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Cuban Journal of Agricultural Science

Print version ISSN 0864-0408On-line version ISSN 2079-3480

Cuban J. Agric. Sci. vol.54 no.1 Mayabeque Jan.-Mar. 2020  Epub Mar 01, 2020

 

CIENCIA ANIMAL

Producción de enzimas lignocelulasas de Trichoderma viride M5-2 en salvado de trigo (Triticum aestivum) y purificación de sus lacasas

Elaine Cristina Valiño Cabrera1  * 

Maryen Alberto Vázquez1 

J. C. Dustet Mendoza2 

Nereyda Albelo Dorta1 

1Instituto de Ciencia Animal (ICA). Carretera central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

2Facultad de Ingeniería Química, Universidad Tecnológica de la Habana “José Antonio Echeverría” (CUJAE). La Habana, Cuba.

Resumen

Esta investigación describe la producción de enzimas lignocelulasas del Trichoderma viride M5-2 en salvado de trigo (Triticum aestivum) y la purificación de sus lacasas. El proceso de fermentación se realizó en el salvado de trigo durante 7 días y se tomaron muestras cada 24 h. Se realizó el ensayo enzimático (endo, exo β1,4 glucanasa, xilanasas y lacasas). La actividad de la lacasa se determinó por espectrofotometría, por oxidación de siringaldazina en condiciones aeróbicas, y la lignina peroxidasa por dimerización oxidativa dependiente de H2O2 de 2,4-diclorofenol. El crudo enzimático se concentró por filtración de la membrana con un flujo de nitrógeno y se purifico a través de cromatografía de intercambio iónico con matriz de DEAE. Se midieron los indicadores de purificación y el rendimiento de la enzima. Con las condiciones de fermentación del salvado de trigo se obtuvo un aumento continuo de la producción de endo β 1,4 glucanasa and xilanasas después de 72 h y de exo β1, 4 glucanasa a las 48 h. Además, la actividad enzimática de la lacasa se supervisó a las 24h y la lignina peroxidasa tras 48 h d fermentación. El hongo T. viride M5-2 alcanzó su máxima producción de lacasas después de 2 días de fermentación y a través del sistema propuesto de purificación, se obtuvo un producto enzimático con factor de purificación de 12, sin afectar el rendimiento enzimático. Se concluye que la cepa de T. viride tiene la capacidad de producir un complejo de enzimas ligncelulticas en el salvado de trigo. El método de separación utilizado para purificar las enzimas lacasas es efectivo. Se recomienda añadir etapas adicionales de purificación, en dependencia del grado de pureza.

Palabras clave: ligninasa; hongos; lignina; celulasas; xilanasas

Introducción

Aunque existen investigaciones por todo el mundo enfocadas en la producción de ligninasas de hongos bacidiomicetos, como método biológico para reducir el contenido de lignina en la biomasa (Janusz et al. 2015), aun escasean las respuestas a muchas preguntas acerca de cómo obtenerlas. Específicamente, es necesario estudiar otras especies potenciales de hongos para la síntesis y producción de ligninasas (Brijwani et al. 2010), como es el caso de la Trichoderma.

Las especies de Trichoderma están ampliamente distribuidas en todas las latitudes, y se encuentran naturalmente en diversos ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos de plantas en descomposición. Tienen la habilidad de producir varios metabolitos y adaptarse a múltiples sustratos y condiciones ambientales. Esto posibilita que el género Trichoderma pueda utilizarse en la industria biotecnológica.

Las lacasas que generalmente provienen de hongos están acompañadas de otros tipos de compuestos como los isoformes, proteasas, celulasas y otros compuestos derivados de la producción de extracto crudo (Jía et al. 2019). Existen muchos métodos para la separación y purificación de lacasas de los extractos crudos de hongo. Entre estos métodos se podrían mencionar los de cromatografía, centrifugación, formación de fase, precipitación y filtración. Estos se utilizan en dependencia del objetivo que se persiga con la proteína purificada, tanto la identificación o mejoría de los procesos posteriores (Camperi et al. 2014 y Borges et al. 2019).

La cepa mutante identificada en estudios anteriores como Trichoderma viride M5-2 tiene la capacidad de biotransformar substratos altamente lignocelulíticos como el bagazo de caña (Valiño et al. 2004) y otras especies de leguminosas temporales (Valiño et al. 2015ab), donde se cuantificó la producción de sus enzimas celulasas. Sin embargo, el estudio de la producción de enzimas lignocelulíticas de este hongo no se ha profundizado para estudios de inducción enzimática por interacciones biológicas con otros hongos altamente productores de lacasa en el salvado de trigo. Estos estudios se centran en la importancia industrial para aplicaciones biotecnológicas (Zhao et al. 2018 y Junior et al. 2020).

Por esta razón, es necesario dilucidar y definir las metodologías, indicadores de diseño y condiciones de funcionamiento para separar, concentrar y purificar enzimas lignolíticas sintetizadas por esta cepa. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue analizar la producción de enzimas lignocelulasas de Trichoderma viride M5-2 en el salvado de trigo y la purificación de sus lacasas.

Materiales y Métodos

Microorganismo. Se utilizó la cepa lignocelulolítica mutante de T. viride, identificado como hongo M5-2, perteneciente a la colección de cepas del Departamento de Biotecnología del Instituto de Ciencia Animal (Sosa et al. 2017).

Condiciones de cultivo. La cepa del hongo se cultivó en una placa con un medio de papa-dextrosa-agar (PDA). Se incubó por 7 días a una temperatura de 30 ºC. Después de este período, pasó a un medio enriquecido para hongos, de acuerdo con la tabla 1.

Tabla 1 Composición del medio enriquecido para el crecimiento de los hongos  

Medio de cultivo Cantidad (1L)
Glucosa 10 g
Fosfato de potasio 2 g
Sulfato de magnesio 0.5 g
Extracto de malta 3.5 g
Extracto de levadura 2 g
Bactopeptona 0.1g
Solución de sales metálicas 1.0mL
Sulfato de cobre 0.5 mg
Sulfato de magnesio 0.16 mg
Sulfato de zinc 1.14 mg
Cloruro de cobalto 0.29 mg

Proceso de fermentación. Se extrajo una alícuota de 5 mL de los medios enriquecidos y se inoculó en un frasco que contenía 3 g de salvado de trigo (tabla 2) y 100 mL de una solución tampón de citrato (50 mM, pH 5.0). Los cultivos líquidos se incubaron en una centrífuga orbital a 120 rpm durante 10 días a 30 °C. Se tomaron muestras de la fermentación cada 24 horas, se filtraron a través del embudo Büchner, y el líquido resultante se centrifugó (10,000 rpm, por 3 min a 4 ° C) y reservó para su posterior análisis.

Tabla 2 Descripción por cada 40 gramos de salvado de trigo altamente fibroso  

Contenido Gramos
Proteínas 6.0
Grasas 1.5
Carbohidratos disponibles 18.0
Azucares 7.0
Fibra dietética 11.0
Sodio 0.11

Ensayo de las actividades de celulasa enzimática (endo β1,4-glucanasa y exo β1,4-glucanasa). La actividad endo β1,4-glucanasa (CMCasa) se determinó en el sustrato de carboximetilcelulosa y la exo β1,4-glucanasa (PFasa) en celulosa cristalina. Se calcularon y expresaron en unidades internacionales por mililitro (U/mL). Esta actividad refiere los micromoles de glucosa liberados por minuto de reacción en las condiciones de ensayo de la actividad (Mandels et al. 1976). El contenido de azúcares reductores liberados se determinó por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (Miller 1959).

La actividad de xilanasa se determinó mezclando 0,9 mL de xilano de madera de abedul al 1% (p/v) (preparado en solución tampón de citrato de sodio 50 mM, con pH 5,3) con 0,1 mL de enzima adecuadamente diluida, y la mezcla se incubó a 50 °C durante 5 min (Bailey et al. 1992). La reacción se detuvo por la adición de 1,5 mL de 3,5 ácido dinitrosalicílico (DNS) y el contenido ebulló durante 5 minutos (Miller 1959). Después de enfriar, el color desarrollado se leyó a 540 nm. La cantidad de azúcar reductora liberada se cuantificó usando xilosa como estándar. Una unidad de actividad de xilanasa se definió como la cantidad de enzima que libera 1 mol de xilosa por minuto en el ensayo.

El ensayo enzimático de la actividad de lacasa y lignina peroxidasa se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por Kumar et al. (2016). Las muestras se tomaron de la fermentación sumergida de salvado de trigo como se describió anteriormente.

La actividad de la lacasa se determinó por espectrofotometría, por la oxidación de siringaldazina en condiciones aeróbicas. El color violeta producido se midió a 530 nm. Las condiciones analíticas en las que se desarrolló fueron 5 mM de siringaldazina, 50 mM de solución tampón de citrato, pH 4,5, 30 ° C y 1 minuto de tiempo de reacción. Una unidad de lacasa (U) representa la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1,0 mmol de siringaldazina por minuto en estas condiciones. La lignina peroxidasa se determinó mediante la dimerización oxidativa dependiente de H2O2 de 2,4-diclorofenol a 25 ° C, donde la mezcla de reacción contenía 26 mM de 4-amino-antipirina, 20 mM de 2,4-diclorofenol y 3 mM de H2O2 en 20 mM con pH de 4.5 de succinato de sodio. El cambio en la absorbancia se controló a 510 nm (ε = 1.85x104 M-1cm-1).

Estimación de proteínas. La concentración de proteínas se determinó en las diferentes horas de fermentación y después de cada paso del proceso de purificación por el método de Bradford, con el uso de una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) (AOAC 2005).

Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar donde las diferencias en pH, actividad enzimática, productividad y humedad se midieron con respecto a los tiempos de fermentación. Toda la determinación se realizó con tres repeticiones, donde cada Erlenmeyer constituyó una unidad experimental. Para el procesamiento de los resultados, se realizó una clasificación simple con el sistema estadístico INFOSTAT (di Rienzo et al. (2012). Las diferencias entre medias se establecieron según la dócima de Duncan (1955).

Purificación de lacasa del hongo T. viride M5-2 (Gagaoua y Fafil 2016). A partir de la cinética de producción de lacasa, establecida para la cepa, el tiempo de fermentación de mayor producción de esta enzima se utilizó para obtener más extracto para realizar el proceso de purificación. De acuerdo con esto, se preparó 1 L de medio líquido, que se inoculó con una proporción igual de 5 mL de inóculo del hongo por 100 mL de medio. Después del tiempo de fermentación, el cultivo se filtró con una gasa estéril y se centrifugó a 1400 rpm durante 1 minuto. El sobrenadante se sometió nuevamente a un análisis de la enzima lacasa y se midió la concentración de proteína. El extracto enzimático se concentró por filtración, con un filtro de membrana Pellicon® XL de 30 KDa (Millipore, Alemania) y se realizaron cinco lavados con solución tampón de fosfato (10 mM, pH 7).

Cromatografía de intercambio aniónico. La cromatografía de intercambio aniónico se desarrolló de acuerdo con la metodología propuesta por Janson (2011). La muestra se aplicó a una columna de flujo rápido de sepharose de intercambio aniónico DEAE en una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) BioRad, Estados Unidos. La resina se empaquetó en una columna de 20 cm por 1 cm hasta un volumen de 15 mL. Esta se balanceó con tres volúmenes de tampón A (acetato de sodio 10 mM, pH 5) a una tasa de flujo de 3 mL/min. Después de la aplicación de la muestra, se siguió un programa de gradiente por pasos desde 100 a cero por ciento de tampón A, con el aumento consiguiente en el tampón B o tampón de elución (acetato de sodio 10 mM, pH 5 con 2 de cloruro de sodio molar). Se colectaron fracciones de 3 mL durante toda la ejecución del programa. Cada una de las fracciones recogidas se dializó y se concentró en un dispositivo Amicon® Ultra quince, Alemania, y la actividad de lacasa se analizó con siringaldazina como sustrato. Las fracciones positivas se agruparon y se concentraron con el dispositivo Amicon® para calcular los indicadores de purificación y actividad específica.

Indicadores de purificación (factor de purificación y rendimiento enzimático). A partir de los valores de actividad enzimática y concentración de proteínas, los indicadores de purificación se calcularon como:

[TeX:] Factor de purificación (PF) = actividad específica n / actividad específica inicial

[TeX:] Rendimiento enzimático (%) = Actividad enzimática n / actividad enzimática inicial x 100

Resultados y Discusión

Actividad enzimática celulolítica y xilanolítica. La figura 1 muestra las determinaciones de la actividad celulolítica endo y exo β 1,4-glucanasa y xilanasas en medio sólido sumergido en salvado de trigo con las condiciones de pH y temperatura establecidas para esta fermentación p <0,0001. La producción máxima alcanzada para exo β 1,4-glucanasa fue de 0.222 U / mL a las 48 h. Sin embargo, para endo β 1,4-glucanasa y xilanasas estas condiciones favorecen su producción cuando la fermentación sobrepasa las 72 h, con 0.214 y 0.31 U / mL, respectivamente.

Figura 1 Actividad celulolítica de endo β1, 4 glucanasa (P <0.0001, EE ±0.0013) y exo β 1,4 glucanasa (P <0.0001, EE ±0.0033) y xilanasa (P <0.0001, EE ±0.0021) de T. viride M5-2 en medio sumergido de salvado de trigo. Los valores máximos de actividad se obtuvieron a 30ºC. 

Las diferencias entre la producción máxima de enzimas y los valores bajos encontrados en relación con el tiempo de fermentación sugieren que pueden estar relacionados con la composición química del salvado de trigo que no favorece la acción de la exoglucananasa y del resto. Esto requiere una justificación experimental adicional.

La producción de celulasa en cultivos se asocia con el crecimiento y varios indicadores, que incluyen la naturaleza del sustrato celulósico, el pH del medio y la disponibilidad de nutrientes, influyen en ella. Además, la producción a gran escala de celulasas requiere comprensión y control del crecimiento y de las capacidades de producción enzimática (Singhania et al. 2017). Sin embargo, esto es extremadamente complicado porque muchos factores y sus interacciones pueden afectar la productividad de la celulasa. La formulación de medios para la fermentación es motivo de gran preocupación porque ninguna composición general puede proporcionar el crecimiento óptimo y la producción de celulasa. Amorim et al. (2019) propusieron al salvado de trigo licuado como fuente de carbono e inductor en el cultivo sumergido con alto contenido de sólidos para la producción de xilanasa. Los resultados del sinergismo enzimático mejoraron el rendimiento de azúcares reductores y depende de la composición de enzimas y las características ultraestructurales del sustrato (Meehnian et al. 2017). Estas características algunas veces se alteran en presencia de aditivos (Obenga et al. 2017).

Este resultado difiere de la fermentación en bagazo de caña en términos de tiempo de producción de la enzima, donde la actividad celulolítica es mayor. La principal limitación técnica en la producción fermentativa de celulasas continua siendo el aumento de los tiempos de fermentación con baja productividad (Van Dyk y Pletschke 2012 y Singhania et al. 2017). La cepa candidata para los procesos fermentativos de producción enzimática es aquella que pueda expresar su capacidad máxima durante las primeras horas de fermentación, ya que esto reduce el tiempo de trabajo y optimiza el proceso, como en los resultados de este estudio (Valiño et al. 2016a b).

Actividad enzimática lacasa y peroxidasa. La figura 2 muestra los resultados del ensayo de actividad enzimática de la lacasa. La mayor producción de lacasas se alcanzó a las 48 h de fermentación sumergida en salvado de trigo, con 0.22 U/mL. Para ser un hongo conidial, tiene una producción importante de enzimas en un tiempo corto de incubación.

Figura 2 Actividad de lacasa de T. viride M5-2 en un medio sumergido de salvado de trigo, con cinética de fermentación de 250h (EE ±1, 07; P<0, 0001) 

Estos valores son similares a los informados en algunos basidiomicetos. Según Ozcirak y Ozturk (2017), los patrones de producción de enzimas ligninolíticas en Pleurotus (excelente degradador de lignina), durante un período de 23 días a 25 °C, en fermentación en estado sólido usando cáscara pretratada de papa, fueron de 6 708.3 ± 75 U/L de lacasa y 2 503.6 ± 50 U/L de manganeso peroxidasa.

La degradación de la lignina se catalizó por un complejo extracelular producido por algunos hongos, cuando se expusieron a condiciones limitantes de nutrientes en el medio de cultivo (Pollegioni 2015). Este complejo se compone de tres enzimas ligninolíticas involucradas en la degradación de lignina, peroxidasa de manganeso (MnP), peroxidasa de lignina (LiP) y lacasa (Selvam et al. 2003 y Rybczyńska y Korniłłowicz 2017).

Según Moreno (2013) y Rezaei (2017), el proceso de delignificación puede aumentar la accesibilidad de las enzimas al aumentar el número de poros y el área de superficie accesible, mejorando así los rendimientos de hidrólisis enzimática (Oliva et al. 2015).

La actividad de la lacasa se puede detectar en los bioensayos de lignina como única fuente de carbono, aunque las pruebas analíticas para la determinación de la lignina los convierten en costosos. Sin embargo, otros compuestos orgánicos como la siringaldazina, utilizada en este estudio, también son sustratos de otras enzimas modificadoras de lignina, como la lignina peroxidasa, donde la actividad se revela fácilmente por un cambio en la coloración del medio de cultivo (Mehandia et al. 2020).

Los resultados del ensayo para detectar la peroxidasa de lignina no mostraron actividad rápidamente. Los cambios notables en la coloración del sustrato se manifestaron después de 5 minutos de la reacción enzimática (figura 3). Esto indica que la lignina peroxidasa está en una concentración más baja en comparación con la lacasa, probablemente debido al tiempo de fermentación y a las condiciones del ensayo de actividad de la peroxidasa.

Figura 3 Actividad de la peroxidasa de T. viride M5-2 en un medio sumergido de salvado de trigo, con cinética de fermentación de 230h (EE ±0.0021; P<0, 0001) 

La cinética de la producción de peroxidasa por la cepa T. viride M5-2 es diferente de la cinética de producción de lacasa (p <0.0001), posiblemente debido a los diferentes mecanismos de acción de estas enzimas donde la lignina peroxidasa es capaz de actuar directamente en los desechos fenólicos (Guerberoff y Camusso 2019) y no fenólicos (Kumar et al. 2016) de la lignina, mientras que las lacasas, a través de una reacción secundaria de peroxidación lipídica, también pueden actuar en los desechos no fenólicos (Moreno 2013).

Purificación de lacasa. El concentrado enzimático obtenido de la fermentación del salvado de trigo con la cepa T. viride M5-2 se trabajó de acuerdo con una metodología de purificación de lacasa. En este proceso se conoce que tienen un punto isoeléctrico ácido, por lo que es posible purificarlos a pH superior a este, mediante el uso de cromatografía de intercambio iónico.

En este estudio, se utilizó una matriz de DEAE sepharose cargada positivamente, que permitió que la enzima se cargara negativamente por encima de su punto isoeléctrico y pudiera adherirse a la matriz, y como consecuencia, pudiera eluirse por la variación del pH o la fuerza iónica.

Durante el estudio, se observaron diferentes bandas asociadas con la presencia de lacasas en las columnas de intercambio, por lo que la prueba de actividad de esta enzima se realizó en las diferentes fracciones recogidas. De acuerdo con la prueba en placa, se determinó que el hongo T. viride M5-2 fue capaz de oxidar sustratos fenólicos como siringaldazina y tiene dos tipos de lacasas. Las primeras ocho fracciones recolectadas tienen una gran actividad enzimática y las fracciones del dieciocho al veintisiete tienen otro tipo de lacasa con menor actividad.

Las fracciones con actividad lacasa eluidas, mostraron diferentes comportamientos cromatográficos que podrían estar estrechamente asociados a su estructura. Las primeras ocho fracciones, así como las fracciones del dieciocho al veintisiete, se unieron para formar dos nuevas fracciones llamadas fracción I y fracción II, las cuales se concentraron nuevamente por filtración de membrana con corriente de nitrógeno.

Se encontró que la fracción enzimática I mostró mayor actividad de lacasa que la fracción enzimática II más retenida, debido a la baja actividad de esta fracción. Los indicadores de purificación de lacasa de T. viride M5-2 se determinaron con la fracción I como se muestra en la figura 4.

Figura 4 Indicadores del proceso de purificación de la fracción I de la actividad de lacasa de T. viride M5-2. CE: extracto crudo, PL: lacasa purificada, Pc: contenido de proteina (EE ± 0.10), Ea: Enzymatic activity (EE ± 5.68), Sa: Specific activity (EE ± 1.05), PF: Purification factor, Y: Yield, The significance was the same for all the parameters evaluated (P <0.0001) 

La actividad específica del extracto enzimático en esta fracción se incrementó al lograr la eliminación de gran parte de las proteínas contaminantes y al alcanzar un factor de purificación de más de doce, lo que indica que esta fracción es doce veces más pura que la preparación inicial. El esquema de purificación utilizado en este estudio no permitió comprometer el rendimiento de la enzima, obteniendo un valor de 182 %.

Con respecto al comportamiento general del proceso, este estudio coincide con los resultados propuestos por Gagaoua y Hafid (2016) quienes obtuvieron rendimientos mayores al 100% con factores de baja purificación, lo que se asocia con la presencia de lacasa como proteína predominante. Sin embargo, hay extractos crudos que tienen una alta concentración de proteínas que no son precisamente la proteína de interés, donde la presencia de más contaminantes afecta el desempeño del proceso. Liu et al. (2015) reportaron rendimientos por debajo de 70% por estas razones.

Otro aspecto que debe destacarse es el uso de salvado de trigo como materia prima para producir enzimas ligninasas y la selección del sistema de fermentación en medio sólido sumergido que garantiza un proceso de obtención más rápido y sencillo. También es necesario señalar la efectividad del sistema de purificación utilizado en este estudio en la separación selectiva de las enzimas lacasa presentes en los crudos.

Existen varios métodos que se utilizan para la separación y purificación de las lacasas a partir de extractos crudos de hongos. Estos incluyen métodos cromatográficos, ultra centrifugación, formación de fases, precipitación y ultrafiltración. Estos métodos se usan en dependencia de la utilidad que se persigue con la proteína purificada, ya sea para identificar o mejorar un proceso posterior (Camperi et al. 2014).

Para seleccionar el método específico de purificación para las lacasas, deben tenerse en cuenta factores como disponibilidad de aplicación, conservación de la actividad enzimática, eficiencia de purificación y cantidad de proteína purificada. Con estos factores, se descarta inicialmente la centrifugación para separar la lacasa porque este método es ideal para separar las enzimas de los restos de biomasa en el extracto enzimático y para analizar estructuras y tiempos variables de separación. Sin embargo, el uso de este método genera fases donde se encuentra la proteína diana con otras proteínas de peso molecular similar, lo cual crea confusión. Además, se producen modificaciones estructurales de la proteína, lo que afecta el comportamiento de la actividad enzimática (Shi 2016).

Es importante resaltar que los métodos cromatográficos son los más utilizados para purificar enzimas, pero algunas veces los rendimientos no son tan altos. Esto es un problema, especialmente si se trata de utilizar la enzima purificada en procesos de pretratamiento de material lignocelulósico. En general, estos métodos se emplean para identificación y estudio molecular de proteínas (Camperi et al. 2014). Sin embargo, los resultados de la presente investigación muestran un factor de purificación que permite que la enzima se concentre sin afectar el rendimiento, aspecto que es importante para proponer esta metodología de trabajo en la purificación de lacasas en esta especie.

Se concluye que la cepa T. viride tiene la capacidad de producir el complejo enzimático lignocelulolítico en el salvado de trigo. El método de separación utilizado para purificar enzimas lacasas es efectivo. Se recomienda agregar pasos sucesivos de purificación dependiendo del grado de pureza.

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Recibido: 14 de Mayo de 2019; Aprobado: 30 de Mayo de 2019

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