CIENCIA ANIMAL

Efecto de un producto fermentado seco (PFS) en indicadores morfológicos, inmunológicos, de salud e histológicos de pollos de ceba

0000-0001-9880-0310Lourdes Savón^{1  *}  , B. Sánchez¹  , A. Elías †¹  , H.J. Ortega †¹  , M. Gutiérrez²  , Idania Scull¹  , Magalys Herrera¹ 

¹Instituto de Ciencia Animal, km 47 ½ Carretera Central, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Código Postal 32700

²Centro de Producción de Animales de Laboratorio, Calle Tercera 407593 entre Sexta Carretera Tirabeque, Boyeros, La Habana, Cuba

Resumen

Se utilizaron 32 pollos híbridos machos EB₂₄ de 42 días de edad para determinar indicadores morfológicos, inmunológicos, de salud e histológicos al incluir en la dieta un producto fermentado seco (PFS) que se elaboró a partir del contenido de rumen. Las aves se distribuyeron según diseño completamente aleatorizado con 8 repeticiones por tratamiento: control de maíz/soya y tres dietas experimentales con inclusión de 1, 2 y 3% del PFS. Se determinaron los indicadores morfológicos (pesos relativos, g/gPVx100) de los órganos digestivos, accesorios del tracto gastrointestinal (TGI), inmunológicos (bazo, timo y bolsa de Fabricio) e histológicos. También se analizaron indicadores de salud (hematocrito) y las concentraciones séricas de proteínas totales, ácido úrico, colesterol, triglicéridos y glucosa. El PFS no alteró los pesos relativos de los órganos del TGI lleno y vacío, de los órganos accesorios, y linfoides. Se halló incremento del peso relativo del bazo (P=0.0693) en las aves que recibieron hasta el 3% del PFS, que se correspondió con incremento del hematocrito. Los indicadores del metabolismo proteico, no variaron con la inclusión del PFS, el que influyó en el metabolismo energético con incremento P<0.0091 (mmol/L) 6.85 vs 9.52 y 10.21 de la glucosa sérica para el 2y 3% del PFS con una disminución P<0.0032 (mmol/L) 0.84 vs 0.52 y 0.54 de los triglicéridos en comparación con el control. Se observó la elongación de las vellosidades de la mucosa del intestino delgado y una hiperplasia de los tonsiles cecales, lo que pudiera indicar la mejor absorción de nutrientes y posible efecto inmunoestimulante. Se sugiere que la inclusión de hasta 3% de PFS en la dieta de pollos de ceba basada en maíz/soya, resulta favorable para indicadores de salud e histológicos de estos animales

Palabras-clave: fermentación; contenido de rumen; órganos linfoides; histología; pollos de ceba

Introducción

El contenido del rumen es un subproducto que se obtiene del sacrificio de ganado bovino el cual al momento de su muerte contiene todo el material que no alcanzó a ser digerido. Posee un balance completo de aminoácidos, grasa, minerales y vitaminas del complejo B y vitamina C, además de algunos factores de crecimiento no identificados (^{Sugiarto 2014}) y por años se ha desechado y produce alto impacto ambiental debido a su alta carga orgánica. Este residuo también posee gran cantidad de microorganismos que viven en simbiosis en el rumen como hongos, protozoos y bacterias (^{Dairio et al. 2005}) y pueden ser aprovechados. Por esto se puede decir que es una alternativa para la alimentación de, pollos y cerdos de engorde, conejos y rumiantes por sus características químicas, biológicas, bromatológicas y su amplia disponibilidad (^{Ríos and Ramírez 2012}).

Por otra parte, la fermentación es una de las tecnologías más antiguas que se ha utilizado para la mejorar la calidad de los alimentos (^{Kim 2012}) En la actualidad, se producen una gran variedad de productos fermentados que se utilizan en la alimentación animal (Youling et al. 2011, Douyan 2015 y Beruvides 2018).

El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de un producto fermentado seco (PFS) obtenido a partir de contenido de rumen, en indicadores morfológicos, inmunológicos de salud e histológicos de pollos de ceba

Materiales y Métodos

Elaboración del PFS. El producto fermentado seco (PFS) se elaboró a partir de la mezcla del producto fermentado líquido (PFL) con harina de maíz (1:1) peso ̸ volumen (p ̸ v) según el procedimiento de ^{Gutiérrez (2005)}. El producto se secó al sol durante 48-72 h (Solano et al. 2003) y se removió cada dos horas de forma manual, para evitar el desarrollo de reacciones indeseables. Una vez seco el producto, el lote se envasó en dos sacos de papel para su utilización posterior. Se tomaron tres muestras de 500 g de cada saco del producto seco que se elaboró en el julio de 2015 en el Laboratorio de Producción de Alimentos del departamento de Ciencias Biofisiológicas, del Instituto de Ciencia Animal. El muestreo se realizó tomando el producto de tres lugares de los sacos (bajo, medio, arriba) y se mezclaron para conformar una muestra. El proceso se repitió tres veces en cada saco, para obtener en total seis muestras (tres de cada saco) Posteriormente, el PFS se pasó por un molino de martilló para obtener un tamaño de partícula de un milímetro

Análisis químico. El análisis químico, se realizó de acuerdo con la metodología de la ^{AOAC (2010)}. Se realizaron determinaciones de proteína verdadera según Bernstein (1924) modificado por ^{Meir (1986)}. El fraccionamiento de la fibra (fibra detergente neutro, fibra detergente ácido, lignina y celulosa) se determinó según el procedimiento de ^{Van Soest et al. (1991)}. El calcio, magnesio y potasio se determinaron por espectrofotometría de absorción atómica. El fósforo se determinó por ^{Amaral (1972)}.

Animales y dietas. Se utilizaron 32 pollos de ceba machos (EB₂₄) de 35 días de edad que procedieron de un experimento de comportamiento productivo. Los animales se distribuyeron en cuatro tratamientos experimentales. Estos fueron:1) tratamiento control (sin el alimento fermentado) y tratamiento II, III y IV con el 1, 2 y 3% del PFS, respectivamente. Durante todo el tiempo de experimentación los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento. Las dietas experimentales se formularon según los requerimientos de ^{Rostagno (2011)} y se muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Composición de las dietas experimentales. Pollo de ceba Etapa de acabado (36-42 días). 

Ingredientes	Tratamientos
	Maíz/soya	Maíz/soya 1% PFS	Maíz/soya 2%PFS	Maíz/soya 3% PFS
Harina maíz	62,4	61,523	60,068	59,068
Harina de soya	30,018	29,615	29,68	29,677
Producto Fermentado Seco	0	1	2	3
Aceite vegetal	3,6	4	4,5	4,6
Fosfato monocálcico	1	0,95	0,95	0,95
Carbonato calcio	1,2	1,11	1	0,9
Sal común	0,45	0,45	0,45	0,45
Metionina	0,152	0,157	0,162	0,165
Lisina	0,05	0,065	0,06	0,06
Colina	0,13	0,13	0,13	0,13
Premezcla^2	1	1	1	1
Aporte calculado (%)
PB	18	17,99	18	18
FB	2,68	2,64	2,62	2,61
EM^1	12.97	12.95	12.94	12.84
P disp.	0,326	0,32	0,32	0,32
Ca	0,717	0,713	0,712	0,715
Met+Cist	0,708	0,706	0,707	0,707
Lis	0,99	0,99	0,99	0,986
Na	0,2	0,2	0,2	0,2

¹ Se expresó en Mj/kg

²Each kg contains vitamin A, 13,500 IU; vitamin D3, 3,375 IU; vitamin E, 34 mg; B2, 6 mg; panthotenic acid, 16 mg; nicotinic acid, 56 mg; Cu, 2,000 mg; folic acid, 1.13mg; vitamin B12, 32µg; Mn, 72 mg; Zn, 48mg

A los 42 días de edad se seleccionaron 8 aves por tratamiento para el tratamiento control y 6 para los tratamientos experimentales, se pesaron y se les determinaron los indicadores que muestra el procedimiento experimental siguiente:

Indicadores morfométricos de órganos digestivos, accesorios e inmunológicos. Las aves se sacrificaron dos horas y treinta minutos después de la ingestión de alimento por el método de desangrado de la vena yugular descrito por ^{Sánchez (1990)}. Posteriormente, se abrió la cavidad abdominal y se extrajeron los órganos accesorios (hígado y páncreas) y el tubo digestivo. Este último se dividió para su análisis en buche, proventrículo, molleja, intestino delgado, ciegos y porción final (colon y recto). También se extrajeron los órganos inmunológicos (timo, bazo y bolsa de Fabricio).

Los órganos digestivos se pesaron llenos y vacíos (se eliminó el contenido digestivo desplazando los dedos índice y pulgar para vaciarlos) en una balanza técnica marca SARTORIUS. Los datos de los órganos digestivos, accesorios e inmunes se expresaron como peso relativo (g de órgano/g peso vivo x100). El peso vivo (PV) se estableció en el momento de sacrificio (^{Giambrone 1996})

Indicadores de salud y de la bioquímica sanguínea. La muestra de sangre se tomó directamente de la vena yugular, inclinando ligeramente el tubo de colección, de forma que ésta ruede por las paredes. De esta forma se evita la hemólisis del suero que se utilizará posteriormente. Se utilizaron dos juegos de tubos de colección; uno para la determinación de sangre total y otro para la obtención del suero. La sangre total se colocó a temperatura ambiente hasta lograr la retracción del coágulo. Posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante cinco minutos con el objetivo de obtener el suero. El hematocrito se determinó directamente de la sangre total mediante el método de ^Wintrobe.

Los indicadores de la bioquímica sanguínea; colesterol, glucosa, triglicéridos, proteínas totales, albúmina y ácido úrico se determinaron en el suero sanguíneo mediante un analizador automático Cobas integra 400PLUS (Roche Diagnostic System).

Análisis histológico. Para el examen microscópico se tomaron ocho muestras de 1 cm² de cada órgano para el tratamiento control y seis de cada órgano para los tratamientos restantes, (1, 2 y 3% PFS). Todas las muestras se conservaron en formol al 4% para el análisis histológico y se agitaron suavemente para eliminar restos de contenido intestinal adherente. El proceso de fijación consistió en la deshidratación con soluciones escalonadas de etanol (50, 70, 80, 96 y 100%), la limpieza con xilol. Los órganos se tallaron adecuadamente (^{CENPALAB 2000}) y se incluyeron en parafina (POT.05.03.003). Posteriormente se cortaron ^{CENPALAB (2000a} (POT.05.03.005) con la utilización del equipo diseñado para tal efecto (micrótomo). Los cortes se extendieron en láminas y a continuación se procedió a la tinción de rutina hematoxilina-eosina (^{Scheure y Chalk 1986}) (POT.05.03.015) (^{CENPALAB 2000b}) Las secciones histológicas se examinaron con un microscopio óptico Axioplan-2 (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania).

Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro tratamientos que consistieron en las dietas experimentales y ocho repeticiones/ tratamiento. Para el análisis de los resultados se utilizó el paquete estadístico computarizado INFOSTAT 2012 (^{Di Rienzo et al.2012}). Los valores medios se compararon mediante la dócima de ^{Duncan (1955)} en los casos necesarios.

Resultados y Discusión

No se observaron diferencias entre los tratamientos empleados para el peso vivo. Este resultado pudiera estar relacionado con el consumo de alimentos, que no difirió entre tratamientos, es decir, el PFS no influyó en este indicador. No se observaron diferencias en los índices morfométricos de los órganos del TGI lleno y vacío de los pollos de ceba que consumieron diferentes niveles de PFS (tablas 2 y 3).

Tabla 2 Peso relativo (g/g PVx100) de los órganos digestivos llenos del tracto gastrointestinal de pollos de ceba que consumen PFS. 

Indicadores	Niveles de PFS %				±EE y Sign
	Control (0)	1	2	3
Peso vivo, g	1959,33	2048,33	1991,61	2023,33	71,38 P=0.8095
TGI	9,19	9.70	9,01	8.76	0,35 P=0,3182
Buche	0,55 0,09	0,58 0,08	0,51 0,08	0,50 0,089	P=0,9190
Proventrículo l	0,63	0,60	0,56	0,54	0,03 P=0,4123
Molleja	3,20	2,67	2,49	2,81	0,26 P=0,2891
Intestino delgado	3,98 0,18	4,21 0,21	3,96 0,18	3,86 0,18	P=0,6524
Ciegos	0,81	1,05	0,78	0,88	0,10 P=0,2679
Colon -Recto	0,31	0,27	0,22	0,27	0,03 P=0,4695

Tabla 3 Peso relativo (g/g PVx100) de los órganos digestivos vacíos del tracto gastrointestinal de pollos de ceba que consumen PFS. 

Indicadores	Niveles de PFS %				±EE y Sign
	Control (0)	1	2	3
Peso vivo, g	1959,33	2048,33	1991,61	2023,33	71,38 P=0.8095
TGI	6,69	5,56	6,17	6,35	0,36 P=0,2102
Buche	0,36 0,04	0,39 0,04	0,37 0,04	0,38 0,04	P=0,9676
Proventrículo	0,59	0,54	0,53	0,49	0,39 P=0,4221
Molleja	2,29	1,96	1,99	2,17	0,14 P=0,3161
Intestino delgado	3,15 0,14	3,15 0,15	3,00 0,14	2,97 0,14	P=0,6770
Ciegos	0,43	0,43	0,46	0,49	0,04 P=0,7294
Colon -Recto	0,23	0,20	0,19	0,23	0,02 P=0,5995

Al respecto, ^{Gutiérrez (2005)} tampoco encontró efecto en los pesos relativos de los órganos digestivos vacíos del tracto gastrointestinal de pollos de ceba que recibieron dosis de 0,5, 1.0, 1.5 y 2% de un producto fermentado seco (Vitafert).

El peso relativo de los órganos accesorios del TGI también fueron similares entre tratamientos (tabla 4).Ello significa que el PFS no incrementa las funciones específicas de estos órganos en la liberación de enzimas para digerir y absorber los nutrientes y en la excreción de bilis y el metabolismo celular, respectivamente. Como consecuencia, los valores de estos indicadores no difirieron del control. Estos resultados concuerdan también con los obtenidos por ^{Gutiérrez (2005)} con el producto fermentado Vitafert seco y con ^{Elkafi et al. (2015)} los que analizaron una mezcla seca de sangre bovina y contenido de rumen fermentado.

Tabla 4 Efecto del PFS en el peso relativo (g/g PVx100) de órganos accesorios del TGI de pollos de ceba 

Indicadores	Niveles de PFS (%)				±EE y Sign
	0 (control)	1	2	3
Peso vivo, g	1959,33	2048,33	1991,61	2023,33	71,38 P=0.8095
Hígado	2,26	2,18	2,24	2,02	0,08 P=0,2303
Páncreas	0,22	0,23	0,22	0,20	0,02 P=0,8694

Indicadores inmunológicos. No se observó diferencias entre tratamientos en los pesos relativos de la bolsa de Fabricio y el timo con la inclusión de PFS (tabla 5). Como se observa, el peso relativo de la bolsa de Fabricio presentó valores entre 0.18-0.27, por lo que animales se hallaban inmunocompetentes. De acuerdo con ^{Giambrone (1996)} esta condición se alcanza cuando la relación entre el peso absoluto del órgano respecto al peso vivo se halla entre 0.20-0.30. Según este investigador y ^{Contreras y Fernández (1999)}, el sistema inmune de las aves sufre una evolución, y son la bolsa y el timo en una primera etapa de la vida, los órganos centrales de la inmunidad, en el primero se producen los linfocitos B encargados de la inmunidad humoral (producción de anticuerpos por linfocitos B) y el segundo encargado de la inmunidad mediada por células (producción de citoquinas y células por linfocitos T). Los tejidos periféricos del sistema inmune en las aves son el bazo, los tonsiles cecales, las glándulas de Harder y la médula ósea, los que son poblados durante el crecimiento de las aves por los linfocitos B y T. Cuando las aves se acercan a la madurez, la bolsa y el timo involucionan y la inmunocompetencia del ave pasa a depender del sistema inmune periférico.

El peso relativo del bazo no difirió estadísticamente entre tratamientos, pero si se halló desde el punto de vista biológico que los pollos que recibieron el 2% de PFS en la dieta tenían mayor peso relativo (P=0.0693.) Al analizar la potencia de la dócima se observó que esta era de 61%, que es una potencia baja por lo que el hecho de no encontrar diferencias estadísticas para P<0.05 pudieron influir varios factores como el tamaño de muestra o errores inherentes al muestreo que no se controlaron, como en el pesaje del órgano si la grasa adherida que presenta no se eliminó completamente, entre otros. De todas formas, el mayor peso relativo del bazo corroborado por un mayor contenido de hematocrito, pudiera indicar una respuesta inmunoestimulante a la inclusión del PFS. Como se conoce, este producto elaborado a partir de contenido líquido de rumen fermentado contiene metabolitos denominados “metabolitos terciarios” como polisacáridos, bacteriocinas, y enzimas que pudieran propiciar esta acción,

Tabla 5 Pesos relativos (g/gPVx100) de órganos linfoides y hematocrito (%) de pollos de ceba que reciben PFS en la dieta. 

Indicadores	Niveles de PFS %				±EE y Sign	1-ß Potencia de la dócima
	Control (0)	1	2	3
Peso vivo, g	1959,33	2048,33	1991,61	2023,33	71,38 P=0,86 95	8%
Bolsa de Fabricio	0,21	0,27	0,20	0,24	0,03 P=0,2971	30%
Timo	0,50	0,51	0,55	0,49	0,07 P=0,9401	7%
Bazo	0,13	0,14	0,19	0.17	0,01 P=0,0693	61%
Hematocrito	31,17 ^a	32,16 ^ab	33,66 ^b	32,83 ^ab	0,59 P=0,045	72%

^a,b Letras diferentes dentro de la misma fila difieren significativamente (P< 0.05) (^{Duncan 1955}). *P<0.05

Por otra parte, el hematocrito.se mantuvo en los rangos fisiológicos normales para la especie (^{Meluzzi et al. 1992}), aunque fue superior (P= 0.045) para el 2% de PFS en comparación con el tratamiento control (tabla 5). Este resultado era esperado, ya que si el bazo es un órgano hematopoyético, un incremento de su peso relativo se debe corresponder con un aumento de las células hemáticas.

Indicadores de la bioquímica sanguínea. El estudio de la bioquímica sanguínea mostró que los indicadores séricos del metabolismo proteico: proteínas totales, albumina y ácido úrico, así como la relación albúmina ̸globulina (A/G) no variaron al incluir PFS en la dieta de pollos de ceba (tabla 6). Sin embargo, se halló que el producto si influyó significativamente en los indicadores del metabolismo energético.

Así, se encontró que los niveles de 2 y 3% del PFS incrementaron la glucosa sanguínea sérica (P<0.0091) en comparación con el control y el 1% de PFS, los que fueron similares entre sí. Se observó un incremento del colesterol sérico (P<0.0204) con los niveles de PFS, que se correspondió con una disminución de 0.84 a 0.54mmol/L de los triglicéridos.

En relación con estos resultados, la glucosa representa el azúcar más importante en el metabolismo de los carbohidratos en todos los vertebrados. Este es el carbohidrato que circula vía sanguínea a los diferentes órganos y tejidos corporales quienes lo emplean como fuente energética (D'Mello 2000) En dietas convencionales para pollos de engorde y gallinas ponedoras, los almidones (amilosa y amilopectina) presentes en el maíz, trigo, y soya, constituyen la fuente principal de glucosa sanguínea circulante (Gunsberg et al. 1998, citados por ^{Miranda López et al. (2007)}. Los valores circulantes de glucosa en el plasma sanguíneo de los pollos de engorde se encuentran en el rango de 8.4-10.1mmol/L (^{Miturka et al. 1977}). Si se observa la tabla 6, sólo las aves de los tratamientos 2% y 3% de PFS mostraron niveles de glucosa en los rangos normales. Esto quizás significa que niveles 2% y superiores de PFS propician la energía necesaria a los diferentes órganos y tejidos corporales para realizar sus funciones.

Por otro lado, el incremento que se observó en los niveles de colesterol sérico con el PFS, conduce a pensar que éste a pesar de constituir una mezcla de microorganismos entre ellos levaduras, y bacterias lácticas no manifestó una actividad hipocolesterolémica para esta especie (pollos de ceba). Resultados similares obtuvo ^{Pérez (2000)} cuando ensayó dosis de 50, 75 y 100 mL de hidrolizado de levadura y no observó disminución del colesterol sérico de las aves tratadas en respecto al control. Hay que destacar que el hígado es el principal órgano del metabolismo lipídico de las aves, es el asiento principal de la lipogénesis, en él se sintetiza el colesterol y además, su principal producto son los triglicéridos (^{Martínez 2004}).

Tabla 6 Indicadores de la bioquímica sanguínea de pollos de ceba que recibieron PFS en la dieta. 

Indicadores^1,2	Niveles de PFS %				±EE y Sign
	Control (0)	1	2	3
A/G	0,71	0,73	0,65	0,67	0,04 P=0,6050
Albúmina, g/L	12,06	11,25	11,85	12,91 0,80	0,75 P=0,5090
Colesterol, mmol/L	3,11^a	3,15^a	3,62^ab	4,10^b 0,25	0,23 P=0,0242
Glucosa, mmol/L	6,85 ^a	6,77 ^a	9,52 ^b	10,21^b 0,69	0,64 P=0,0091
Prot. Totales, g/L	29,13	27,19	30,31	32,10 1,96	1,83 P=0,3300
TG mmol/L	0,84 ^b	0,61 ^a	0,52 ^a	0,54 ^a	0,06 P=0,0032
AU, mmol/L	354,25	378,25	399,38	358,00 35,02	32,76 P=0,7580

¹ Prot.totales= proteínas totales; TG =triglicéridos; AU= ácido úrico, A/G=Relación Albúmina /Globulina

^{2 a,b,} Letras distintas en una fila difieren a P<0.05 (^{Duncan 1955})

Análisis histológico. De manera general, se observó una hiperplasia del tejido linfoide asociada a mucosas en el ciego (tonsiles cecales) en todos los tratamientos con el PFS respecto al grupo control. Los tonsiles cecales, el bazo, la médula de Harder forman parte del sistema inmune y es probable que favorezcan una acción inmunoestimulante (figuras 1 y 2).

Con respecto al intestino (duodeno) se observó en todos los tratamientos donde se incluyó el PFS una aparente elongación de las vellosidades. La altura de la vellosidad y la profundidad de la cripta son importantes indicadores de la salud intestinal de los animales y están directamente relacionadas con la capacidad de absorción a nivel de la mucosa (^{Buddle y Bolton 1992}) (Figuras 3 y 4) El incremento en la altura de las vellosidades así como su diámetro se traduce en una mayor área de superficie para la absorción de nutrientes (^{Sklan y Noy 2003}, ^{Wang y Peng 2008}, ^{Rodríguez 2012}.Un indicador morfométrico que pudiera relacionarse con la superficie de absorción de nutrientes es la longitud relativa del intestino delgado, desafortunadamente, este indicador no se midió. Se sugiere que la inclusión de hasta 3% de PFS en la dieta de pollos de ceba basada en maíz/soya resulta favorable en indicadores de salud e histológicos de estos animales

Fig. 1 Control group, animal 1. Normal caecum. HE 20x 

Fig. 2 Treatment 1, animal 19. Caecum hyperplasia. HE 20x 

Fig. 3 Control group, animal 9. Duodenum with normal villi. HE 20x 

Fig. 4 Treatment 2, animal 13. Elongation of intestinal villi 

References

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Recibido: 04 de Septiembre de 2018; Aprobado: 05 de Septiembre de 2018

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