pre- tratamientos a utilizar en dependencia del tipo, actuación y costos.

Pre- tratamientos biológicos: el objetivo de éstos es preparar a los sustratos para la degradación enzimática; no obstante, el mejor método y condición de pre- tratamiento depende en gran medida del tipo de sustrato a usar. Entre los microorganismos más utilizados para degradar sustratos orgánicos se encuentran varios tipos de hongos, tales como: carmelita, blanco y suaves putrefactos, además de algunos tipos de bacterias ^{Kurakake et al. (2007)}. ^{Taherzadeh y Karimi (2008)}, estudiaron el efecto de pre-tratamientos biológicos en papel de oficina con dos cadenas de bacterias (Sphingomonas paucimobiles y Baccilus circulans), obteniendo mejoras en la hidrólisis enzimática, así como un 94% de recuperación del azúcar. Dependiendo del tipo de sustrato a pre- tratar (residuos de casas, aguas residuales, residuos de destilería, etc.), la hidrólisis enzimática puede realizarse mediante diferentes tipos de hongos o combinaciones de estos (Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, etc). ^{Taniguchi et al. (2005)}, evaluaron el efecto de varios pre- tratamientos biológicos en la paja de arroz usando 4 hongos blancos putrefactos (Phanerochaete chrysospurium, Tramete versicolor, Ceriporiopsis subvermispora y Pleurotus ostreatus). El pre- tratamiento con Pleurotus ostreatus resultó en una degradación selectiva de la lignina y un incremento de la susceptibilidad de la paja de arroz a ser hidrolizada enzimáticamente. También, en la fase de fermentación sólida de la cáscara de naranja con cadenas de hongos del tipo Sporotrichum, Aspergillus, Fusarium y Penicillum, se mejoró la capacidad de alimentación de constituyentes y se redujo el nivel de sustancias antimicrobianas. En un trabajo similar, realizado por ^{Taherzadeh y Karimi (2008)}, fueron usados cultivos de hongo blanco-suaves para descontaminar las aguas residuales del molinado de olivas, mejorando el proceso de digestión anaerobia. ^{Vintiloiu et al. (2009)}, investigaron la influencia de la temperatura y el pH de varias enzimas comerciales sobre la degradación de mazorcas y paja de maíz. Según esos autores, los mejores efectos se obtuvieron a valores de temperatura de 50 ºC y las mejores potencialidades de hidrólisis a valores de pH entre 4 y 6. Sin embargo, como la metanogénesis del proceso anaerobio tiene lugar a valores entre 6 y 8, los autores concluyeron que habría que buscar una enzima que mantenga una adecuada actividad en estos rangos de pH.

El bajo requerimiento energético, el no uso de compuestos químicos y la apacible condición ambiental son las principales ventajas de los pre-tratamientos biológicos. Sin embargo, a veces la eficiencia de estos pre-tratamientos es baja. Por tal motivo, los pre- tratamientos biológicos comúnmente requieren de un pre- tratamiento previo mediante la aplicación de métodos físicos, químicos o termo-químicos.

^{Martínez et al. (2015)}, publicaron un trabajo utilizando un pre tratamiento termo-químico en algunas de las biomasas que se valoran en esta investigación. Por lo que el presente trabajo constituye una continuación de la investigación en la que se aplican pre- tratamientos biológicos para aplicar la digestión anaerobia de residuos agrícolas y de cantina, los cuales se han soportado en investigaciones de ^{Martinez et al. (2015)}; ^{Martínez y García (2016)}; así como en otros trabajos anteriores (^{Martinez et al., 2014}).

Del análisis de estas fuentes bibliográficas se puede apreciar que la aplicación de un pre- tratamiento con enzimas a residuos orgánicos de tipo lignocelulósicos, resultaría muy adecuado para favorecer la biodegradabilidad y la producción de metano. Por tanto, el objetivo de esta investigación consiste en aplicar un pre- tratamiento con enzimas a diferentes tipos de biomasas agrícolas, estudiando su efecto sobre la producción de metano.

MÉTODOS

Este trabajo fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas, pero el material de investigación (Liquid cellulase enzymatic preparation, ZY maXX XL 200) fue donado por la Empresa BIOPRACT GmbH, a través de investigadores de la Universidad de Hohenheim, Alemania. El experimento fue ejecutado durante el período comprendido desde septiembre 2017 hasta noviembre 2018. Para su desarrollo se consultaron diferentes normas vigentes para este tipo de investigación, según se indica a continuación.

Los sustratos se caracterizaron de acuerdo con la norma ^{VDI (2006)} y siguiendo la caracterización y clasificación general de sustratos, se pudo estimar las posibilidades de fermentabilidad de los materiales orgánicos. En este trabajo fueron estudiados tres residuos agrícolas con alto contenido de compuestos lignocelulósicos: pasto natural, pasto variedad mulato y pasto variedad CT-115. Las muestras fueron recolectadas considerando sus raíces, tallos, hojas y frutos. Estos residuos fueron secados y fraccionados en partículas de 1 mm de tamaño, tomando muestras para realizar las investigaciones a escala de laboratorio en Alemania y a escala de campo en Cuba. Las investigaciones en Alemania fueron ejecutadas entre los meses de septiembre y noviembre 2017, se utilizó un tratamiento con enzimas y se investigó adicionando un inóculo vacuno. En Cuba fueron replicadas estas investigaciones experimentales a escala de campo. A las muestras experimentales se les aplicó un pre-tratamiento con enzimas, donde fue añadida la enzima ZY maXX XL 200 en dosis de 100 µl/jeringas por 350 mg de sustrato a valorar. Los sustratos inoculados con la enzima se dejaron reposar durante 4 horas; posteriormente, se le añadió el inóculo (30 mL del efluente porcino de un biodigestor anaerobio). A continuación, los sustratos pre-tratados, más el inóculo adicionado, fueron introducidos en jeringas experimentales de 100 mL de capacidad. El experimento tuvo una duración de 35 días, para observar el comportamiento de la digestión anaerobia durante este ciclo. En Alemania se utilizó un inóculo vacuno; mientras, en Cuba se utilizó un inóculo porcino procedente de biodigestores en producción. En ambos casos, en las jeringas experimentales se colocó un aditamento denominado Hohenheim Bench Test (HBT), el cual consiste en un dispositivo capaz de soportar simultáneamente 149 jeringas experimentales, colocadas horizontalmente y rotando durante toda la fase de investigación. Este dispositivo fue ubicado dentro de una incubadora a una temperatura constante de 35 ^oC. Cada variante experimental fue evaluada a razón de tres réplicas por cada sustrato, así como una réplica en contenedores plásticos (pomo plástico), con el objeto de investigar la evolución del pH y la producción de metano en el proceso de digestión anaerobia en condiciones de campo. Fueron objeto de estudio los siguientes parámetros:

• Contenido en humedad y materia, seca según la norma ^{NC 74-22:85 (1985)};

• Contenido de cenizas, de acuerdo con la norma ^{NC 74-30: 85 (1985)};

• Determinación de la relación carbono/nitrógeno (C/N);

• Evolución del pH en la biodigestión;

• Evaluación del rendimiento específico de producción de metano y biogás.

A partir de los datos de entrada, mediante el uso softwares elaborados para estos fines (Gärtest nach VDI 4630) y siguiendo la norma ^{VDI (2006)}, se procedió a calcular los siguientes parámetros:

• Tasa de biodegradabilidad;

• Potencial máximo de obtención de metano y biogás (L/kg SV).

En la Tabla 1 se muestra las condiciones de ensayo en cada biomasa objeto de investigación.

TABLA 1 Condiciones de ensayo por biomasas evaluadas anterior al proceso de biodigestión en jeringas experimentales 

(Sustrato)	Enzima utilizada	Dosis aplicada	Tiempo de retención hidráulica (HRT= min)
Pasto mulato	ZY maXX XL 200	100 µl/jeringas por 350 mg de sustrato en 30^-1 mL Inoculo	120
Pasto natural	ZY maXX XL 200	100 µl/jeringas por 350 mg de sustrato en 30^-1 mL Inoculo	120
CT-115	ZY maXX XL 200	100 µl/jeringas por 350 mg de sustrato en 30^-1 mL Inoculo	120
Inóculo (procedente de biodigestores que utilizan excreta vacuna o porcina)	Sin tratamiento con enzimas

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico STATISTICA, STASOFT, 8,0. Se realizó un análisis ANOVA, One way y una prueba de Tukey HSD en la variable rendimiento específico de metano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 1 se observa la evolución del rendimiento específico de producción de metano en todos los sustratos evaluados con la adición de enzimas y sin esta. El mayor valor se obtuvo con el sustrato pasto mulato (0,268±0,011 m³ CH₄/kg VS), seguidos del pasto variedad CT-115 (0,258±0,018 m³ CH₄/kg VS) y culminando con el pasto natural (0,254±0,023 m³ CH₄/kg VS). Se observaron los incrementos superiores en todos los sustratos donde se aplicó el pre-tratamiento con enzimas con respectos a las combinaciones donde no fue aplicado el referido pre-tratamiento; no obstante, los valores obtenidos están por debajo a los obtenidos por ^{Martinez et al. (2014)}. Este resultado pudiera estar dado por el menor potencial de metano de estas biomasas; además, de por la utilización de raíces, hojas, tallos y frutos mezclados de estas biomasas agrícolas, las cuales poseen mayor cantidad de fibra (celulosa y hemicelulosa) comparado con los estudios efectuados anteriormente de otras biomasas en solitario.

FIGURA 1 Valores del rendimiento específico de metano promedio de las biomasas objeto de estudio utilizando inóculo vacuno con pre-tratamiento con enzimas a escala de laboratorio en Alemania. 

En la Tabla 2, se presentan los resultados obtenidos con los sustratos valorados con y sin el tratamiento con enzimas.

TABLA 2 Rendimiento específico de biogás y metano. Biomasas evaluadas con y sin pre-tratamiento con enzimas. Los resultados se muestran como promedio ± desviación estándar 

Sustratos	Contenido de biogás [ml]	Contenido de metano [ml]	Contenido de metano (% del volumen)	Rendimiento específico de biogás (m^3/kg VS)	Rendimiento específico de metano (m^3 CH4/kg VS)
Inóculo vacuno	29±4,3	20±2,8	70±1,0	0,018±0,003	0,013±0,002
Hay estándar (sustrato de referencia)	86±3,0	49±1,5	56±0,5	0,482±0,016	0,273±0,009
Pasto variedad CT-115, sin enzimas	114±3,6	64±1,0	56±1,5	0,416±0,014	0,234±0,004
Pasto variedad CT-115, con enzimas	126±7,0	71±4,7	56±1,0	0,461±0,026	0,258±0,018
Pasto variedad mulato, sin enzimas	103±12,5	58±6,5	56±1,0	0,375±0,046	0,211±0,023
Pasto variedad mulato, con enzimas	134±5,8	74±2,5	55±1,1	0,485±0,020	0,268±0,011
Pasto natural, sin enzimas	105±5,2	60±2,0	57±0,5	0,379±0,018	0,217±0,008
Pasto natural, con enzimas	125±11,6	71±6,6	56±0,0	0,452±0,041	0,254±0,023

En la Tabla 2, se pudo apreciar que, de los sustratos evaluados: pasto variedad CT-115 (toda la planta), pasto mulato (solamente hojas) y pasto natural (toda la planta), la acción del complejo de enzimas potencia la producción de metano. Sin embargo, al replicar estos experimentos a nivel de campo en Cuba, los resultados no fueron satisfactorios. En el caso de los experimentos efectuados en Cuba, se utilizó un inóculo porcino, pero quizás el factor limitante de los bajos rendimientos obtenidos por las biomasas investigada fue el tamaño de las partículas, las cuales no quedaron suficientemente trituradas, debido al desperfecto en el molino utilizado, lo cual pudo afectar la interacción de la enzima respecto a las biomasas utilizadas.

Según ^{Brulé (2014)}, los experimentos en la etapa de hidrólisis enzimática muestran una baja eficiencia cuando son adicionadas enzimas a los sustratos agrícolas. El autor concluyó que la eficiencia de las enzimas puede ser favorecida por el bajo contenido de fibras recalcitrantes y la lignina, bajo pH y la temperatura. Además, refiere que, para lograr un efecto positivo de la adición de enzimas en la práctica productiva, los bioreactores anaerobios deben tener una alta carga orgánica (OLR), un bajo tiempo de residencia hidráulica (HRT) y los sustratos deben poseer una mezcla de cultivos energéticos. Por lo tanto, estos resultados están en contradicción con lo reportado por ^{Brulé et al. (2011)}. Los resultados de esta investigación indican un efecto positivo con la adición de la enzima ZY maXX XL 200 a los sustratos evaluados, y cuando se utiliza una densidad de inóculo apropiada. Se debe destacar la potencialidad que posee la enzima ZY maXX XL 200 para favorecer el proceso de hidrólisis, la cual es la etapa limitante en la digestión anaerobia de estos tipos de residuos; al mejorarse le la hidrólisis, indirectamente se mejora el tratamiento anaerobio de estos residuos y, por ende, la producción de biogás.

El costo de la enzima ZY maXX XL 200 es de $ 64,00 €/kg, y teniendo en cuenta las pequeñas cantidades de enzimas utilizadas en este experimento (100 µl/jeringas por cada 0,350 mg de sustrato evaluado o 0,01 L/3,5 kg), se puede inferir un gasto aproximado de € 192 por tonelada de sustrato tratado, demostrando la factibilidad económica de su utilización. Además, los valores específicos de obtención de metano alcanzarían valores desde un máximo de 0,047 CH₄/kg VS (pasto mulato) hasta un mínimo de 0,024 CH₄/kg VS (CT-115), incrementos comparando con los mismos sustratos sin pre-tratamientos.

En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos respecto a la evolución del pH.

FIGURA 2 Evolución del pH (pasto variedad CT-115, pasto variedad mulato y pasto natural), analizadas en condiciones de campo con pre-tratamientos con enzimas e inóculo porcino. 

Respecto a la evolución del pH, en la Figura 2 se pudo apreciar que los resultados obtenidos en las biomasas evaluadas, mostraron que todos los sustratos al terminar el ciclo de biodigestión anaerobia presentaron valores de pH por encima de 7. Por tanto, la enzima ZY maXX XL 200 permite mantener condiciones adecuadas para una buena actividad degradadora de los sustratos en los rangos de pH entre 6 y 8, lo cual concuerda con lo planteado por ^{Vintiloiu et al. (2009)}.

En la Tabla 3 se muestran un resumen de los valores promedios obtenidos en cada sustrato analizado para el rendimiento de biogás y metano, respectivamente a escala de laboratorio.

TABLA 3 Valores promedios obtenidos de rendimiento específico de biogás y metano 

(Sustrato)	l/kgFM (m^3/kg VS)	l/kgSV (m^3 CH4/kg VS)
	Rendimiento específico de biogás	Rendimiento específico de metano
(Pasto variedad Mulato)	(0,485±0,020 m^3/kg VS)	(0,268±0,01 m^3 CH4/kg VS)
(Pasto Natural)	(0,452±0,041 m^3/kg VS)	(0,254±0,023 m^3 CH4/kgVS)
Pasto variedad CT-115	(0,461±0,026 m^3/kg VS)	(0,258±0,018 m^3 CH4/kg VS)

Del análisis de la Tabla 3, se observó que los valores máximos del rendimiento específico de biogás se obtuvieron en el pasto variedad mulato (0,485 m³/kg VS); mientras, el mínimo valor se obtuvo con el pasto natural (0,452 m³/kg VS). Similarmente, los valores máximos de rendimiento específico de metano se observaron con el pasto variedad mulato (0,268 m³ CH₄/kg VS) y los valores mínimos obtenidos coincidieron con el pasto natural (0,254 m³ CH₄/kg VS). Éstos resultados alcanzados a nivel de laboratorio difieren a los obtenidos por ^{Martinez et al. (2014)}, los cuáles estudiaron otras biomasas valoradas sin la adición de enzimas a escala de laboratorio; así como a los obtenidos por ^{Martínez et al. (2015)}, donde utilizaron un pre-tratamiento químico-térmico para esos mismas sustratos.

En la Figura 3 se presenta los resultados del análisis estadístico de la variable rendimiento específico de metano (m³ CH₄/kg VS) en los tratamientos evaluados.

FIGURA 3 Tukey test en la variable rendimiento rendimiento específico de metano (m³ CH₄/kg VS) en los tratamientos evaluados. 

Del análisis de la figura 3, se pudo observar que los valores más altos del rendimiento rendimiento específico de metano (m³ CH₄/kg VS), se obtienen con los sustratos tratados con enzimas respecto al sustrato referencia (Hay estándar) presentando diferencias significativas con respecto a los sustratos no tratados con enzimas con la excepción del CT-115.

CONCLUSIONES

• En todos los casos, se lograron incrementos significativos en el rendimiento específico de metano cuando en los sustratos fue aplicado un pre-tratamiento con la enzima ZY maXX XL 200. Los mejores resultados tuvieron lugar con el pasto mulato (0,268 m³ CH₄/kg VS); seguidos por el pasto variedad CT-115 (0,258 m³ CH₄/kg VS) y culminando con el pasto natural (0,254 m³ CH₄/kg VS) obteniéndose incrementos significativos cuando se utilizó el pre-tratamiento con enzimas e inóculo vacuno Vs cuando este no fue utilizado.

• Los resultados alcanzados a nivel de campo en Cuba con las mismas biomasas evaluadas en Alemania utilizando inóculo porcino no fueron favorables; sin embargo, estos resultados no deben tomarse como conclusivos.

• El pre-tratamiento con la enzima ZY maXX XL 200 no afectó el valor crítico del pH en las biomasas pre-tratadas, tanto en el caso de la utilización de inóculo vacuno como de inóculo porcino.

AGRADECIMIENTOS

Al Proyecto nacional de CUBAENERGIA. Estudio de pre-tratamientos básicos y especiales para mejorar la producción y calidad del biogás. Código: 9917; A la Universidad de Hohenheim. Alemania.

REFERENCIAS

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Recibido: 15 de Febrero de 2018; Aprobado: 19 de Diciembre de 2019

^* Author for correspondence: Carlos M. Martínez Hernández, e-mail: [e-mail]