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Cuban Journal of Agricultural Science

Print version ISSN 0864-0408On-line version ISSN 2079-3480

Cuban J. Agric. Sci. vol.54 no.1 Mayabeque Jan.-Mar. 2020  Epub Mar 01, 2020

 

CIENCIA ANIMAL

Utilización de residuos agroindustriales para la producción de enzimas por Bacillus subtilis E 44

Madyu Matos Trujillo1  * 

Y. Pérez Hernández1 

Aymara Valdivia Avila1 

María José Ranilla2 

Zoraya Rodríguez Alonso3 

Yasmary Rubio Fontanills1 

A. Díaz Reyes2 

Sonia Jardines González1 

C. Camacho Campos1 

1Centro de Estudios Biotecnológicos, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Autopista Varadero km 3 1/2, Matanzas, Cuba

2Departamento de Nutrición Animal, Universidad de León, España

3Departamento de Fisiología y Bioquímica, Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

Resumen

Se evaluaron el afrecho de trigo, el bagazo de caña de azúcar, la cáscara de arroz y el rastrojo de maíz como sustratos para la producción de endocelulasas, endoxilanasas y mananasas por Bacillus subtilis E44 durante la fermentación en estado sólido. La fermentación en estado sólido se realizó en matraces de 250 mL, con 1g de los sustratos enriquecidos con medio mínimo de sales, incubados durante 24 h a 37 ºC. La extracción del crudo enzimático se realizó por la adición de amortiguador fosfato de sodio 0,02 mol L-1 y pH 7,0 (1:10 p/v) en zaranda a 110 r.p.m. durante 30 min. La producción de las enzimas se determinó por la medición de las actividades enzimáticas en el crudo. Los resultados del estudio mostraron que el afrecho de trigo, el bagazo de caña de azúcar y el rastrojo de maíz se pueden utilizar para producir endocelulasas, endoxilanasas y mananasas, mientras que la cáscara de arroz no se puede emplear para obtener endocelulasas. La producción de endoxilanasas fue superior al resto de las enzimas y el mejor inductor fue el afrecho de trigo (25,08 UI.mL-1), seguido por el bagazo de caña de azúcar (9,32 UI.mL-1). La cáscara de arroz y el rastrojo de maíz mostraron valores de 6,92 UI.mL-1 y 6,95 UI.mL-1, respectivamente. Los resultados obtenidos demostraron las potencialidades del afrecho de trigo, el bagazo de caña de azúcar y el rastrojo de maíz para producir endocelulasas, endoxilanasas y mananasas. La cáscara de arroz no es buen inductor para obtener endocelulasas. La bacteria Bacillus subtilis E44 demostró ser mejor productora de enzimas endoxilanasas que de mananasas y endocelulasas.

Palabras clave: endocelulasas; endoxilanasas; mananasas; fermentación en estado sólido

Introducción

La conversión de la biomasa lignocelulósica, derivada de residuos agrícolas, en compuestos de valor agregado es una estrategia sustentable para el desarrollo de muchas industrias (Bharathiraja et al. 2017, Ravindran y Jaiswal 2016 y Ravindran et al. 2018). Durante la degradación de estos materiales por los microorganismos se producen diversos compuestos, como proteínas, enzimas, ácidos orgánicos, metabolitos secundarios y oligosacáridos (Knob et al. 2014).

Las enzimas hidrolíticas, obtenidas a partir de hongos, bacterias y levaduras, se destacan por su aplicación en numerosos procesos industriales, como la extracción y la clarificación de zumos de frutas, la extracción de aceites vegetales y pigmentos de plantas, el blanqueado de la pulpa y del papel y la alimentación animal, entre otros. Entre los microorganismos utilizados con estos propósitos, las bacterias del género Bacillus se consideran promisorias para el desarrollo de la industria agropecuaria, debido a la variedad de enzimas extracelulares que producen y su estabilidad a elevadas temperaturas (Chakdar et al. 2016).

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el afrecho de trigo (Triticum aestivum L.), el bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.), la cáscara de arroz (Oryza sativa L.) y al rastrojo de maíz (Zea mays L.), como sustratos para la producción de enzimas endocelulasas, mananasas y endoxilanasas por Bacillus subtilis E44 durante la fermentación en estado sólido (FES).

Materiales y Métodos

Composición química de los residuos agroindustriales. El afrecho de trigo, el bagazo de caña de azúcar, la cáscara de arroz y el rastrojo de maíz, utilizados como sustratos para inducir la actividad de las enzimas de Bacillus subtilis E44, proceden de diferentes municipios de la provincia de Matanzas (tabla 1).

Tabla 1 Origen de los residuos agroindustriales de la provincia de Matanzas utilizados en el estudio. 

Residuo Agroindustrial Procedencia Municipio
Afrecho de Trigo (Triticum aestivum L.) Empresa molinera de trigo Cárdenas
Bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) Central Azucarero Industrial (CAI) “Mario Muñoz Monroy” Colón
Cáscara de arroz (Oryza sativa L.) Molino artesanal Jovellanos
Rastrojo de maíz (Zea mays L.) Sembrado de maíz en finca de productor privado. Jovellanos

El trigo se importó desde Alemania en junio del 2015 y es de tipo semi duro. El afrecho se obtuvo en las etapas sucesivas del proceso de molturación y cernido del trigo para la obtención de la harina. La colecta se realizó de forma aleatoria, de los 83 sacos que contenían el subproducto.

La cáscara de arroz se colectó al final del día, después de terminada la producción, en un molino artesanal. La colecta se realizó de forma aleatoria, en los siete sacos que contenían el subproducto.

El afrecho, como la cáscara de arroz, se trasladó al laboratorio en bolsas de polietileno que pesaban 1,98 y 1,53 kg, respectivamente.

El bagazo de caña se colectó en la casa de bagazo del CAI. El rastrojo de maíz se recogió en el campo, dos días después de la cosecha. Los materiales se colectaron en cinco puntos y se tomaron todos los estratos desde la superficie al piso. Se conformaron las muestras por el método de cuarteo y se trasladaron al laboratorio en sacos de polietileno, con 1,2 y 1,67 kg de cada uno. Se analizó un lote de cada sustrato, compuesto por las muestras tomadas en cada caso.

Los sustratos se secaron en estufa a 60 °C durante 72 h. Se trituraron en un molino de martillo, tipo Fritsch, modelo GMbH con tamaño máximo de partícula de 2 mm. El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina se determinó mediante la técnica secuencial descrita por Van Soest et al. (1991), con las modificaciones propuestas por ANKOM (1998). Para el análisis se utilizaron bolsas de poliéster (ANKOM Corp #57), con tamaño de poro de 30 µm y dimensiones de 4,5 x 5,5 cm. El nitrógeno se cuantificó mediante el método Kjeldahl (AOAC 2012), con el uso de un equipo de destilación Kjeltec System 1002 (Tecator). La proteína bruta se obtuvo por la multiplicación del contenido de N de la muestra, según el factor de conversión 6,25.

Cultivo microbiano. Se utilizó la cepa Bacillus subtilis E44, procedente del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Matanzas, conservada a -30 ºC en glicerol.

Medio de cultivo mínimo de sales (MS). La solución mineral estuvo compuesta por NaCl (0.1 %), KH2PO4 (0.3 %), K2HPO4 (0.6 %), MgSO4 (0.12 %), peptona (0.5 %) y extracto de levadura (0.3 %). Se ajustó el pH a 7.5 con KOH (1 mol L-1) y se esterilizó a 121ºC durante 15 min.

Preparación de la suspensión microbiana. A partir de un cultivo de Bacillus subtilis E44 de 16 h se preparó una suspensión celular en Erlenmeyer con 50 mL de caldo nutriente. Se incubó a 28ºC en zaranda a 110 r.p.m., hasta obtener una densidad óptica (D.O600nm = 0.8) equivalente a una concentración de 1x108 ufc mL-1.

Fermentación en estado sólido. El experimento se realizó en matraces de 250 mL, previamente esterilizados a 121ºC durante 15 min y secados en la estufa a 60 ºC durante 48 h. Los matraces contenían 1g de los sustratos (afrecho de trigo, bagazo de caña de azúcar, cáscara de arroz y rastrojo de maíz). En cada Erlenmeyer, los sustratos se inocularon con 10 % (p/v) de la suspensión microbiana y se añadió el medio materia seca hasta obtener 80 % de humedad en la FES. Los matraces se colocaron en la incubadora a 37 ºC durante 24 h. Cada sustrato se evaluó por triplicado.

Extracción del crudo enzimático. Para la extracción, se adicionó a cada matraz amortiguador 0,02 mol L-1 de fosfato de sodio y pH 7, relación 1:10 (p/v). Se colocó cada uno en zaranda a 110 r.p.m. durante 30 min. Posteriormente, el sustrato se filtró por gasa y se centrifugó a 10 000 r.p.m. durante 15 min a 4ºC. Los extractos se conservaron a -20ºC hasta su evaluación.

Actividades enzimáticas. Las actividades de las enzimas endoxilanasas, endocelulasas y mananasas se determinaron por triplicado en los extractos obtenidos. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 0.4 mL del sustrato (1 % de xilano de haya, 1% de carboximetilcelulosa y 0.5 % de galactomanano, respectivamente) y 0.1 mL del extracto enzimático. Se incubó a 50 ºC durante 10 min. La reacción se detuvo al adicionar 0.5 mL de ácido dinitrosalicílico. Las muestras se colocaron en baño de agua a 100 º C durante 10 min. Se adicionó 1,2 mL de agua destilada y se midió la absorbancia a 540 nm. Los equivalentes de glucosa, manosa y xilosa se calcularon a partir de las correspondientes curvas patrón. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima requerida para producir 1µmol.mL-1 de glucosa, manosa y xilosa por minuto en las condiciones del ensayo. La producción de enzimas se determinó a partir de las actividades enzimáticas detectadas después de la FES con cada uno de los sustratos.

Análisis estadístico. Para el análisis de los resultados de la composición química de los sustratos se utilizó la estadística descriptiva para determinar la media, la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV). A los datos obtenidos de la producción de enzimas se les realizó el análisis de varianza, según diseño completamente aleatorizado, con arreglo factorial 3x4. Se aplicó la dócima de Duncan (1995) para establecer las diferencias entre medias. El procesamiento se realizó mediante el paquete estadístico Insfostat (Di Rienzo et al., 2012).

Resultados y Discusión

La composición química de los residuos agroindustriales mostró diferencias en el porcentaje de hemicelulosa, celulosa y lignina (tabla 2). Este resultado se debe a que los sustratos utilizados provienen de especies de plantas diferentes. Además del factor genotipo, la distribución de los compuestos de las paredes celulares puede variar, debido a los procesos agroculturales asociados a la siembra, la cosecha, los eventos post cosecha, la edad del cultivo y las condiciones fisiológicas de las plantas (Mussatto et al. 2012). Según Knob et al. (2014), en los residuos agroindustriales, la celulosa es la fracción dominante en la pared vegetal (35-50 %), seguida por la hemicelulosa (20-35 %) y la lignina (10-25 %). El porcentaje de celulosa que muestra el afrecho de trigo no se corresponde con lo planteado por estos últimos autores. Sin embargo, se encuentra próximo al rango referido por Babu et al. (2018), donde 55 % de la fibra en este sustrato está compuesta por arabinoxilanos, mientras que la celulosa ocupa entre 9 y 12 % de su peso seco.

Tabla 2 Composición química (%) de los residuos agroindustriales utilizados como sustratos en la fermentación en estado sólido de Bacillus subtilis E44. 

Sustratos
Bagazo de caña Afrecho de trigo Cáscara de arroz Rastrojo de maíz
Celulosa 42,22 4,31 23,68 41,41
DE 0,97 0,03 0,78 0,60
CV 1,74 0,43 1,98 1,32
Hemicelulosa 33,95 22,58 20,45 40,02
DE 0,61 0,40 1,38 0,71
CV 0,68 1,40 2,30 2,53
Lignina 13,44 1,62 15,80 4,24
DE 0,31 0,16 0,66 0,14
CV 2,32 3,75 4,18 3,29
Proteína bruta 2,01 14,31 7,87 3,59
DE 0,09 0,30 0,20 0,58
CV 4,31 2,12 2,53 3,81

La composición química del afrecho varía entre las diferentes cosechas y está estrechamente relacionada con la variedad, las condiciones de cultivo y los métodos utilizados para la separación del grano de trigo (Babu et al., 2018). Hatfield y Fukushima (2005) consideran que el grado de polimerización, el contenido elevado de proteínas, minerales y otros compuestos orgánicos presentes en los materiales pueden afectar la exactitud de los análisis químicos.

En este trabajo, la producción de las enzimas se expresa en términos de su actividad enzimática, tal como refiere la literatura internacional. Los resultados de la producción de endocelulasas, mananasas y endoxilanasas por Bacillus subtilis E44 durante la FES mostró que existe interacción entre los sustratos y la actividad de las enzimas (P<0,0001) (tabla 3). La naturaleza de la fuente de carbono en el medio de cultivo influye en la producción de enzimas. Estos resultados indican que todos los residuos evaluados inducen la expresión endoxilanasas por esta cepa. Los valores más elevados se obtuvieron con el afrecho de trigo (25,08 UI.mL-1), y le siguió el bagazo de caña (9,32 UI.mL-1). La cáscara de arroz y la paja de maíz no presentaron diferencias entre sí.

Tabla 3 Producción de endocelulasas, mananasass y endoxilanasas por Bacillus subtilis E44 durante la FES con el uso de diferentes residuos agroindustriales como fuente de carbono.  

Residuos AE (UI.mL-1) EE ± Sig.
Endocelulasas Mananasas Endoxilanasas
Bagazo de caña 2,58cd 2,52bcd 9,32f ±0,14 P<0,0001
Afrecho de trigo 2,75d 2,15bc 25,08g
Cáscara de arroz 0,07a 2,07b 6,92e
Rastrojo de maíz 2,47bcd 2,19bc 6,95e

Letras distintas indican diferencias significativas según prueba de Duncan (P<0,05).

Gowdhaman et al. (2014) informaron al afrecho de trigo como el mejor inductor de endoxilanasas en una cepa de Bacillus, comparada con el bagazo de caña de azúcar, el maíz y la cáscara de arroz. Similares resultados obtuvieron Kaushik et al. (2014), Ho y Heng (2015) y Zhang y Sang (2015) en cepas de Aspergillus lentulus, Penicillium chrysogenum QML-2 y Bacillus subtilis, respectivamente.

La utilidad del afrecho de trigo como fuente de carbono se atribuye a su composición química, ya que 70 % de los polisacáridos no amiláceos son arabinoxilanos (Maes y Delcour 2002). Además, este residuo posee minerales, vitaminas y otros compuestos bioactivos que favorecen el crecimiento de los microrganismos (Babu et al. 2018).

Las características físicas de este subproducto benefician su uso como sustrato, pues se degrada fácilmente, ya que sus partículas poseen un extensa área superficial y buena retención de la humedad (Stevenson et al. 2015), lo que favorece el ataque microbiano.

El bagazo de la caña de azúcar es un buen sustrato para el desarrollo microbiano, debido a que en su composición los carbohidratos representan 70 %, aproximadamente. De estos, los xilanos son, después de los glucanos, los más importantes (Batalha et al. 2015). Por esta razón, diversos autores utilizan este residuo como inductor para la producción de endoxilanasas (Yang et al. 2015).

En la cáscara de arroz, procedente de los molinos artesanales, los xilanos ocupan, aproximadamente, 14 % (López 2013), lo que favorece también la producción de endoxilanasas. En este residuo, los arabinoxilanos son los grupos sustituyentes mayoritarios del xilano y se solubilizan fácilmente ( Vegas et al. 2008).

El rastrojo y otros residuos de maíz se informan como buenos inductores de endoxilanasas, ya que el contenido de xilano es de aproximadamente 40 % (Knob et al. 2014). Estos residuos se utilizan para la producción de estas enzimas por diferentes géneros microbianos, entre los que se incluye Bacillus (Ling 2014). La diferencia entre los valores de actividad endoxilanasa, obtenidos durante los procesos de fermentación, se puede relacionar con la accesibilidad del sustrato, la velocidad de hidrólisis, la cantidad de xilo oligosacáridos y de xilosa, liberados durante el metabolismo microbiano (El-Sharnouby et al. 2012), así como con la compleja estructura del xilano, que varía en función de la especie vegetal (Wang et al. 2014).

En cuanto a la producción de endocelulasas, los resultados muestran que no hay diferencias entre el uso del bagazo, el afrecho y el rastrojo de maíz, como fuentes de carbono. Estos residuos se informan en la literatura internacional como buenos inductores de estas enzimas. No obstante, Sadhu et al. (2013), Kazemi et al. (2014) y Gaur y Tiwari (2015) coincidieron en que el bagazo de caña fue la mejor fuente de carbono para la producción de endocelulasas durante la FES por Acinetobacter sp. KKU44, Bacillus vallismortis y Bacillus sp, respectivamente.

Con el uso de la cáscara de arroz se detectó baja actividad de la enzima. Sin embargo, Annamalai et al. (2013) informaron la utilidad de la cáscara y el rastrojo de arroz con buenos resultados en la producción de endocelulasas. Dhillon et al. (2011) encontraron elevada actividad endocelulolítica en Aspergillus niger, con el afrecho de trigo y la cáscara de arroz, solos y combinados.

La cáscara de arroz es una materia prima de gran interés para la producción de etanol celulósico en Cuba (Martín 2006). López (2013) comparó muestras de este residuo, procedentes de molinos artesanales y molinos industriales, y halló que la concentración de glucosa de la cáscara de arroz obtenida del molino artesanal es superior que la del industrial (33,5y 2,1 g. L-1, respectivamente). Este autor atribuyó este hecho a la presencia de glucanos fácilmente hidrolizables. Además, informó la presencia de hidroximetil furfural (0.3g. L-1) y ácido fórmico (0.2 g. L-1) en este residuo.

La baja actividad celulósica que se encontró con el uso de este subproducto podría estar asociada a la inhibición de la endocelulasas, debido a diferentes factores: la glucosa es el producto final de la acción del complejo de las celulasas y es, a su vez, el represor de su síntesis (Sukumaran et al. 2005). La presencia de compuestos fenólicos a bajas concentraciones, como el hidroximetil furfural, inhibe el complejo enzimático y causa su precipitación e inhibición (Kim et al. 2011). La eliminación de estos compuestos, mediante tratamientos previos a la cáscara de arroz procedente de los molinos artesanales, podría incrementar la producción de esta enzima.

Diversas investigaciones se desarrollan en aras de mejorar las tecnologías para la producción de celulasas microbianas, debido a sus complejos mecanismos de regulación metabólica. Entre las estrategias desarrolladas con estos fines, se destaca el uso de la FES y la utilización de métodos moleculares, como la mutagénesis, la ingeniería metabólica y la expresión de genes de celulasa a partir de diferentes dominios microbianos, con el propósito de mejorar la síntesis y propiedades catalíticas (Kuhad et al. 2016).

La producción de mananasas se favoreció durante la FES en los cuatro residuos, sin diferencias entre ellos. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por otros investigadores, quienes utilizaron el afrecho de trigo (Singh et al. 2010) y el bagazo de caña de azúcar (Chauhan y Gupta 2016) para la síntesis de estas enzimas. Ravindran et al. (2018) se refirieron a la capacidad que tienen varias especies del género Bacillus para producir enzimas que hidrolizan el manano. Estas se inducen, generalmente, en presencia de sustratos ricos en galactomananos (Yamabhai et al. 2016).

Otros residuos agroindustriales y lignocelulósicos se evaluaron en diversas investigaciones. Yin et al. (2013) utilizaron una mezcla de cáscara de manzana y semillas de algodón para producir mannanasa por Aspergillus niger cepa SN-09 en FES. Pangsri y Pangsri (2017) informaron valores de actividad enzimática de 0,80; 0.68 y 0.15 U.mL-1 con el uso de residuos de té y café molido. Generalmente, el bagazo de caña de azúcar, los residuos de soya, el galactomanano, la cáscara de plátano, mango y papa, se utilizan como excelentes inductores para la producción de estas enzimas Onilude et al. 2012 y Almeida et al. 2015.

Las mananasas son enzimas extracelulares e inducibles, y se consideran las segundas en importancia durante la hidrólisis de la hemicelulosa (Dhawan y Kaur 2007). Ellas catalizan la hidrólisis al azar los enlaces β-D-1,4 manopiranósidos de los β-1,4 mananos. La producción de mananasass se reduce a las bacterias Gram positivas, fundamentalmente algunas especies de Bacillus (Mabrouk y Ahwany, 2008 y Meenakshi et al. 2010).

Los resultados obtenidos en este estudio muestran mayor producción de endoxilanasas por B.subtilis E44, con respecto a endocelulasas y mananasas. Varios autores destacan el predominio de microrganismos xilanolíticos en diferentes géneros (Banka et al. 2014 y Gupta et al. 2015). No obstante, las síntesis de estas enzimas se podría incrementar con la aplicación de los métodos de optimización de las fermentaciones. Muchos autores informan producciones de enzimas, con incremento notable de las actividades, que varían entre 10 y 80 % con respecto al medio sin optimizar (Reis et al. 2015 y Zhang y Sang, 2015).

La posibilidad de disponer de metodologías para producir estas biomóleculas, a partir de materiales lignocelulósicos de fácil disponibilidad, favorece la disminución de los costos de producción de las mismas. La posibilidad de reutilizar residuos agroindustriales disminuye los efectos contaminantes del medio ambiente, asociados a su acumulación.

Las enzimas, que catalizan la hidrólisis de la celulosa y la hemicelulosa, se emplean como aditivos zootécnicos en la producción animal con resultados favorables. Entre sus beneficios se destaca la disminución de los efectos antinutricionales de los polisacáridos no amiláceos de las dietas y el incremento de la digestibilidad total. Estas enzimas además, complementan la actividad de las enzimas endógenas producidas por el animal y conducen a mejoras en la salud, al reducir las infecciones ocasionadas por patógenos como la Salmonela sp. y Clostridium sp. (Bedford 2018).

Conclusiones

Los resultados obtenidos en esta investigación indican las potencialidades del afrecho de trigo, el bagazo de caña de azúcar y el rastrojo de maíz para la producción de endocelulasas, endoxilanasas y mananasas. Con la cáscara de arroz se indujo la producción de endoxilanasas y mananasas, y no de endocelulasas.

La bacteria Bacillus subtilis E44 mostró potencialidades para producir en mayor cuantía enzimas endoxilanasas. El extracto de enzimas obtenido a partir de esta cepa podría ser utilizado como aditivo zootécnico para mejorar la calidad del alimento animal.

Agradecimientos

Se agradece al departamento de Producción Animal, de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León, en España, y a la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID), por el soporte financiero para la realización de estos estudios. Se expresa también gratitud a los colegas de la Estación Experimental de la Caña de Azúcar (EPICA), en Matanzas, Cuba, por su apoyo para la recolección del material, así como al Departamento de Bioestadística Aplicada del Instituto de Ciencia Animal (ICA) por la ayuda en el procesamiento de los datos.

REFERENCIAS

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Recibido: 03 de Abril de 2019; Aprobado: 26 de Noviembre de 2019

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