CIENCIA DE LOS PASTOS

Incremento del desarrollo de Pueraria phaseoloides (Kudzú tropical) por rizobios ácido tolerantes en condiciones de acidez y baja fertilidad

I. Hernández^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0002-5760-816X

P. R. Rosales¹ 

P. J. González¹ 

J. F. Ramírez² 

María C. Nápoles¹ 

Reneé Pérez¹ 

¹Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas. Gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, CP 32 700.

²Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, Avenida Independencia, km 81/2 Boyeros, La Habana, Cuba.

Resumen

Se determinó el efecto de aislados de rizobios tolerantes a la acidez en el crecimiento, la nodulación y el rendimiento de kudzú tropical, cultivado en condiciones de acidez. Mediante la medición del diámetro de la colonia y el número de células viables se estableció, en condiciones de acidez, la tolerancia a pH 4.5 de tres cepas de Bradyrhizobium: K2, 1_2 y 2_4. Se realizaron dos ensayos de inoculación de kudzú tropical: uno en condiciones controladas, y otro en campo. Se determinó el efecto de la acidez en la nodulación, crecimiento y rendimiento del cultivo. Se empleó un ANOVA de clasificación simple yun arreglo bifactorial en el análisis estadístico. Las tres cepas de rizobios resultaron tolerantes a pH 4.5. Esta condición no disminuyó su diseminación por la placa Petri, el diámetro de las coloniasni el número de células viables. La acidez no disminuyó la nodulación ni el crecimiento de plantas de kudzú, inoculadas con K2 y 1_2 en condiciones controladas. La inoculación de kudzú con los aislados de rizobios produjoefectividad en la fijación biológica del nitrógeno, más de90 % de los nódulos totales, más de75 % del rendimiento en masa seca aérea, y más de45 % del contenido de nitrógeno de la biomasa aérea de las plantas, en condiciones de campo. La elaboración y aplicación de inoculantes basadas en K2 y 1_2 contribuiría a disminuir el uso de fertilizantes minerales en suelos afectados por la acidez.

Palabras clave: Bradyrhizobium; estrés; forrajes; crecimiento

Introducción

Aproximadamente, 50 % de los suelos tropicales del mundo estáafectadopor la acidez, fenómeno que causa un importante problema en la producción agrícola mundial (^{Vitorello 2005} y ^{Toledo 2016}). En Cuba, másde 30 % se encuentraafectadopor esta limitante (^{Hernández et al. 2015}). Uno de los principales factores que propician la acidez de los suelos es el uso indiscriminado de los fertilizantes minerales acidificantes (^{Goulding 2016}).

Los conocimientos acerca de la simbiosis que establecen bacterias diazotróficas, como los rizobios, con las plantas leguminosashan permitido la elaboración y el empleo de biofertilizanteselaborados basados en estos microorganismos, práctica que contribuye a disminuir la aplicación de fertilizantes minerales (^{Saldaña 2017}).

No obstante, la acidez de los suelos constituye un factor limitante para el establecimiento de la interacción entre las leguminosas y los rizobios (^{Reeve et al. 2006}). Los bajos niveles de pH disminuyen la sobrevivencia de estas bacterias y el establecimiento de la planta. Se afectan además, los procesos de infección, nodulación y fijación biológica de nitrógeno (FBN) (^{Graham y Vance 2003}).

Pueraria phaseoloides (kudzú tropical) es una leguminosa forrajeraque, en asociación con gramíneas, permite elevar el nivel proteico en la dieta de animales, y aumentar la calidad y digestibilidad forrajera (^{Carvalho da Paz et al. 2016}). La inoculación de este cultivo con cepas de rizobios, competitivas y específicas, promueve su crecimiento, aporta nitrógeno al suelo y favorece los cultivos acompañantes y sucesivos (^{Sarr et al. 2016}).

La inoculación de kudzú tropical con rizobios que poseen cierta tolerancia a la acidez constituye una práctica interesante que podría mejorar el establecimiento del cultivo en suelos afectados por la acidez.

El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de aislados de rizobios tolerantes a la acidez en el crecimiento, la nodulación y el rendimiento de kudzú tropical, cultivado en condiciones de acidez.

Materiales y Métodos

Se emplearon tres aislados de Bradyrhizobium (K2, 1_2 y 2_4), provenientes de nódulos de kudzú tropical (^{Hernández et al. 2013}). Para obtener pre inóculos en frascos Erlenmeyers de 250 mL, con 50 mL del mismo medio líquido, se utilizó una asada de los aislados, conservados a 4 ^oC en tubos de ensayo con medio levadura manitol (LM) agar (^{Vincent 1970}) ypH 6.8. La concentración celular de los cultivos se ajustó a 1x10⁸ células mL^-1.

En los ensayos de inoculación de los tres aislados bacterianos, en condiciones controladas de cultivo y en condiciones de campo, se utilizaron semillas de kudzú tropical, donadas por la Estación Experimental de Pastos y Forrajes (EEPF) de Cascajal, Villa Clara. Para el ensayo en condiciones controladas, las semillas se desinfectaron superficialmente con etanol al 70 % durante 5 min. y se escarificaron con ácido sulfúrico al 98 % durante 10 min. Se sumergieron en hipoclorito de sodio al 25% (v/v) por 15 min. Luego, se lavaron diez veces con agua destilada estéril, en condiciones de asepsia. Las semillas se colocaron en placas que contenían agar agua (0.75 %) (m/v) y se incubaron a 28^oC en la oscuridad durante 72 h.

Clasificación de los aislados bacterianos según su tolerancia a la acidez. Una asada de los cultivos bacterianos se cultivó por triplicado en placas que contenían medio LM sólido, con pH 4.5 y 6.8. Se aplicó para ello la técnica de cultivo descrita por ^{Oliveira y Magalhães (1999)} (figura 1). Atendiendo a los niveles de acidez del medio, esta técnica permite clasificarlas bacterias en sensibles, medianamente tolerantes o tolerantes, según las zonas de la placa que cubran con su crecimiento. En el experimento, se utilizó como control el crecimiento de los aislados a pH 6.8.

Figura 1 Técnica de cultivo propuesta por de ^{Oliveira y Magalhães (1999)} para clasificar a los rizobios, según el nivel de acidez que toleren en el medio de cultivo: zona 1 de crecimiento (una asada frotándola varias veces en ambas direcciones), zona 2 (cuatro asadas solo en una dirección) zona 3 y 4 (igual a la zona 2, pero en otras regiones de la placa Petri). Los intervalos de puntuación para la clasificación de los rizobios fueron: sensibles (1.00-2.00), medianamente tolerantes (2.01-3.00) ytolerantes (3.01-4.00). 

Las placas se incubaron a 28 ^oC durante 10 dy se monitorearon las zonas cubiertas por el crecimiento bacteriano cada dos días. Además, se midió el diámetro de colonia de los aislados en ambas condiciones de pH, a los seis y 10 d de incubación. Se tomaron los valores del diámetro de cinco colonias en cada una de las réplicaspor tratamiento.

Efecto del pH en la viabilidad celular. Se emplearon pre-inóculos de los tres aislados de rizobios para su inoculaciónen frascos Erlenmeyers de 250 mL,que contenían 50 mL de medio LM a pH 4.5 y 6.8, a razón de8 % (v/v). Los cultivos se mantuvieron en condiciones de agitación a 150 rpm durante 56 h y a temperatura de 28 ^oC. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con tres repeticionespara cada aislado y condición de pH.

Se determinó la concentración de células viables (UFC mL^-1) en la fase logarítmica o de crecimiento exponencial (56 h de cultivo) mediante el método de las diluciones seriadas (10-4-10-6). Las muestras se cultivaron por diseminación en placas con medio LM sólido a pH 6.8 y las placas se incubaron a 28 °C durante 10 d.

Ensayo de nodulación in vitro. Las semillas desinfectadas, escarificadas y pre germinadas de kudzú con raíces emergentes (1-2 cm) se colocaron en frascos de vidrio con 50 mL de medio ^{Norris y Date (1976)} semisólido, a razón de una semilla por frasco y se inocularon con 1 mL de los aislados. Se emplearon inoculantes similares a los que se utilizaron en el ensayo del efecto del pH en la viabilidad celular y se establecieron diez plantas por tratamiento en un diseño completamente aleatorizado.

Las plantas crecieron en condiciones controladas, con fotoperíodo de 16 h luz/8 h de oscuridad, a una temperatura día/noche de 26/22^oC y humedad relativa de70%. Cuatro semanas después de la inoculación se determinó: número de nódulos en raíz principal (NNrp), nodulación total (NNt), número de nódulos efectivos en la raíz principal (NNerp), total (NNet) y masa seca de los nódulos totales (MSNt) (g). La efectividad de los nódulos se determinó mediante la observación de una coloración rojiza en el interior de los nódulos, característica de la proteína leghemoglobina (^{Singh y Varma 2017}). La disección de los nódulos se realizó con hojas de bisturí de acero inoxidable. Se determinó además, lalongitud de la raíz (cm), masa seca de la parte aérea (MSA) (g) y masa seca de raíz (MSR) (g).

Ensayo de inoculación en campo. El experimento se realizó en la Estación Experimental de Pastos y Forrajes (EEPF) de Cascajal, enVilla Clara, en un suelo gleysol nodular ferruginoso petroférrico (^{Hernández et al. 2015}). Este suelo presenta pH fuertemente ácido. El contenido de materia orgánica (MO), fósforo asimilable (P₂O₅), calcio (Ca²⁺), magnesio (Mg²⁺), sodio (Na⁺), potasio (K⁺) y capacidad de cambio catiónico (CCB) son bajos (^{Paneque et al. 2010}) (tabla 1).

Tabla 1 Características químicas del suelo (0-20 cm de profundidad) Gleysol nodular ferruginoso petroférrico  

pH H2O	MO(%)	P2O5 (mg 100 g^-1)	Cationes intercambiables (cmolc kg^-1)
			Ca^2+	Mg^2+	Na^+	K^+	CCB
4.7±0.2	2.50±0.09	1.3±0.3	3.51±0.12	1.10±0.03	0.08±0.01	0.11±0.02	4.80±0.16

Se muestran los intervalos de confianza de cada parámetro (Tukey, α =0,05)

La preparación del suelo se realizó de forma convencionalmediante labores de roturación, grada ligera, cruce, grada y surcado. No se aplicó fertilizante ni productos mejoradores de la fertilidad. Se emplearon parcelas con área total de 21 m² y área de cálculo de 14 m² (seis surcos de 5 m de largo, separados a 70 cm). Se establecieron cuatro tratamientos: uno sin inocular y los tres restantes con aislados de rizobios, todos distribuidos en un diseño de bloques al azar, con cuatro réplicas.

La inoculación de semillas de kudzú con los aislados de rizobios se realizó mediante el método de recubrimiento de la semilla en el momento de la siembra, a razón de 200 mL de inóculo por cada 50 kg de semillas. El kudzú se sembró en los surcos a chorrillo ligero, con dosis de 8 kg de semilla total ha^-1 (2 kg de semilla pura germinable por ha).

A los 120 ddespués de la siembra, se tomaron muestras de 10 plantas de cada parcela y se determinó el número total de nódulos y el porcentaje de nódulos totales efectivos. La parte aérea de las plantas se colocó en estufa a 70 ^oC, durante 72 h y se determinó la MSA. El porcentaje de MSA (% MSA) se calculó mediante la relación entre la MSA del tratamiento control, sin inocular, y los inoculados.

El rendimiento en masa seca aérea de las plantas (RendMSA, t ha^-1) se determinó 180 d después de la siembra, a partir de la ecuación: RenMSA = (masa verde x % MSA)/100. Se evaluó el porcentaje de contenido de nitrógeno de la biomasa aérea en 200 g de masa verdemediante métodos colorimétricos (^{Paneque et al. 2010}). También se evaluó el porcentaje de incremento de esta variable en los tratamientos inoculados con respecto al control sin inocular.

Análisis estadístico. Los datos provenientesde los ensayos de tolerancia a condiciones de acidez en el medio de cultivo se sometieron a la prueba de normalidad (test de Bartlett) y homogeneidad de varianza (test de Kormogorov-Smirnov). Se aplicó análisis de varianza de clasificación simple. Se utilizó el Test de comparación de medias de Tukey (P<0.05) para discriminar diferencias entre las medias (^{Sigarroa 1985}).

Un arreglo bifactorial se utilizó con los datos del ensayo de inoculación en condiciones controladas y se tuvieron en cuenta los factores cepa con tres niveles (1_2, 2_4 y K2) y pH con dos (6.8 y 4.5). Los datos se procesaron de manera similar a lo descrito anteriormente, en cuanto a la prueba de normalidad y homogeneidad de varianza. El programa SPSS 21 se empleó para el procesamiento estadístico (^{Gray y Kinnear2012})

Los resultados del experimento en condiciones de campo se procesaron igualmente mediante un análisis de varianza. Se utilizó la dócima de comparación múltiple de Tukey (^{Sigarroa 1985}) en los casos en que hubo diferencias significativas entre tratamientos.

A los valores promedio de los análisis del suelo Gleysol nodular ferruginoso petroférrico de la EEPF de Cascajal, Villa Clara,se le estimó el intervalo de confianza de las medias a α=0,05 (^{Payton et al. 2000}). Todos los resultados se graficaron en el programa SigmaPlot (2001).

Resultados

Tolerancia y multiplicación de los aislados de rizobios en condiciones de acidez. Los aisladosde rizobios ocuparon hasta la cuarta zona de crecimiento en el medio LM sólido, con pH 4,5,a los seis días de incubación, por lo que son microorganismos tolerantes a esta condición de acidez (^{dos Santos Hara y Oliveira 2005}). Este comportamiento se produjo a los cuatro días para el aislado 2_4, a los seis para 1_2, y a los ocho días para K2. Tuvo lugar en el mismo medio de cultivo con pH 6.8 (figura 2).

Figura 2 Intervalos de puntuación, según las zonas de crecimiento de los aislados de rizobios en la placa Petri (pH 4.5 y 6.8) durante 10 d de incubación.  

En el medio con pH 4,5, el aislado 2_4 creció hasta la tercera zona de crecimiento a los cuatro días de incubación. Los dos aislados restantes crecieron hasta la segunda zona en el mismo intervalo. El aislado K2 demoró más tiempo en ocupar hasta la cuarta zona de crecimiento en el medio LM, con pH 6.8 (8 d) que en el medio con pH 4.5 (6 d).

Los tres aislados de rizobios produjeron colonias pequeñas, menores de 1 mm, en medio LM (pH 4,5 y 6,8) a los 10 dde incubación (figura 3).

Figure 3 Colony diameter (mm) of rhizobia isolates at 6 and 10 d of incubation (pH 4.5 and 6.8). 

No se evidenciaron diferencias significativas entre el diámetro de las colonias que produjo el aislado 1_2 en el medio con pH 4.5 con respecto a las que formó con pH 6.8, a los seis y a los 10 d de incubación. A los seis días, el resto de los aislados formaron colonias que fueron significativamente mayores enpH 6.8 que en pH 4,5. Sin embargo, a los 10 d, no hubo diferencias significativas entre los aislados, ni entre las colonias del mismo aislado en las diferentes condiciones de pH.

En el efecto del pH del medio en la multiplicación de los tres aislados de rizobios (figura 4), el aislado 2_4 tuvo un número de UFC mL^-1 en pH 4.5, que resultó significativamente superior con respecto a las que se cuantificaron en pH 6.8. Los dos aislados de rizobios restantes presentaron similar cantidad de células viables en las dos condiciones de pH. No se observaron diferencias significativas entre los tres aislados en cada una de las condiciones de pH estudiadas.

Figure 4 Number of viable cells of rhizobia isolates in MY medium (pH 4.5 and 6.8) 

Efectos positivos de los aislados de rizobios en la nodulación, crecimiento y rendimiento de plantas de kudzú tropical, cultivadas en condiciones de acidez. El análsis de los datos provenientes del ensayo de inoculación en condiciones controladas permitió detectar la influencia de cada factor por separado (cepa y pH) (tabla 2) y la intereacción de ambos factores de manera conjunta, en la nodulación y crecimiento de las plantas de kudzú tropical (tabla 3).

Tabla 2 Efecto independiente de los factores cepa y pH en la nodulación y crecimiento de plantas de kudzú tropical. 

Tratamientos	NNet	MSNt	Largo raíz (cm)	MSA (g)	MSR (g)
Cepa
K2	3.65^a	0.0044^a	8.02^c	0.0411^b	0.0061^a
1_2	3.15^b	0.0037^b	9.09^a	0.0383^c	0.0058^b
2_4	2.95^c	0.0036^c	8.86^b	0.0424^a	0.0054^c
F-Test	*	***	*	***	***
EE±	0.42	0.0005	0.38	0.0025	0.0003
pH
6.8	3.67^a	0.0041^a	8.98^a	0.042^a	0.0059^a
4.5	2.84^b	0.0038^b	8.33^b	0.040^b	0.0056^b
F-Test	*	***	*	***	***
EE±	0.33	0.0004	0.31	0.0021	0.0003

NNet, número de nódulos efectivos totales; MSNt, masa seca nódulos totales; MSA, masa seca aérea; MSR, masa seca de raíz,Letras iguales no difieren significativamente (Tukey P < 0. 05, n=10),

Tabla 3 Efecto combinado de los factores cepa y pH en la nodulación de kudzú tropical.  

(Cepa*pH)	NNrp	NNt	NNerp
K2, pH 6,8	3.30^a	3.80^a	3.00^ab
K2, pH 4,5	3.44^a	4.11^a	3.33^ab
1_2, pH 6.8	3.50^a	4.00^a	3.40^a
1_2, pH 4.5	2.10^ab	2.60^ab	1.90^ab
2_4, pH 6.8	3.30^a	4.10^a	3.20^ab
2_4, pH 4.5	0.90^b	1.40^b	1.50^b
EE±	0.61*	0.76*	0.64*

NNrpnúmero de nódulos en raíz principal, NNtnúmero de nódulos totales, NNerpnúmero de nódulos efectivos en raíz principal.

Letras iguales no difieren significativamente (Tukey P< 0.05n=10),

El factor cepa influyó en todas las variables que se evaluaron de nodulación y crecimiento de las plantas de kudzú tropical (tabla 2). Se destaca la cepa K2, con diferencias significativas con respecto al resto de las cepas, excepto en el largo de raíz y la MSA, variables donde sobresalen 1_2 y 2_4, respectivamente.

El factor pH, cuando se analizóde manera independiente (tabla 2), permitió identificar el efecto negativo de la acidez del medio en la nodulación y crecimiento de las plantas de kudzú. Sin embargo, en el análisis de la influencia de ambos factores (pH y cepa) (tabla 3) en el NNrp, NNt y NNerp no se identificarondiferencias significativas entre las plantas inoculadas con K2 y con 1_2 en pH 4.5 y 6.8. En el resto de las variables no hubo interacción entre ambos factores.

En el ensayo en condiciones de campo se constató que los aislados de rizobiosprodujeron incrementosignificativoen el número de nódulos totales, MSA y contenido de nitrógeno en la biomasa aérea de las plantas de kudzú, cultivadas en un suelo Gleysolnodular ferruginoso petroférrico ácido, en Cascajal, Villa Clara (tabla 4).

Tabla 4 Efecto de los aislados de rizobios en la nodulación y crecimiento de plantas de kudzú tropical, cultivadas en suelo Gley nodular ferruginoso petroférrico ácido, en Cascajal, Villa Clara.  

Tratamientos	Nodulación		MSA (t ha^-1)	% incremento en MSA(t ha^-1)	Contenido de Nitrógeno en la biomasa aérea(%)	% de incremento del contenido de nitrógeno en la biomasa aérea
	NNt	NNte (%)
Control sin inocular	21 ^c	31	4.03 ^c	-	2.19 ^b	-
K2	53 ^a	93	7.27 ^a	80.4	3.28 ^a	49.77
1_2	50 ^a	95	7.11 ^a	76.43	3.33 ^a	52.05
2_4	32 ^b	68	5.19 ^b	28.78	2.52 ^b	15.07
EE±	2**	-	0.23**	-	0.04**	-

NNtnúmero de nódulos totales, NNtenúmero de nódulos efectivos totales, MSAmasa seca aérea. Letras iguales no difieren significativamente (TukeyP < 0.05, n=10).

Más del 60 % de los nódulos totales fueron efectivos en la FBN en las plantas inoculadas con los aislados de rizobios. Se destacaron K2 y 1_2 con más del 90 %. Ambos aislados además, produjeron incremento de más del 75 % del rendimiento de la masa seca aérea, y más del 45 % del contenido de nitrógeno de la biomasa aérea de las plantas de kudzú.

Discusión

El empleo de biofertilizantes basados en cepas de rizobios, adaptadas a condiciones estresantes en el suelo, como la acidez, es una práctica biotecnológica que ofrece una solución para mejorar la producción agrícola. El aislamiento, caracterización y empleo de estas bacterias en cultivos de importancia económica, sobre todo de aquellos afectados por factores abióticos tan agresivos, como la acidez de los suelos, es cada vez de mayor importancia. Esta investigación permitió identificar potencialidades en cepas de rizobios, como microorganismos promisorios para la inoculación del kudzú tropical en suelos ácidos cubanos.

Los tres aislados, Bradyrhizobium K2, 1_2 y 2_4, presentaron lento crecimiento en el medio de cultivo (figura 2) y formaron colonias menores de 1 mm de diámetro (figura 3). Estas características se han informado anteriormente para el género Bradyrhizobium (^{Wang y Martínez-Romero 2001} y ^{da Costa et al. 2017}).

La acidez de los suelos constituye un factor que limita el crecimiento bacteriano (^{Turan et al. 2010}). Sin embargo, los tres aislados que se estudiaron en este trabajo mostraron tolerancia a pH ácido. Los aislados crecieron en todas las zonas de las placas Petri donde se inocularon (figura 2). La condición de acidez no afectó el diámetro de sus colonias(figura 3) y el número de células viables durante la fase de crecimiento exponencial tampoco (figura 4). Cepas de Bradyrhizobium, igualmente tolerantes a pH ácidos, han sido identificadas recientemente (^{Helene et al. 2017} y ^{Jang et al. 2018}).

Los tres aislados bacterianos excretan base al medio de cultivo (^{Hernández et al. 2013}). Esta característica también es representativa del género Bradyrhizobium (^{Wang y Martínez-Romero 2001}) y se ha interpretado como una de las estrategias de tolerancia a la acidez (^{Graham et al. 1994}), la cual permite neutralizar el pH ácido y consumir los nutrientes del medio. La producción de basespudiera explicar el comportamiento de los tres aislados de rizobios en el medio LM con pH 4.5.

Los aislados 2_4 y K2 presentaron comportamientos que sugieren mayor adaptación a las condiciones de acidez (pH 4.5) que en medios cercanos a la neutralidad (pH 6.8). De manera general, ocuparon mayor cantidad de zonas en las placas Petri en condiciones ácidas que en pH 6,8. Además, 2_4presentó mayor concentración de células viables en pH 4.5. Resultados similares con el aislado K2 se obtuvieron anteriormente (^{Pérez 2010}). Ambos aislados, además de la excreción de base, pudieran contar con otros mecanismos que les permiten mantenerse viables y multiplicarse en condiciones de acidez en el medio. Estos mecanismos pudieran ser la acumulación de buffer internos, la síntesis de proteínas de shock ácido, la exclusión de protones, la síntesis de lipopolisacáridos de superficie y la disminución de la permeabilidad de la membrana citoplasmática (^{Geddes et al. 2014}).

Las características físico-químicas de los suelos de Cascajal en Villa Clara, fundamentalmente su acidez, constituyen un factor decisivo enla selección de las poblaciones de rizobios que residen en él (^{Morón et al. 2005}). Los mecanismos de tolerancia a esta condición les permitenmantener pH intracelular entre 7.2 y 7.5 para sobrevivir en forma de vida libre (^{Madigan et al. 2003}) y establecer la simbiosis con las leguminosas residentes en estos suelos. La adaptación de los rizobios a la acidez requiere la colaboración conjunta de diversas funciones centrales del metabolismo, como la expresión de proteínas de membrana, relacionadas con la respiración y cambios en el metabolismo central del carbono y los lípidos (^{Draghi et al. 2016}).

Como parte de esta investigación, se realizaron ensayos de inoculación de los aislados de rizobiosen semillas de kudzú tropical en condiciones de acidez. En el experimento, en condiciones controladas, el análisis del factor pH por separado permitió concluir que la acidez disminuyó la nodulación y el crecimiento de las plantas. ^{Plá y Cobos-Porras (2015)} refirieron el efecto negativo de la acidez enla formación de los nódulos. Sin embargo, el análisis conjunto de los factores cepa y pH permitió concluir que K2 y 1_2, cuando se inoculan en condiciones de acidez, lograron contrarrestar el efecto negativo de la acidez en la nodulación de las plantas (tabla 3). La ácido tolerancia de ambos aislados (figuras 2, 3 y 4),quizás producto de su capacidad de producir base al medio (^{Hernández et al. 2013}), neutralizaríala acidez en el entorno de la rizosfera de las plantas de kudzú.

Este mecanismo permitiría la adecuada colonización, formación del nódulo y posterior FBN,y propiciaría el N a la planta de kudzú para su crecimiento adecuado. Por lo tanto, la planta se encontraría mejor preparada para establecerse en condiciones de acidez. No se encontraron diferencias significativas en ninguna de las variables de crecimiento de las plantas, cuando se analizaron conjuntamente los factores pH y cepa. Estos resultados pudieran avalar, en alguna medida, la hipótesis propuesta.

El ensayo de inoculación en campo demostró el efecto positivo de los aislados de rizobiosen la nodulación efectiva,FBN y MSA, así comoen el contenido de nitrógeno de la biomasa aérea de plantas de kudzú. Resultados similares se obtuvieron en este mismo cultivo (^{González et al. 2016}) y en canavalia(^{Martín et al. 2015}).

Muchas leguminosas requieren pH neutro o ligeramente ácido para su crecimiento y nodulación. Valores de pH, inferiores a 5.5, desencadenan generalmente problemas en el establecimiento de la planta y, por consiguiente,en la FBN (^{Bordeleau y Prévost 1994}). Sin embargo, la inoculación de las pantas de kudzú con los tres aislados de rizobios incrementó considerablemente el número de nódulos efectivos totales en el suelo Gleysol nodular ferruginoso petroférrico ácido, de la zona de Cascajal(tabla 4). La tolerancia a la acidez de los aislados de rizobios que se emplearon en este ensayo pudiera haber sido el factor determinante para el establecimiento de una simbiosis efectiva entre las plantas de kudzú y la bacteria.

La mayor cantidad de nódulos efectivos para la FBN en las plantas leguminosas permite el incremento del contenido de nitrógeno. Este elemento se emplea para la formación de nuevas estructurasque, a su vez, se traduceen aumento del crecimiento vegetal (^{Gardner et al. 2017}). El incremento en los porcentajes del contenido de nitrógeno de la biomasa aérea y de la masa seca aérea de las plantas inoculadas con los aislados, es clara evidencia de este fenómeno.

Se observaron nódulos en las raíces de las plantas que se emplearon como control negativo del experimento. Esto sugiere la presencia de rizobios compatibles en el suelo de la zona de Cascajal. Sin embargo, esta nodulación, y los efectos que se constataron en el crecimiento de las plantas, fueron inferiores al encontrado en las plantas inoculadas. La utilización de cepas más eficientes y la aplicación de mayorconcentraciónde bacterias ofrecen ventajas en la colonizacióndurante la emisión de la raíz.

Los aislados de rizobios empleados en esta investigación fueron seleccionados en investigaciones previas, como promisorias para la inoculación de kudzú tropical. Esta selección se basó en algunas características fisiológicas,como la utilización de diversas fuentes de carbono, la producción de polihidroxibutiratos (PHB) y la nodulación de esta leguminosa forrajera (^{Hernández et al. 2013}).

Estas cepas, además de las ventajas que poseen por la forma de aplicación sobre la semilla y su tolerancia a la acidez, cuentan con diversas características que les permiten competir con otras bacterias del suelo durante el proceso de colonización y formación de los nódulos en las plantas de kudzú. La inoculación de las leguminosas con cepas competitivas y específicas incrementa considerablemente la eficiencia de la simbiosis rizobios-leguminosa y la FBN (^{Andrews y Andrews 2017}).

Se concluye que la utilización de rizobios ácido tolerantes para la inoculación delkudzú tropical, cultivado en condiciones de acidez, garantiza el establecimiento exitoso de la simbiosis. Los aislados de Bradyrhizobium K2, 1_2 y 2_4, no solo permitenlna nodulación efectiva en la FBN, sino que incrementan estas variables y el rendimiento del kudzú en las condiciones de acidez en el campo. Estos resultados constituyen una propuesta atractiva para validar inoculantes basados en estos aislados bacterianos en otros suelos ácidos del país.

References

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Recibido: 22 de Abril de 2019; Aprobado: 24 de Octubre de 2019

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