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Cuban Journal of Agricultural Science

Print version ISSN 0864-0408On-line version ISSN 2079-3480

Cuban J. Agric. Sci. vol.51 no.1 Mayabeque Jan.-Mar. 2017

 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Rizobios aislados de leguminosas forrajeras de un ecosistema ganadero árido de Holguín, Cuba. Tolerancia a estrés abiótico y producción de catalasa (Fase II)

 

Rhizobia isolated from forage legumes of an arid cattle rearing ecosystem in Holguín, Cuba. Tolerance to abiotic stress and catalase production (Phase II)

 

 

C. J. Bécquer1, Yaldreisy Galdo1, Analeidis Mirabal1, Maribel Quintana1 and Adelaida Puentes2

1Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, Estación Experimental Sancti Spíritus, Apdo. 2255, Z. P. 1, C. P. 60100, Sancti Spíritus, Cuba

2Universidad ¨José Martí Pérez¨, Sancti Spíritus, Cuba

 

 


RESUMEN

El objetivo de esta investigación fue evaluar la tolerancia a factores abióticos estresantes de 11 aislados de rizobios, procedentes de leguminosas forrajeras (Desmodium cannum, D. triflorum y Centrosema virginianum) localizadas en un ecosistema árido de Holguín, Cuba, y valorar cualitativamente la producción de catalasa de dichos aislados. Los diferentes niveles de temperatura, pH y NaCl fueron los factores estresantes evaluados. Se realizaron cultivos en medio levadura-manitol sólido y líquido, y se consideró como criterio evaluativo el crecimiento visible en el medio. Todos los aislados crecieron a 34 y 35 ºC, pero ninguno a 38 ºC ni a 40 ºC. Excepto dos aislados (C. virginianum y D. triflorum), el resto creció en pH 4, y nueve de ellos en pH 10. Todos los aislados crecieron en 0.4 % NaCl, pero solo uno (D. triflorum) creció en 1.2 %. No hubo crecimiento en 2.4 % NaCl. Todos los aislados reaccionaron positivamente ante el H2O2. Se concluye que hubo aislados tolerantes a diferentes factores abióticos estresantes, así como con producción de catalasa. Además, existieron aislados que, independientemente del macrosimbionte del que provenían y del grupo morfocultural al que se circunscribieron, presentaron tolerancia a diferentes factores abióticos, como la acidez y alcalinidad, las altas concentraciones de sal y el crecimiento a 35 ºC. Todo esto les confiere potencialidades  para su aplicación futura en la práctica agrícola en condiciones ambientales adversas. Se recomiendan ensayos de inoculación de gramíneas y leguminosas en condiciones ambientales estresantes para seleccionar los aislados con mayor efecto positivo en estos cultivos.

Palabras clave: leguminosas forrajeras, Bradyrhizobium, estrés abiótico, catalasa


ABSTRACT

The objective of this research was to evaluate the tolerance to stressing abiotic factors of 11 isolated rhizobia from forage legumes (Desmodium cannum, D. triflorum and Centrosema virginianum) located in an arid ecosystem in Holguín, Cuba, and to qualitatively assess the catalase production of this isolates. The different levels of temperature, pH and NaCl were the stressing factors evaluated. Cultures were performed in solid and liquid mannitol-yeast medium, and the visible growth in the medium was considered as an evaluative criterion. All isolates grew at 34 and 35 ºC, but none at 38 ºC or 40 ºC. Except two isolates (C. virginianum and D. triflorum), the rest grew at pH 4, and 9 of them at pH 10. All isolates grew in 0.4 % NaCl, but only one (D. triflorum) grew in 1.2 %. There was no growth in 2.4 % NaCl. All isolates reacted positively to H2O2. It was concluded that there were isolates tolerant to different stressing abiotic factors, as well as with catalase production. In addition, there were isolates that, independently of the macrosymbionts from which they originated and of the morpho-cultural group to which they were circumscribed, showed tolerance to different abiotic factors, such as acidity and alkalinity, high salt concentrations and growth at 35 ºC. All this gives them potential for future application in agricultural practice under adverse environmental conditions. Inoculation tests of grasses and legumes under stressing environmental conditions are recommended to select the isolates with the highest positive effect on these cultures.

Key words: forage legumes, Bradyrhizobium, abiotic stress, catalase


 

 

INTRODUCCIÓN

Las leguminosas tienen un inmenso valor, debido a su capacidad de elevar la fertilidad del suelo mediante la fijación del nitrógeno atmosférico a través de la relación simbiótica con los rizobios. Es conocida, desde hace más de una centuria, la capacidad de las leguminosas para utilizar el N2 del aire, a través de la eficiente relación simbiótica que se establece entre estas plantas y las bacterias fijadoras de nitrógeno. Sin embargo, la salinidad, la escasez de agua y las temperaturas estresantes resultan importantes amenazas para la simbiosis leguminosa-rizobio.

En la provincia de Holguín, al igual que en otras de Cuba, existen problemas que hacen que 45 % del área agrícola tenga suelos pocos productivos o muy pocos productivos, entre los que inciden la compactación, salinización, sequía, acidez y problemas de drenaje deficiente (Turruelles y Daley 2005). Según Oquendo et al. (2013), algunos factores limitantes como la salinidad, acidez, basicidad, profundidad del suelo, y otros de carácter climático y fisiográfico, provocan que este territorio posea características poco adecuadas para el fomento y la explotación de pastizales.

En Cuba, en los últimos años, además de las necesarias medidas para la conservación de suelos, reforestación y explotación juiciosa, se ha incrementado el uso de rizobios como biofertilizantes, debido a sus apreciables beneficios para las plantas y el suelo. Por ello, el estudio de rizobios adaptados a ecosistemas con características ambientes estresantes, debe conllevar, no solo al aporte de nuevos conocimientos acerca de su diversidad genética, sino también a la selección de cepas con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico en simbiosis con leguminosas de interés para la alimentación animal. Además de ser útil para la estimulación del crecimiento de plantas no pertenecientes a la familia de las leguminosas, que se deben cultivar en condiciones de estrés ambiental severo (Bécquer, 2002 y Zahran et al. 2012).

Mientras que las estrategias para mejorar la producción de leguminosas en ambientes salinos incluye la selección de genotipos vegetales tolerantes a condiciones de alta salinidad, la inoculación con cepas de rizobios tolerantes a la sal, pudiera constituir otro enfoque para mejorar la productividad de las leguminosas en simbiosis (Keneni et al., 2010). Yang et al. (2009) plantearon que las rizobacterias pueden producir catalasa para degradar la especies oxidativas del oxígeno (ROS), resultantes del estrés causado por la sequía, por lo que se deben desarrollar investigaciones dirigidas a utilizar esta y otras propiedades anti estrés de las bacterias en la agricultura.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la tolerancia a factores abióticos estresantes y la producción de catalasa de rizobios, que son microsimbiontes en leguminosas forrajeras naturalizadas de la provincia de Holguín, Cuba, para su futura utilización en la práctica agrícola en condiciones ambientales estresantes.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Los aislados se evaluaron en su habilidad para crecer en medio líquido levadura-manitol en diferentes temperaturas (35, 38 y 40 ºC), así como en diferentes valores de NaCl (0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1.2 y 2.4 %) y de pH (6; 5,5; 5; 4,5; 4;8; 8,5; 9 y 10) (Bécquer 2002), para comprobar su resistencia ante las variaciones de stress físico-químico. Para ello se sembraron los aislados en placas Petri que contenían el medio sólido levadura-manitol con las diferentes concentraciones de NaCl y pH. El criterio para la descripción de los resultados fue el crecimiento visible (+) o no crecimiento (-) en el medio (Drouin et al. 1996). Para los ensayos a diferentes temperaturas, se confeccionaron inóculos a partir de una asada de suspensiones con título de 108 cél./mL en tubos de ensayo (10.0 mL de cultivo) que se colocaron en una zaranda orbital a 200.0 rpm durante 20 días. El criterio para la descripción de los resultados fue el de crecimiento visible (+) o no crecimiento (-) de los aislados en el medio líquido con presencia de turbidez blanquecina (Drouin et al. 1996). Posteriormente se comprobó la pureza de las suspensiones mediante siembra de 100 µL de la suspensión en medio sólido levadura-manitol con espátula de Drygalsky. Como testigo se utilizó el medio sólido levadura-manitol con su correspondiente concentración de NaCl (0.01 %), de pH 7 y temperatura de 28 ºC, indistintamente (Vincent 1970). Todas las placas se incubaron a 28 ºC durante 10 días, excepto aquellos tratamientos donde se evaluaron diferentes rangos de temperatura.

Presencia de catalasa en los aislados. Las colonias (24 h de crecimiento) fueron depositadas en portaobjetos de vidrio y se les añadió una gota de H2O2 (30 %). La aparición de burbujas de gas indicó la presencia de la enzima catalasa (MacFaddin 1980). El criterio para la descripción de los resultados fue el de aparición de burbujas de gas (+) o no (-) en los aislados.

Aislados de rizobios. Se evaluaron 11 aislados de rizobios, los cuales previamente se identificaron y caracterizaron por Bécquer et al. (2016), con características fenotípicas que los hace cercanos al género Bradyrhizobium. Estos aislados procedían de leguminosas forrajeras localizadas en un ecosistema árido de Holguín, Cuba (tabla 1).

Cepas comerciales utilizadas en las evaluaciones. Se utilizaron diferentes cepas comerciales que sirvieron de material de comparación en las evaluaciones de tolerancia a factores abióticos estresantes (tabla 2).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tolerancia a factores abióticos estresantes. La capacidad de los microorganismos para crecer en diferentes condiciones de cultivo puede variar ampliamente, incluso entre cepas de la misma especie. Sin embargo, hay algunas características que pueden ser típicas de una especie. Incluso, cuando las condiciones son extremas, pueden diferenciar entre géneros o categorías superiores.

Temperatura. En la tabla 3 se muestran los resultados del crecimiento a diferentes temperaturas. Se evidencia que de 38 ºC en adelante no hubo crecimiento de aislados, mientras que a 35 ºC sí crecieron todos. También a esa temperatura crecieron las cepas testigo NZP 2213 (Mesorhizobium huakuii), HAMBI 1174 (Rhizobium galegae) y ATCC 9930 (Sinorhizobium meliloti).

De acuerdo con Hamdi (1985), el rango de temperatura de crecimiento para los rizobios aislados de las zonas tropicales se encuentra entre 25 y 30 ºC.  Según el autor citado, esto se atribuye a que este grupo de bacterias no tiene la capacidad de formar endosporas, que constituyen en estos microorganismos estructuras de resistencia ante factores desfavorables. Sin embargo, Bécquer (2002) caracterizó cepas de Bradyrhizobium sp., aisladas de Centrosema spp., que toleraron temperaturas de 40 ºC. Esto demuestra la amplia diversidad genética de estas bacterias. Aunque Hungria y Vargas (2000) consideran que la selección de cepas sobre la base de estos niveles de temperatura, aplicados in vitro, no es el mejor método para aplicaciones exitosas de estas bacterias en la práctica agrícola, Giongo et al. (2010) afirman que la tolerancia a altas temperaturas puede ser útil para seleccionar rizobacterias tolerantes a temperaturas oscilantes en el campo.

Samrudhi et al. (2013) aislaron rizobios de suelos bajo temperaturas de más de 50 °C, lo que demostró la habilidad de estos para sobrevivir y persistir en condiciones extremas.

Al no evaluar las temperaturas intermedias entre 35 y 38 ºC, los autores de este estuio no pudieron establecer en este trabajo el límite real de tolerancia de estos aislados a altas temperaturas. No obstante, en los estudios antes mencionados se evidenció que no toleraron el mismo nivel de temperatura de otros aislados, pertenecientes al género Bradyrhizobium, por lo que son necesarias otras evaluaciones en el futuro.

Acidez. Como muestra la tabla 4, todos los aislados fueron capaces de crecer en un rango de pH de 5 a 8.5, y la mayor parte hasta pH 10. El crecimiento a pH 5 es un carácter diferenciador para las especies de Rhizobium que forman nódulos en Phaseolus (Ramírez-Bahena et al. 2008). Hamdi (1985) sitúa a los bradyrhizobios entre los menos tolerantes a la alcalinidad, aunque Bécquer (2002) observó cepas de este género que crecieron en pH 11. En este trabajo, a pH 4 y 4.5, excepto dos aislados que no crecieron (un aislado del grupo C. virginianum: Ho8 y uno del grupo Desmodium triflorum: Ho5), el resto presentó crecimiento normal. En pH 9 y 10, dos aislados (Ho5, Ho6) del grupo de D. triflorum no presentaron crecimiento, pero los demás sí crecieron. Esto sugiere la presencia de mecanismos de adaptación que le permiten sobrevivir en etas condiciones, factor que se pudiera aplicar a los aislados evaluados en este estudio, aunque presuntamente pertenezcan al género Bradyrhizobium (Bécquer et al. 2016).

En general, el grupo de D. triflorum fue el que mostró mayor número de aislados que no crecieron a pH extremos. En el caso de los aislados Ho1, Ho2, Ho4, Ho7, Ho9, Ho10, Ho12 y Ho13, que crecieron indistintamente a pH extremadamente ácido y a pH alcalino, todo indica que son fuertes candidatos para tolerar esos rangos tan amplios de pH en el suelo, como puede ocurrir en diferentes ecosistemas ganaderos de Cuba. Ninguna de las cepas testigo creció en pH 10 sino hasta pH 9, y tres de ellas crecieron en pH 4: NZP 2213 (Mesorhizobium huakuii), CCBAU 2609 (M. loti) y CIAT 899 (R. tropici) (tabla 4).

Salinidad. En cuanto a la tolerancia a diferentes niveles de sal, en la tabla 5 se muestra que todos los aislados crecieron en 0.4 % NaCl, pero a partir de 0.5 % NaCl, tuvieron menor crecimiento, sobre todo los aislados Ho9, y Ho10, del grupo de D. cannum. Estos resultados se consideran normales, ya que los rizobios no crecen habitualmente a concentraciones de NaCl superiores a 2 % (Kuykendall 2005), aunque Zahran (2010) consideró que la tolerancia a la sal presenta diferentes variaciones para algunos rizobios. Al respecto, Elsheikh y Wood (1990) aseguraron que las variaciones de tolerancia a la sal por los rizobios puede ser de 1 a 6 %.

En este estudio, los aislados del grupo de C. virginianum (excepto Ho8) crecieron en mayor número hasta 0.8 % de NaCl, mientras que solo uno (Ho6) del grupo de D. triflorum creció a partir de 0.5 %, pero lo hizo hasta 1.2 %. Esto indica alto grado de tolerancia a la salinidad. No se detectaron aislados tolerantes a 2.4 % NaCl.

A pesar que los aislados que toleraron altas concentraciones de NaCl podrían pertenecer al género Bradyrhizobium por sus características morfoculturales (Bécquer et al., 2016), en estudios realizados por Marquina et al. (2011) acerca de la influencia de diferentes concentraciones de NaCl en el crecimiento de algunas cepas, se informó que los rizobios de rápido crecimiento tienen la capacidad de acumular poliaminas en menos tiempo (estabilizador osmótico), y utilizar con mayor rapidez nutrimentos necesarios para el crecimiento y la multiplicación, en comparación con los rizobios de lento crecimiento. Zahran et al. (2012) aislaron rizobios pertenecientes a los géneros Rhizobium y Sinorhizobium, tolerantes a 1 y 2 % NaCl. También Shamseldin y Werner (2005) señalaron que la tolerancia a la salinidad es otra propiedad de las cepas autóctonas de crecimiento rápido, pertenecientes al género Rhizobium con respecto a los simbiontes de crecimiento lento del género Bradyrhizobium.

Los resultados obtenidos con las cepas testigo, que crecieron hasta 1 % NaCl, pudieran constituir una prueba de estas afirmaciones. Sin embargo, esta tolerancia de los rizobios de rápido crecimiento no es absoluta, ya que se han identificado especies del género Sinorhizobium, en las que se reprimían genes relacionados con el metabolismo central, factores de elongación, ADN ligasas, proteínas chaperonas y algunas de las proteínas que intervienen en el proceso de división celular, al incrementarse las concentraciones de NaCl en el medio de cultivo (Fujihara y Yonehama 1993).

Las plantas aumentan su resistencia a la salinidad y a la sequía por la acción de la prolina, que tiene la capacidad de suministrar poder reductor para mantener el metabolismo del bacteroide hasta que se restablezca el estado normal de hidratación de la planta y, a su vez, contribuir a mantener la turgencia celular. Por ello, los resultados de este trabajo sugieren que la respuesta de los rizobios al estrés abiótico corresponde más a la respuesta continuada de estos a las condiciones ambientales en las que se aislaron que a rasgos intrínsecos a su filogenia.

Según Li et al. (2011), los rizobios aislados de suelos afectados por salinidad suelen ser altamente tolerables a este factor abiótico. Un aumento en la salinidad externa y la osmolaridad dispara la pérdida de agua de la célula, que causa decrecimiento en el volumen citoplasmático, reduciéndose la turgencia y la deshidratación del citoplasma (Sleator y Hill, 2002).

Aunque el suelo en el que se realizó la colecta es débilmente salino, su alto contenido de K (57.77 mg/100 g K2O) (datos no mostrados) lo hace un fuerte candidato a la influencia de las altas concentraciones de este elemento en la expresión genética de algunos aislados para la tolerancia a la salinidad. El potasio, al ser el catión intracelular más abundante, hace la mayor contribución en la presión de turgencia de las células, al desempeñar una función importante en la adaptación osmótica de las bacterias, regulación del pH, expresión genética y activación de las enzimas celulares (Epstein, 2003). De acuerdo aon Balaji et al. (2005), los niveles altos de K, después de un cambio osmótico, actúan como un segundo mensajero para activar otras respuestas activadas osmóticamente.

En este trabajo hubo aislados (Ho6, Ho12, Ho13) que, independientemente del macrosimbionte del cual provenían y del grupo morfocultural al que se circunscribieron, presentaron tolerancia a diferentes factores abióticos, como acidez y alcalinidad, altas concentraciones de sal, y crecieron a 35 ºC. Es posible que pertenezcan a una misma especie que muestra amplia norma de reacción de su genotipo, lo que permite su adaptación a diferentes condiciones ambientales estresantes (Bécquer, 2002).

Presencia de catalasa. En este trabajo se evaluó cualitativamente la presencia de catalasa de los aislados nativos, como parte del criterio para su futura aplicación en cultivos que se encuentren bajo estrés de sequía, sobre la base de la afirmación de Goyal et al. (1986) y Vanderlinde et al. (2010) acerca de que los rizobios producen antioxidantes (catalasa) y otros compuestos para sobrevivir en ambientes extremos, especialmente bajo sequía.

En la tabla 6 se muestran los resultados de ese tipo de prueba, en la que se observa que todos los aislados reaccionaron positivamente al H2O2 añadido a la colonia bacteriana, con la consiguiente formación de burbujas de gas. El aislado Ho13 presentó débil reacción. Las cepas comerciales también mostraron reacción positiva, lo que indica que estas, al igual que los aislados nativos, producen catalasa. Este resultado corrobora lo informado por Hanyu et al. (2009) acerca de la presencia de genes que codifican para catalasa en Mesorhizobium loti, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium etli y Mesorhizobium loti, aunque esta enzima puede ser monofuncional (catalasa) o bifuncional (catalasa-peroxidasa) en estos géneros. Esto les permite  adoptar diferentes estrategias en su supervivencia, dentro o fuera de la planta.

Según Hussain et al. (2014), la capacidad de los rizobios de producir catalasa y exopolisacáridos constituye no solo un factor para la tolerancia a la sequía, sino un atributo confiable para seleccionar aislados eficientes como PGPR, para aplicar en plantas no pertenecientes a la familia de las leguminosas. Estos mismos autores demostraron que aislados de rizobios provenientes de Lens culinaris L., Vigna radiata L. y Cicer arietinum L. presentaron capacidad de sobrevivir a la escasez de agua, gracias a su capacidad de producir catalasa. Esto les ayuda a salvar la membrana celular y el ácido nucleico de la destrucción que ocurre en condiciones de estrés ambiental (Boumahdi et al. 1999).

Se concluye que hubo aislados tolerantes a diferentes factores abióticos estresantes, así como con producción de catalasa. Además, existieron aislados, que independientemente del macrosimbionte del que provenían y del grupo morfocultural al cual se circunscribieron, presentaron tolerancia a diferentes factores abióticos (acidez y alcalinidad, altas concentraciones de sal y crecimiento a 35 ºC), lo que les confiere alto potencial para su aplicación futura en la práctica agrícola en condiciones ambientales adversas. Se recomienda realizar ensayos de inoculación de gramíneas y leguminosas en condiciones ambientales estresantes para seleccionar los aislados con mayor efecto positivo en estos cultivos.

 

REFERENCIAS

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Recibido: 13/1/2017

Aceptado: 1/2/2017

 

 

C. J. Bécquer. Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, Estación Experimental Sancti Spíritus, Apdo. 2255, Z. P. 1, C. P. 60100, Sancti Spíritus, Cuba. Email: pastossp@enet.cu

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