ARTÍCULO ORIGINAL

 

Caracterización de cepas Bacillus subtilis como candidatas para la elaboración de aditivos zootécnicos

 

Characterization of Bacillus subtilis strains as candidates for the preparation of animal additives

 

 

Grethel Milián Florido¹, Ana J. Rondón¹, M. Pérez², R. Boucourt⁴, Marlen Rodríguez¹, Fátima Arteaga³, Yadileiny Portilla⁵, Y. Pérez¹, A. Beruvides¹, and  Marta Laurencio¹

¹Universidad de Matanzas. Autopista Varadero km 3 ½, Matanzas, Cuba

²Universidad Estatal Amazónica.  Departamento de Ciencias de la Tierra. Ecuador. km. 2 ½  Vía a Tena (Paso Lateral), Puyo, Pastaza

³Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí, Calceta, Ecuador

⁴Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

⁵Universidad Autónoma de Madrid, Ciudad Universitaria de Cantoblanco, 28049 Madrid, España

 

 

---

RESUMEN

Se caracterizaron las cepas C-31, C-34 y E-44 de Bacillus subtilis, sub especie subtilis para su uso en la elaboración de aditivos zootécnicos destinados a la producción animal. Las cepas estudiadas pertenecen al Cepario del Centro de Estudios Biotecnológicos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Matanzas y al Instituto de Ciencia Animal. Para la caracterización de estas cepas se consideró la capacidad de crecimiento, producción de endosporas, producción de enzimas, actividad antimicrobiana y respuesta ante 25 antibióticos de amplio espectro. Los resultados mostraron que las tres cepas tienen alta capacidad de crecimiento y producción de endosporas, fueron capaces de inhibir microorganismos Gram positivos y Gram negativos; además de mostrar sensibilidad a los 25 antibióticos evaluados. Esto permite inferir que dichas cepas muestran rangos favorables para ser utilizadas como aditivos zootécnicos, que constituyen en la actualidad una alternativa prometedora ante el empleo de antibióticos como promotores del crecimiento.

Palabras clave: antimicrobianos, sensibilidad, antibióticos, enzimas, Bacillus subtilis  

---

ABSTRACT

The strains C-31, C-34 and E-44 of Bacillus subtilis, sub species subtilis were characterized for their use in the elaboration of animal additives destined for animal production. The studied strains belong to the strains collection from the  Centro de Estudios Biotecnológicos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Matanzas and to the  Instituto de Ciencia Animal. For the characterization of these strains, growth capacity, endospores production, enzyme production, antimicrobial activity and response to 25 broad spectrum antibiotics were considered. The results showed that the three strains have high growth capacity and endospore production, were able to inhibit Gram positive and Gram negative microorganisms; in addition to showing sensitivity to the 25 antibiotics evaluated. This allows inferring that these strains show favorable ranges to be used as animal additives, which are currently a promising alternative to the use of antibiotics as growth promoters.

Key words: antimicrobials, sensitivity, antibiotics, enzymes, Bacillus subtilis 

---

 

 

INTRODUCCIÓN

Hoy en día la producción animal va acompañada de una práctica intensiva que trae consigo inmunodepresión en los animales y los predispone a trastornos gastrointestinales, provocados en ocasiones por la presencia de microrganismos patógenos (Salmonella spp., E.coli, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus) (Hernández et al. 2015 y Rodríguez 2017), que repercuten en los índices bajos que muestran los indicadores de salud. Ante esta realidad,  a nivel mundial, se atenúo esta situación con el uso de los antibióticos como promotores del crecimiento (Pérez et al. 2015). Sin embargo, la Comunidad Europea prohibió su inclusión en la dieta con fines profilácticos (European Parliament and Council 2003). En este contexto, nutricionistas y especialistas iniciaron investigaciones para la búsqueda de nuevos aditivos zootécnicos que resultaran inocuos para los animales y el hombre, con efectos similares a estos fármacos (Carro et al. 2014 y Linares 2015).

Actualmente se trabaja en la incorporación en la producción animal de aditivos zootécnicos elaborados con endosporas de Bacillus spp. que poseen actividad probiótica por su capacidad para producir sustancias antimicrobianas por bacteriocinas y/o por antibióticos y enzimas (Kadaikunnan et al. 2015 y Kizerwetter-Świda y Binek 2016). También su uso se justifica por su durabilidad en unidades de producción.

En el mundo se comercializan productos elaborados a partir de cepas de B. subtilis y sus endosporas (BioPlus 2B®, Biostart®, Toyocerin®, Liqualife®, Biosporin®, CenBiot®, Bactisubtil, Biosubtyl “Dalat” y Clostat®) con efecto probiótico en una amplia categoría de animales de interés zootécnico. Sin embargo, no siempre se informan los estudios realizados con estos productos, en lo que respecta a la caracterización bioquímica y microbiológica de las cepas que se utilizan en su elaboración, que los hacen seguros para su comercialización. La poca disponibilidad de trabajos con este fin constituye una preocupación de la Food Agricultural Organization y World Health Organization (FAO y WHO 2012).  De ahí que el objetivo de esta investigación sea caracterizar las cepas C-31, C-34 y E-44 de Bacillus subtilis, sub especie subtilis, como posibles candidatas para elaborar aditivos zootécnicos que se pudieran utilizar en la producción pecuaria, como alternativa viable y ecológica.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el desarrollo de la investigación se trabajó con las cepas C-31, C-34 y E-44 de Bacillus subtilis, sub especie subtilis, pertenecientes al Cepario del Centro de Estudios Biotecnológicos de la Universidad de Matanzas y al Instituto de Ciencia Animal, aisladas e identificadas por Milián et al. (2014).

a) Dinámica de la capacidad de crecimiento y producción de endosporas. Se trabajó con cultivos de 24 h en caldo nutriente. La toma de muestras se hizo a las 0, 24, 48 y 72 h. La incubación se realizó a 37 ºC durante 24 h en condiciones de aerobiosis. El conteo de microorganismos fue por el número de unidades formadoras de colonias (UFC). Se determinó según conteo visual de colonias en placas con agar nutriente (Pelczar et al. 1966).

b) Determinación de la actividad antimicrobiana. Se aplicó la técnica de difusión de sustancias en agar, según la metodología de Barbosa et al. (2005). Las cepas indicadoras utilizadas se muestran en la tabla 1.

C) Determinación de la sensibilidad de las cepas a antibióticos. Se utilizó la técnica de difusión de discos de antibióticos en agar, de Bauer et al. (1966). Los antibióticos utilizados y la concentración de los discos se describen en la tabla 2.

c) Determinación de la producción de enzimas específicas. Se realizó con el sistema API-ZYM (BioMerieux SA, France).

Procesamiento estadístico. Para el análisis de los datos de la capacidad de crecimiento y esporulación se aplicó la estadística descriptiva. Se determinó la media, desviación estándar y coeficiente de variación. El paquete estadístico utilizado fue INFOSTAT, versión 2012 (Di Rienzo et al. 2012). Los datos del conteo de las UFC se transformaron a Log N.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Capacidad de crecimiento y producción de endosporas. En la tabla 3 se muestran los resultados descriptivos de las tres cepas (C-31, C-34 y E-44) en cuanto a la dinámica de crecimiento microbiano y producción de endosporas. La caracterización demostró que los valores medios de cada una de las cepas oscilan entre los rangos establecidos para el género Bacillus spp. Según estudios realizados por Nguyen et al. (2015), las cepas de este género (B. subtilis y B. licheniformis) crecen velozmente. La correlación con respecto a la producción de endosporas es de más de 90 %. Estas sepas poseen además, la capacidad para adaptarse a las condiciones de la mucosa intestinal de los pollos. 

Determinación de la actividad antimicrobiana. En las horas de muestreo 0 y 6 no se observó actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de las cepas productoras (C-31, C-34 y E-44) ante las cepas indicadoras. En la figura 1 se muestran los resultados entre las 8 y 18 h. Las tres cepas evaluadas mostraron la capacidad de activar enzimas capaces de producir sustancias antimicrobianas para la inhibición total de Aerobacter, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Listeria inocua, L. monocytogenes, S. aureus 29737, Klebsiella 130300, S. epidermidis 12228 y P. vulgaris13315. Sin embargo, para las cepas de E. coli -0157-H7, E. cloacae y S. thyphimurium no se observó inhibición por parte de las cepas productoras. Esta respuesta se pudiera relacionar con que no se encontraron sustancias antimicrobianas para inhibir específicamente a estos patógenos, a pesar de que se conoce que Bacillus spp. produce variedad de clases y subclases de bacteriocinas y otras sustancias inhibitorias, capaces de inhibir un gran grupo de microorganismos patógenos.

Los valores informados por algunos autores (Nguyen et al. 2015 y Prado-Rebolledo et al. 2016), en cuanto a la inhibición de microorganismos patógenos con el uso de probióticos, son análogos a los informados en esta investigación.

Trabajos recientes de Rodríguez (2017) revelan que el género Bacillus produce bacteriocina LFB 112 y lipopéptidos Surfactin y Mycosubtilin, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas, como E. coli, Salmonella, C. perfringens, Streptococcus spp., S. aureus, Pasteurella multocida, P. aeruginosa, gérmenes involucrados en enfermedades propias de animales con interés zootécnico. Esto hace prometedoras a las cepas estudiadas (C-31, C-34 y E-44).

Otro resultado informado es la no inhibición de las cepas Lactobacillus salivarius, lo que constituye un elemento importante en las investigaciones actuales, debido a que en los últimos años se trabaja en la obtención de mezclas de microorganismos de diferentes géneros, con particular interés en Lactobacillus y Bacillus, con el propósito de potenciar la actividad probiótica en animales. Estas mezclas favorecen la persistencia (vida útil del producto) y proporcionan un sustrato específico para la biota bacteriana residente, lo que teóricamente favorece la estabilización del entorno intestinal (Aziz-Mousavi et al. 2015).

Determinación de la sensibilidad frente a antibióticos. La figura 2 muestra que las cepas C-31, C-34 y E-44 son sensibles a los 25 antibióticos evaluados. Se pudiera inferir que estas cepas no poseen plásmidos de resistencia, elemento importante si se tiene en cuenta que pueden ser válidas para la elaboración de aditivos zootécnicos. Este resultado concuerda con estudios de Blajman et al. (2015), Nguyen et al. (2015) y Latorre et al. (2016), desarrollados con cepas de Bacillus spp.

Los resultados obtenidos en esta investigación se encuentran en correspondencia con lo planteado por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), instituciones que establecieron no utilizar bacterias en alimentos que contengan genes transferibles con resistencia a medicamentos. Cuando se proceda a la selección de cepas probióticas, recomiendan que estas no posean genes transmisibles que codifiquen la resistencia a medicamentos utilizados con fines clínicos (Comisión Europea 2011).

Producción de enzimas específicas. Los resultados de la actividad enzimática de las cepas se muestran en la tabla 4. De los 19 sustratos presentes en las galerías, nueve se utilizaron por las células, lo que demuestra que estas tienen la capacidad para sintetizar las enzimas específicas para cada una de estas sustancias. Ello posibilita su uso en la elaboración de aditivos zootécnicos y su incorporación a la dieta de animales, pues producen enzimas que intervienen en la hidrólisis de diferentes sustancias identificadas en los alimentos que se ingieren, así como restos de células microbianas o del hospedero, lo que favorece el establecimiento de una microbiota intestinal balanceada. En estudios similares de Zhang et al. (2016) se informa que cuando evaluaron un probiótico con cepas de Bacillus coagulans NJ0516, lograron incremento en la actividad de las enzimas proteasas y amilasas, lo que se tradujo en mejoras en los procesos digestivos en pollos de ceba.

Como resultado del estudio de caracterización  de las cepas C-31, C-34 y E-44, identificadas como Bacillus subtilis, sub especie subtilis, permite concluir que las cepas muestran características potenciales para su utilizacón en la elaboración de aditivos zootécnicos con posible efecto probiótico en animales de interés zootécnico.

 

REFERENCIAS

Aziz-Mousavi, S. M. A., Seidavi, A., Dadashbeiki, M., Kilonzo, K., Nahashon, S., Laudadio, V. & Tufarelli, V. 2015. “Effect of a synbiotic (Biomin®IMBO) on growth performance traits of broiler chickens”. European Poultry Science, 79: 1–15, ISSN: 1612-9199, DOI: 10.1399/eps.2015.78.

Barbosa, T. M., Serra, C. R., Ragione, R. M. L., Woodward, M. J. & Henriques, A. O. 2005. “Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract”. Applied and Environmental Microbiology, 71(2): 968–978, ISSN: 0099-2240, 1098-5336, DOI: 10.1128/AEM.71.2.968-978.2005.

Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C. & Turck, M. 1966. “Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method”. American Journal of Clinical Pathology, 45(4): 493–496, ISSN: 0002-9173.

Blajman, J. E., Zbrun, M. V., Astesana, D. M., Berisvil, A. P., Romero, A. S., Fusari, M. L., Soto, L. P., Signorini, M. L., Rosmini, M. R. & Frizzo, L. S. 2015. “Probiotics in broilers rearing: A strategy for intensive production models”. Revista Argentina de microbiologia, 47(4): 360–367, ISSN: 0325-7541, DOI: 10.1016/j.ram.2015.08.002.

Carro, T. M. D., Saro, H. C., Mateos, Á. I., Díaz, R. A. & Ranilla, G. M. J. 2014. “Perspectivas y retos de los extractos vegetales como aditivos alimentarios en rumiantes”. Albéitar, (179): 4–6, ISSN: 1699-7883.

Comisión Europea 2011. Plan de acción contra la amenaza creciente de las resistencias bacterianas. Unión Europea: Comunicación de la Comisión al Parlamento Europeo y al Consejo, Available: <http://ec.europa.eu/dgs/health_food safety/docs/communication_amr_2011_748_es>, [Consulted: November 1, 2017].

Di Rienzo, J. A., Casanoves, F., Balzarini, M. G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C. W. 2012. InfoStat. version 2012, [Windows], Córdoba, Argentina: Grupo InfoStat, Available: <http://www.infostat.com.ar/>.

European Parliament and Council 2003. Regulation (EC) No. 1831/2003 of the European Parliament and of the Council of 22nd September 2003 on additives for use in animal nutrition. no. L268/36, European Union: FAO, FAOLEX, Available: <https://www.ecolex.org/details/legislation/regulation-ec-no-18312003-of-the-european-parliament-and-of-the-council-on-additives-for-use-in-animal-nutrition-lex-faoc040306/%2BRegulation+(EC)+No.+1831/2003+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+22nd+September+2003+on+additives+for+use+in+animal+nutrition&client=firefox-b-ab&hl=es&ct=clnk>, [Consulted: October 12, 2017].

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) & WHO (World Health Organization) 2012. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food. Ontario, Canada, Available: <http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf>, [Consulted: October 12, 2017].

Hernández, A. H., Coronel, C. R., Monge, M. Z. & Quintana, C. H. 2015. “Microbiota, Probióticos, Prebióticos y Simbióticos”. Revista Pediatría Integral, 19(5): 337–354, ISSN: 1135-4542.

Kadaikunnan, S., Rejiniemon, T. S., Khaled, J. M., Alharbi, N. S. & Mothana, R. 2015. “In-vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens”. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 14: 9, ISSN: 1476-0711, DOI: 10.1186/s12941-015-0069-1.

Kizerwetter-Świda, M. & Binek, M. 2016. “Assessment of potentially probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from chickens”. Polish Journal of Veterinary Sciences, 19(1): 15–20, ISSN: 2300-2557, DOI: 10.1515/pjvs-2016-0003.

Latorre, J. D., Hernandez-Velasco, X., Wolfenden, R. E., Vicente, J. L., Wolfenden, A. D., Menconi, A., Bielke, L. R., Hargis, B. M. & Tellez, G. 2016. “Evaluation and Selection of Bacillus Species Based on Enzyme Production, Antimicrobial Activity, and Biofilm Synthesis as Direct-Fed Microbial Candidates for Poultry”. Frontiers in Veterinary Science, 3, ISSN: 2297-1769, DOI: 10.3389/fvets.2016.00095, Available: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5071321/>, [Consulted: November 1, 2017].

Linares, L. 2015. “Los desafíos nutricionales frente a las restricciones de uso de aditivos: eliminación de uso de antibiótico”. In: XXIV Congreso Latinoamericano de Avicultura 2015, Guayaquil, Ecuador: Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador (CONAVE), Available: <https://www.engormix.com/avicultura/articulos/los-desafios-nutricionales-frente-t32625.htm>, [Consulted: November 1, 2017].

Milián, G., Rondón, A. J., Pérez, M., Samaniego, L. M., Riaño, J., Bocourt, R., Ranilla, R., Carro, M. D., Rodríguez, M. & Laurencio, M. 2014. “Isolation and identification of strains of Bacillus spp. in different ecosystems, with probiotic purposes, and their use in animals”. Cuban Journal of Agricultural Science, 48(4): 347–351, ISSN: 2079-3480.

Nguyen, A. T. V., Nguyen, D. V., Tran, M. T., Nguyen, L. T., Nguyen, A. H. & Phan, T.-N. 2015. “Isolation and characterization of Bacillus subtilis CH16 strain from chicken gastrointestinal tracts for use as a feed supplement to promote weight gain in broilers”. Letters in Applied Microbiology, 60(6): 580–588, ISSN: 1472-765X, DOI: 10.1111/lam.12411.

Pelczar, M. J., Reid, R. D. & Aguilar-Bartolomé, F. 1966. Microbiología. México: McGraw-Hill, 664 p.

Pérez, Q. M., Milian, F. G., Rondón, A. J., Bocourt, S. R. & Torres, V. 2015. “Efecto de endosporas de Bacillus subtilis E-44 con actividad probiótica sobre indicadores fermentativos en órganos digestivos e inmunológicos de pollos de engorde”. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 35(2): 89–94, ISSN: 1315-2556.

Prado-Rebolledo, O. F., Delgado-Machuca, J. de J., Macedo-Barragan, R. J., Garcia-Márquez, L. J., Morales-Barrera, J. E., Latorre, J. D., Hernandez-Velasco, X. & Tellez, G. 2016. “Evaluation of a selected lactic acid bacteria-based probiotic on Salmonella enterica serovar Enteritidis colonization and intestinal permeability in broiler chickens”. Avian Pathology, 46(1): 90–94, ISSN: 0307-9457, DOI: 10.1080/03079457.2016.1222808.

Rodríguez, M. 2017. Evaluación de la capacidad antibacteriana de PROBIOLEV® frente a bacterias patógenas. Ph.D. Thesis, Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba, 100 p.

Zhang, L., Zhang, L., Zhan, X., Zeng, X., Zhou, L., Cao, G., Chen, A. & Yang, C. 2016. “Effects of dietary supplementation of probiotic, Clostridium butyricum, on growth performance, immune response, intestinal barrier function, and digestive enzyme activity in broiler chickens challenged with Escherichia coli K88”. Journal of Animal Science and Biotechnology, 7: 3, ISSN: 2049-1891, DOI: 10.1186/s40104-016-0061-4.

 

 

Recibido: 15/11/2016

Aceptado: 23/7/2017

 

 

Grethel Milián Florido, Universidad de Matanzas. Autopista Varadero km 3 ½, Matanzas, Cuba. Email: [e-mail]