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INTRODUCCIÓN
Kalanchoe blossfeldiana Poelln. es una especie de planta de la familia Crassulaceae con alto valor ornamental. Presenta hojas carnosas (suculentas), de color verde brillante y con bordes crenados. Sus flores abarcan una amplia gama de colores, se presentan en inflorescencias que pueden tener hasta más de 100 flores y permanecer viables durante 7-8 semanas (Love, 1980; Morton, 1981; Izumikawa et al., 2007).
Por las características anteriores es una de las plantas ornamentales de interior más preferidas y comercializadas a nivel mundial. Es la especie más vendida después de las orquídeas en Europa y América. Durante las mayores subastas que se realizan en Holanda (FloraHolland), país de referencia en el comercio internacional de plantas ornamentales, cada año son vendidas grandes cantidades de esta planta. Los números de ventas pueden llegar hasta 100 millones de ejemplares con recaudaciones de hasta 69 millones de euros (Gümüş y Ellialtioğlu, 2018).
Dada la importancia de esta especie, son necesarios métodos para obtener grandes cantidades de plantas con los cuales satisfacer las demandas existentes en el mercado. En ese sentido, se han desarrollado trabajos sobre propagación de K. blossfeldiana tanto por la vía tradicional (Pérez et al., 2010; García et al., 2020) así como por biotecnología (Kordi et al., 2013; Kaviani et al., 2014; Nieves et al., 2016).
A pesar de que se encuentran numerosos trabajos sobre cultivo in vitro de K. blossfeldiana (Gümüş y Ellialtioğlu, 2018), no ha sido referido aún una metodología que describa en detalle el proceso de obtención de plantas, desde la fase inicial de establecimiento en el laboratorio hasta la aclimatización ex vitro. Teniendo como base lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue establecer un protocolo para la micropropagación de K. blossfeldiana a partir de segmentos nodales.
PROCEDIMIENTOS
I. Fase 0. Selección y preparación del material vegetal de partida
Materiales
Material vegetal: El material de partida para el establecimiento del cultivo in vitro debe ser tomado a partir de un banco de plantas madre previamente establecido, con condiciones fisiológicas y fitosanitarias adecuadas, sin síntomas de carencias nutricionales o presencia de organismos patógenos (Figura 1 A). Nota: Seleccionar segmentos de tallos de K. blossfeldiana con varios pares de hojas entre los cuales debe existir no menos de un centímetro de separación (Figura 1 B).
Otros materiales: recipientes limpios para la colecta del material vegetal.
Precauciones y medidas de seguridad
Tres días antes de la colecta del material vegetal para su traslado al laboratorio, debe retirarse el riego a las plantas madre.
Evitar el contacto directo de los segmentos de tallos con el suelo.
Emplear guantes.
Lavarse las manos al concluir el ensayo.
Figura 1. Material vegetal de partida para la propagación in vitro de Kalanchoe blossfeldiana Poelln. a partir de segmentos nodales. A: banco de plantas madre, B: segmento de tallo a ser seleccionado con una longitud de entrenudos ≥ 1.0 cm.
Procedimiento
II. Fase I. Establecimiento o iniciación del cultivo in vitro
Materiales
Material vegetal: segmentos de tallos de K. blossfeldiana con varios pares de hojas, con no menos de un centímetro de separación entre ellos.
Medio de cultivo: Sales MS (Murashige y Skoog, 1962) 4.3 g l-1, Vitaminas MS 10 ml l-1, sacarosa 30 g l-1, 6-Bencilaminopurina (6-BAP) 1.0 mg l-1, Ácido Naftalenacético (ANA) 0.5 mg l-1, agar 3.8 g l-1, pH 5.8.
Otros materiales
Agua corriente
Agua destilada estéril
Algodón
Detergente comercial
Hipoclorito de sodio (NaOCl)
Recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos)
Recipientes de cultivo
Vaso de precipitado de 500 o 1000 ml
Equipos e instrumental
Precauciones y medidas de seguridad
Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura.
Evitar el contacto de la piel y la inhalación de vapores de las soluciones de hipoclorito de sodio que pueden causar quemaduras e irritación, respectivamente.
Procedimiento
Seccionar los tallos con la ayuda de un bisturí por la mitad de cada entrenudo, a fin de individualizar cada nudo con un par de hojas. Una vez realizado este procedimiento la longitud del tallo por encima y por debajo del punto de inserción de las hojas en él deberá ser ≥ a 0.5 cm (Figura 2).
Figura 2. Segmento de tallo de Kalanchoe blossfeldiana Poelln. con dos pares de hojas, para ser desinfectado y utilizado como explante inicial en la fase de establecimiento del cultivo in vitro.
Lavar los explantes resultantes del procedimiento anterior con un algodón, detergente comercial y agua corriente. Debe frotarse la lámina foliar por el haz y el envés, el peciolo y el segmento de tallo por encima y por debajo del nudo. Nota: Todo lo anterior debe realizarse teniendo especial cuidado de no dañar y/o eliminar las yemas axilares en la base de cada hoja.
Enjuagar los explantes con agua destilada estéril una vez realizado el lavado y depositarlos en frascos estériles.
Añadir a los explantes contenidos en los frascos estériles una solución de NaOCl al 1% i.a (v/v) en agua destilada estéril. El volumen del líquido debe ser tres veces el volumen que ocupen los explantes dentro del frasco.
Mantener los frascos con los explantes y la solución de NaOCl en agitación constante en una zaranda giratoria por diez minutos a 90 rpm aproximadamente.
Eliminar la solución desinfectante por decantación dentro de la cabina de flujo laminar, una vez transcurrido ese tiempo.
Enjuagar tres veces con agua desionizada estéril.
Colocar los explantes en los recipientes para la manipulación del material vegetal (platos metálicos, placas Petri), y cortar con el bisturí los extremos superior e inferior del tallo dañados por el NaOCl.
Colocar los explantes en lo recipientes con el medio de cultivo (preferiblemente un explante por frasco de cultivo).
Colocar los recipientes en cámara de crecimiento a 27 ± 2 °C y luz solar.
Nota: Transcurridos 28 días del establecimiento in vitro, a partir de las yemas axilares de la base de cada hoja del explante se habrán desarrollado brotes de tallos con varios pares de hojas (Figura 3). A partir de estos brotes se iniciará la siguiente fase de multiplicación.
III Fase II. Multiplicación in vitro
Materiales
Material vegetal: Brotes in vitro de K. blossfeldiana.
Medio de cultivo: Sales MS 4.3 g l-1, Vitaminas MS 10 ml l-1, sacarosa 30 g l-1, 6-Bencilaminopurina (6-BAP) 1.0 mg l-1, Ácido Naftalenacético (ANA) 1.0 mg l-1, agar 3.8 g l-1, pH 5.8.
Otros materiales: recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos u otro).
Equipos e instrumental
Precauciones y medidas de seguridad
Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura. Evitar el contacto de la piel.
Procedimiento
Seccionar los brotes formados durante la fase de establecimiento (Figura 4 A) transversalmente en el punto medio de cada entrenudo, de manera que se obtengan varios segmentos de tallos con un solo par de hojas (Figura 4 B), de la misma manera que fue realizado para iniciar la limpieza y desinfección del material vegetal durante la fase de establecimiento.
Colocar los explantes en el medio de cultivo de multiplicación.
Colocar los recipientes en cámara de crecimiento a 27 ± 2 °C y luz solar.
Realizar al material vegetal multiplicado (Figura 4 C) subcultivos cada 28 días, y para ello individualizar los explantes (Figura 4 D).
Nota: se pueden realizar varios subcultivos de multiplicación según los intereses de los propagadores.
Figura 4. Esquema de la fase de multiplicación de Kalanchoe blossfeldiana Poelln. A: brotes formados en la fase de establecimiento in vitro, B: segmentos de tallo con dos pares de hojas para iniciar la fase de multiplicación, C: brotes in vitro con 28 días de cultivo en fase de multiplicación, D: brote in vitro proveniente de la fase de multiplicación, individualizado para el siguiente subcultivo de multiplicación.
IV Fase III. Enraizamiento in vitro
Materiales
Material vegetal: brotes in vitro de K. blossfeldiana procedentes de la fase de multiplicación.
Medio de cultivo: Sales MS 4.3 g l-1, Vitaminas MS 10 ml l-1, sacarosa 30 g l-1, agar 3.8 g l-1, pH 5.8.
Otros materiales: Recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos u otros).
Equipos e instrumental
Precauciones y medidas de seguridad
Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura. Evitar el contacto de la piel.
Procedimiento
Individualizar los brotes procedentes del medio de cultivo de multiplicación.
Colocar los explantes en medio de cultivo de enraizamiento.
Colocar los recipientes en cámara de crecimiento a 27 ± 2 °C y luz solar durante 28 días.
Transferir a condiciones ex vitro las plantas crecidas con un sistema radical bien desarrollado y de más de cuatro pares de hojas (Figura 5).
Figura 5. Planta de Kalanchoe blossfeldiana Poelln. enraizada a los 28 días de cultivo apta para su aclimatización.
Nota: el período desde la extracción de las plantas in vitro de los frascos de cultivo hasta la plantación en la fase de aclimatización, no debe ser superior a 48 horas. Inmediatamente después de efectuada la extracción de las plantas de los frascos de cultivo, deben ser ubicadas en bandejas con agua limpia. El agua debe cubrir las raíces para evitar la deshidratación
V Fase IV: Aclimatización
La aclimatización de plantas se realiza basado en lo propuesto por Moreno-Bermúdez et al. (2018).
Materiales
Material vegetal: plantas in vitro de K. blossfeldiana procedentes de la fase de enraizamiento.
Sustrato: materia orgánica (compost, humus de lombriz) y zeolita o arena con una proporción 80:20 (materia orgánica: zeolita o arena).
Otros materiales: Agua corriente, bandejas de polipropileno.
Equipos e instrumental
Precauciones y medidas de seguridad
El sustrato a utilizar debe estar libre de semillas de plantas de otras especies y de microorganismos dañinos como pueden ser nemátodos, bacterias y hongos patógenos para la planta. Se debe emplear guantes. Lavarse bien las manos al concluir el ensayo.
Procedimiento
Las plantas deben ser clasificadas de acuerdo con sus dimensiones para lograr uniformidad cuando se coloquen en la bandeja.
Llenar las bandejas con el sustrato.
Colocar las bandejas en casas de cultivo con regulación de la luz solar a un 80% a través de un cobertor plástico y malla oscura o sarán.
Regar el sustrato con agua corriente hasta que se encuentre bien humedecido.
Colocar las plantas en el sustrato y asegurarse de que el sistema radical quede completamente introducido.
Nota: el riego de las plantas recién plantadas, debe efectuarse una vez al día durante 10 minutos en el horario de la mañana hasta las 9:00 am. La duración de esta fase es de 60 días. Los porcentajes de supervivencia alcanzan el 97.5% (Figura 6).
CONCLUSIONES
A partir del protocolo desarrollado pueden ser obtenidos volúmenes considerables de plantas que permitan satisfacer las demandas en el mercado de la especie trabajada. A través de la metodología descrita se pueden obtener plantas homogéneas en cuanto a tamaño y características morfológicas, y con calidad fitosanitaria; aspectos que contribuyen al éxito de su comercialización.
