CIENCIA ANIMAL

Evaluación del potencial ligninolítico de las lacasas de Curvularia kusanoi L7 para su empleo en la producción animal

Maryen Alberto Vazquez^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0003-0562-1052

Elaine Cristina Valiño Cabreras¹ 
http://orcid.org/0000-0003-4178-3286

Livio Torta² 
http://orcid.org/0000-0003-2694-8265

A. Laudicina² 
http://orcid.org/0000-0002-5531-0669

Giulia Mirabile² 
http://orcid.org/0000-0001-8070-307X

¹Institute of Animal Science (ICA), km 47 ½ Carretera Central San José de Las Lajas, 32700, Mayabeque, Cuba

²Scienze Agrarie, Alimentari e Forestali (SAAF) Department, Università degli Studi di Palermo, Viale Delle Scienze, Ed. 5, 90128 Palermo, Italy

Resumen

La presente investigación se condujo con el objetivo de evaluar la capacidad ligninolítica de las enzimas lacasas del hongo Curvularia kusanoi L7 en el mejoramiento de la calidad nutritiva de fuentes fibrosas para su empleo en la alimentación animal. La producción de lacasas se obtuvo mediante fermentación sólido sumergida del salvado de trigo, en condiciones nativas y con inducción por interacciones biológicas con Trichoderma viride M5-2 y Trichoderma pleuroticola y se purificaron mediante partición trifásica. La capacidad degradativa de las enzimas nativas e inducidas se evaluó mediante la determinación de su capacidad lignolítica foliar, deslignificación de la paja cruda de Triticum aestivum (trigo) y determinación del efecto del pretratamiento enzimático en el fraccionamiento fibroso y la digestibilidad in vitro del bagazo de Saccharum officinarum (caña de azúcar). Las lacasas, tanto nativas como inducidas, presentaron resultados similares de degradación foliar y deslignificación de la paja de trigo cruda. En cuanto a la calidad nutricional del bagazo de caña de azúcar, los pretratamientos enzimáticos logaron disminuir los componentes fibrosos, e incrementar su digestibilidad in vitro. Respecto al bagazo sin tratar, el pretratamiento con lacasa nativa presentó los mayores valores (P<0,05) de digestibilidad de la materia seca, (54.71%) de la materia orgánica (63.14%) de la fibra de detergente ácido (63.59 %) y de la celulosa (65.46%). Se concluye que el potencial ligninolítico de las lacasas de C. kusanoi L7 y su capacidad para mejorar la calidad nutritiva y la digestibilidad in vitro del bagazo de caña de azúcar, encaminan su evaluación in vivo en la alimentación de especies monogástricas y rumiantes.

Palabras clave: Enzima; inducción; fibra; pretratamiento; digestibilidad in vitro

El crecimiento acelerado de la población mundial trae como consecuencia el agotamiento de muchos recursos y empeora la situación alimentaria internacional. Según reportes de la ^{FAO (2019)}, el hambre afecta a más de 42,5 millones de personas en la región de América Latina y el Caribe. Por estas razones, el desarrollo de la producción animal en el trópico se hace indispensable como una de las vías fundamentales para reducir el impacto negativo del déficit de alimentos.

Numerosos estudios se conducen con la finalidad de lograr producciones más sostenibles, capaces de suplir la demanda internacional e impulsar la búsqueda y el estudio de fuentes alternativas de alimento animal que no compitan con la alimentación humana. En ese sentido, se valoran diferentes estrategias dentro de las que sobresale el pre tratamiento enzimático de fuentes fibrosas (^{Pinos et al. 2019}). Sin embargo, la complejidad estructural de la lignina, así como su estrecha asociación y entrecruzamiento químico con la fracción de carbohidratos de la pared celular de la planta, la convierte en una biomolécula de carácter recalcitrante y de dificil degradación.

Las enzimas que modifican este biopolímero son de tipo oxidativo, inespecíficas y además, actúan a través de mediadores no-protéicos en contraste con las enzimas hidrolíticas celulasas y hemicelulasas (^{Mehandiaa et al. 2020}). Dentro de las principales enzimas lignolíticas que catalizan la despolimerizacion progresiva de la lignina, se encuentran las lacasas, las que constituyen dentro de su grupo, las de mayor aplicación industrial (^{Munk et al. 2015}).

El empleo de este tipo de enzimas en el pre tratamiento de sustratos altos en fibra, supone grandes beneficios económicos y disminuye el tiempo global del proceso degradativo, si se compara con el empleo de microorganimos lignocelulolíticos (^{Zhao et al. 2019}). No obstante, son escasos los estudios sobre la evaluación de estas enzimas en el mejoramiento de la calidad nutritiva de fuentes fibrosas para la alimentación animal. Por estas razones la presente investigación tuvo como objetivo: Evaluar las lacasas de Curvularia kusanoi L7 en la degradación de fuentes fibrosas para la alimentación animal

Material y Métodos

Obtención de los crudos enzimáticos mediante fermentación sólida sumergida del salvado de trigo. Microorganismo: en el presente estudio se empleó el hongo ascomiceto Curvularia kusanoi L7, aislado del árbol del limón, con número de secuencias de nucleótidos registradas en el GenBank y número de acceso L7 KY795957

Procedimiento: Del cultivo puro de la cepa C. kusanoi L7, se tomaron 3 cm² y se inocularon en un Erlenmeyer que contenía 3 g de salvado de trigo y 100 mL de tampón citrato (50 mM, pH 5.0). Estos se incubaron a 30 °C en una zaranda orbital a 120 rpm durante 168 h de fermentación (tiempo de mayor producción de lacasa). El contenido de cada Erlenmeyer se filtró a través de un embudo Büchner, el líquido resultante se centrifugó (4 °C, 10,000 rpm, 3 min) y al sobrenadante (extracto crudo enzimático) se le determinó la actividad enzimática y la concentración de proteína. El resto se almacenó en tubos Corning a -20 °C para determinaciones posteriores (^{Wang et al. 2014}).

Inducción de lacasas en cultivos de C. kusanoi L7 a través de interacciones biológicas con Trichoderma viride M5-2 y Trichoderma pleuroticola. La inducción de enzimas lacasa en los cultivos de C. kusanoi L7 se realizó a través de interacciones biológicas con dos especies de Trichoderma (T. viride M5-2 y T. pleuroticola, con número de secuencias de nucleótidos registradas en el GenBank y número de acceso de KY977981 y MK992922, respectivamente). Se empleó un inóculo de 1x10⁷ UFC/g de sustrato, el cual se incorporó a los cultivos de C. kusanoi L7 a las 48h de crecimiento.

El proceso de inducción se realizó en fermentación sólido sumergida del salvado de trigo, igual a lo descrito en la sección anterior. Para ambas especies de Trichoderma se procedió de forma similar.

Purificación de lacasa mediante partición trifásica. Las lacasas de los extractos enzimáticos de C. kusanoi L7 y las resultantes del proceso de inducción, se purificaron mediante la metodología de partición trifásica propuesta por ^{Alberto et al. (2018)}. A los extractos crudos se añadió ter-butanol en una relación de 1.0: 1.1 (v / v), respectivamente. Esta mezcla se saturó al 78% con sulfato de amonio. El sistema formado se homogeneizó mediante agitación vórtex durante 1 minuto. Después se incubó durante 1 h a 38 °C en baño de incubación con temperatura controlada hasta que las fases se separaron. Este sistema se centrifugó (4000 rpm, 10 minutos a 25 °C) en una centrífuga termocientífica IEC CL31R, con el objetivo de compactar y separar con mayor facilidad el precipitado depositado en la fase intermedia. A continuación de la centrifugación, las fases se separaron mediante un embudo separador, la fase intermedia se reservó y se re disolvió en tampón fosfato (50 mM, pH 7). Finalmente, se determinó la actividad enzimática y la concentración de proteína.

Determinación de la actividad de la enzima lacasa. La actividad lacasa se determinó por espectrofotometría mediante el espectrofotómetro UV-Vis split beam, Rigol Ultra-3400. Se emplearon 100 µL de siringaldazina (5 mM en etanol) y 800 µL de amortiguador de citrato (50 mM, pH 4,5). La mezcla de reacción se incubó a 30ºC y se adicionó 100 µL del crudo enzimático hasta volumen final de reacción de 1mL. La reacción de oxidación de la siringaldazina se monitoreó en modo cinético durante 1 minuto en condiciones aerobias a 530 nm. Se consideró como una unidad de actividad lacasa (U), la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1.0 mmol de siringaldazina por minuto (^{Perna et al. 2018}).

Determinación de la concentración de proteínas. La concentración de proteínas se determinó de igual forma para los crudos iniciales y los resultantes luego de la purificación en sistemas trifásicos, mediante el método de ^{Bradford (1976)}, con el empleo de una curva estándar de seroalbumina bovina (BSA) en el rango de concentraciones 50-0.01 mg/mL.

Evaluación de la capacidad ligninolítica de las lacasas de C. kusanoi L7 en la paja de trigo cruda mediante Espectroscopía Infrarroja de Reflexión Total Atenuada con Transformada de Fourier (ATR-FT-IR). Para evaluar la capacidad ligninolítica de las lacasas de C. kusanoi L7 en la paja de trigo cruda, se incubó el sustrato con las difrentes enzimas (lacasa nativa de C. kusanoi L7, lacasa inducida por T. viride M5-2 y lacasa inducida por T. pleuroticola) a razón de 1:1 (p/v) en tubos de vidrio, durante 5 días a 40 ºC. La capacidad ligninolítica de los tratamientos enzimáticos se comparó con un tratamiento control donde se sustituyó la enzima por 1mL de agua destilada. Las diferencias en cuanto a la degradación de la lignina se evidenciaron mediante Espectroscopía Infrarroja de Reflexión Atenuada Total (ATR-FT-IR) en un equipo Pelkin Elmer con base de diamante ATR y detector MCT / A. Las exploraciones se realizaron desde 4000 cm^-1 hasta 400 cm^-1.

Fraccionamiento fibroso y digestibilidad in vitro del bagazo de caña de azúcar pretratado con lacasas purificadas de C.kusanoi L7. Para evaluar la actividad de las lacasas de C. kusanoi L7 en los componentes fibrosos del bagazo de caña de azúcar, se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro tratamientos: tratamiento control (bagazo sin tratar) y tres tratamientos enzimáticos (bagazo tratado con lacasa nativa, bagazo tratado con lacasa inducida por T. viride M5-2 y bagazo tratado con lacasa inducida por T. pleuroticola). Los análisis se realizaron por sextuplicado para un total de 24 muestras.

Para obtener cada uno de los pretratamientos enzimáticos, se incubó 1g de sustrato con la enzima a razón de 4 UI/g y se mantuvo en una zaranda orbital a 40 ºC durante 72 horas. El fraccionamiento fibroso se realizó según la metodología de ^{Goering y Van Soest (1970)}.

Se evaluó la digestibilidad del bagazo de caña pre tratado con las lacasas de C. kusanoi L7 mediante la técnica in vitro con inóculo fecal de cerdo propuesta por ^{Marrero et al. (1998)}. Para esto se empleó un diseño completamente aleatorizado con cuatro tratamientos: tratamiento control (bagazo sin tratar) y tres tratamientos enzimáticos (bagazo pretratado con lacasa nativa, bagazo pretratado con lacasa inducida por T. viride M5-2 y bagazo pretratado con lacasa inducida por T. pleuroticola). Los análisis se realizaron por sextuplicado para un total de 30 muestras. Como donante de las heces se tomó un cerdo mestizo (Yorkshire x Landrace x Duroc), quien recibió 1.5 kg de pienso basado en maíz-soja y agua a voluntad. Las heces se tomaron inmediatamente después de la defecación. Posteriormente, se determinó en los residuos el contenido de materia seca (MS), orgánica (MO) y ceniza (^{AOAC, 1995}), además de la concentración de fibra detergente ácida (FND) y celulosa (^{Goering y van Soest, 1970}). Para los cálculos de la digestibilidad se usó como blanco el medio de incubación.

Análisis estadísticos En ambos experimentos, los datos se procesaron según modelo de clasificación simple, con la ayuda del paquete estadístico InfoStat versión 1.0 (^{Di Rienzo et al. 2012}). La dócima de ^{Duncan (1955)} se empleó en los casos necesarios, para discriminar diferencias entre las medias.

Capacidad lignolítica foliar de lacasas C. kusanoi L7 en árbol de limón (Citrus aurantifolia). Para evaluar el efecto ligninolítico de las lacasas de C. kusanoi L7 en la superfice foliar del árbol de limón, se emplearon 3 plantas jóvenes por cada tratamiento (control con agua destilada, lacasa nativa de C. kusanoi L7, lacasa inducida por T. viride M5-2 y lacasa inducida por T. pleuroticola). Estos tratamientos se aplicaron en 5 hojas por cada planta, para un total de 15 hojas por tratamiento. La superficie foliar se limpió con agua destilda y se asperjó 1 mL de la enzima. La capacidad degradativa foliar se evaluó cada 24 horas por un período de 7 días. El experimento se realizó a temperatura ambiente en la estación experimental de la Facultad de Ciencias Agrarias Agroalimentarias y Forestales de la Universidad de Palermo, Sicilia, Italia.

Resultados y Discusión

Evaluación de la capacidad ligninolítica de las lacasas de C. kusanoi L7 en la paja de trigo cruda mediante Espectroscopía Infrarroja de Reflexión Atenuada Total con Transformada de Fourier (ATR-FT-IR). Los espectros ATR-FT-IR de la paja de trigo cruda y de la paja tratada con las lacasas de C. kusanoi L7 se muestran en la figura 1. De acuerdo con los estudios previos de ^{Xu et al. (2004} y ²⁰⁰⁶⁾, la presencia de la lignina en la muestra se detecta a través de señales características en el espectro.

Figura 1 Espectro ATR-FT-IR de la paja de trigo cruda y tratada con lacasas nativas e inducidas de C. kusanoi L7 en el rango 400 a 4000 cm^-1. Los números del 1-12 corresponden a las señales características de la lignina. 

En la presente investigación se identificaron las siguientes bandas asociadas a la lignina:

1. Banda correspondiente a la vibración de estiramiento de grupos O-H (fenólicos y alifáticos) en el intervalo de 3400 a 3200 cm^-1

2. Banda correspondiente al estiramiento de C-H de los grupos CH₃ y CH₂ detectada a 2930 cm^-1

3. Pequeña banda a 2850 cm^-1 atribuida a la vibración de grupos OCH₃.

4. La banda a 1711 cm^-1 atribuida al estiramiento C=O de cetonas no conjugadas, grupos carbonilos, grupos éster o aldehídos conjugados y ácidos carboxílicos.

5. Banda a 1610 cm⁻¹ asociada a dobles enlaces C=C aromáticos

6. Banda a 1510 cm^-1asociada a vibraciones de enlaces C=C de las unidades aromáticas y fenólicas de la lignina

7. Banda detectada a 1420 cm^-1 asociada a las vibraciones del esqueleto aromático de fenilpropano de la lignina

8. Banda detectada a 1333cm⁻¹ asociada a las vibraciones de los enlaces C−H alifáticos (grupos CH o CH₂)

9. Banda detectada a 1320 cm⁻¹ asociada a la flexión simétrica de enlaces alifáticos C-H

10. Banda detectada a 1210 cm⁻¹ asociada a la presencia de enlaces de C−O del anillo guaiacil

11. Banda detectada a 1160 cm⁻¹ asociada a la vibración del estiramiento antisimétrico C-O de alcoholes secundarios o de los ácidos hidroxicinámicos unidos a éster (como el ácido ρ-cumárico esterificado y ácido ferúlico) (^{Sun y Cheng, 2002})

12. Banda detectada a 1035 cm^-1 asociada a las vibraciones producidas por los enlaces O-CH₃ de las unidades de tipo guayacilo y siringilo

Los tratamientos con lacasa, tanto inducida como nativa, muestran marcada reducción de las intensidades en todas las señales que se asocian a la lignina. El tratamiento que logra mayor disminución de las señales en el espectro es el que emplea la lacasa inducida con T. pleuroticola, aunque las diferencias con el resto no son en gran medida. En todos los casos, las mayores reducciones se observan en el triplete característico (5, 6 y 7), atribuido a las vibraciones del anillo aromático de la lignina, lo que se corresponde con estudios similares de ^{Ibarra et al. (2004)}.

Estos resultados también se corresponden con los planteados por ^{Mwaikambo y Ansell (2011)}, quienes encontraron marcada disminución de la banda comprendida entre 3300 y 3100 cm^-1 después del tratamiento de la fibra de la paja de trigo con la enzima lacasa. Se conoce que el propio mecanismo de acción de esta enzima, implica la despolimerización oxidativa de los compuestos fenólicos mediante la formación de radicales fenoxilo inestables (^{Ghoul y Chebil, 2012}), es por ello que las variaciones en la intensidad de estas bandas son indicativas de la acción de la enzima sobre las unidades fenólicas de la lignina. Según ^{Mattinen et al. (2005)} y ^{Kahar (2013)} los cambios a 1512 cm⁻¹ atribuidos a las vibraciones de los anillos aromáticos de la lignina debido a la vibración esquelética aromática (C═C), son indicativos de cambios en la superficie de la lignina, por lo que la menor intensidad de esta banda demuestra la acción de la lacasa para oxidar las unidades fenólicas presentes en la superficie de las fibras (^{Oliva et al. 2015} y ^{Liu et al. 2014}).

Digestibilidad in vitro y fraccionamiento fibroso del bagazo de caña de azúcar pretratado con lacasas purificadas de C. kusanoi L7. En la tabla 1 se resume el fraccionamiento fibroso del bagazo de caña pretratado con las enzimas lacasas de C. kusanoi L7. En todos los casos, el proceso de pre tratamiento enzimático pemitió la disminución tanto de la fracción ácida de la fibra como de los valores de lignina y celulosa. La reducción de estos indicadores es un aspecto fundamental para mejorar el aprovechamiento del bagazo de caña de azúcar.

Tabla 1 Fraccionamiento fibroso del bagazo de caña pretratado con las enzimas lacasas de C. kusanoi L7 

Indicadores, %	Bagazo de caña de azúcar				EE ± sign.
	Bagazo control	Tratado con lacasa nativa	Tratado con lacasa inducida por T. viride	Tratado con lacasa inducida por T. pleuroticola
MS	94,65	94,68	94,79	94,28	±0,24 P=0,4875
FDA	51,88 ^a	40,14 ^b	39,72 ^c	39,74 ^c	±0,09 P<0,0001
Lignina	8,93 ^a	6,12 ^b	6,12 ^b	5,35 ^c	±0,10 P<0,0001
Celulosa	39,49 ^a	30,06 ^b	28,07 ^c	27,57 ^c	±0,26 P<0,0001

^a,b,c Letras distintas indican diferencias significativas para P<0,05 (^{Duncan, 1955}).

^{López et al. (2018)} plantearon que los métodos de pretratamiento deben ser capaces de mejorar la biodegradabilidad del sustrato y presentar bajo consumo de energía, facilidad en la disposición de residuos y bajo costo económico. Es por ello que constituyen una alternativa sustentable y eficaz para la bioconversión de la biomasa lignocelulósica.

La modificación de las fibras del bagazo de caña mediante la acción de las enzimas lacasas, permite obtener un sustrato mas accesible y de mayor biodegradación. Los resultados de la digestibilidad in vitro del bagazo pretratado se resumen en la tabla 2. Según se observa, las diferencias respecto al tratamiento control denotan claramente que el proceso degradativo fue efectivo para mejorar la calidad nutritiva de esta fuente fibrosa.

Tabla 2 Digestibilidad del bagazo de caña de azúcar pre tratado con las enzimas lacasas de C. kusanoi L7. 

Indicadores, %	Bagazo de Caña de azúcar				EE ± sign
	Sin tratar	Tratado con lacasa nativa	Tratado con lacasa inducida por T. viride	Tratado con lacasa inducida por T. pleuroticola
DMS	34,88 ^d	54,71 ^a	44,59 ^c	48,60 ^b	±0,48 P<0,0001
DMO	45,43 ^d	63,14 ^a	54,78 ^c	58,91 ^b	±0,60 P<0,0001
DFDA	50,53 ^d	63,59 ^a	56,88 ^c	61,16 ^b	±0,36 P<0,0001
DC	52,45 ^c	65,46 ^a	60,88 ^b	64,48 ^a	±0,51 P<0,0001

^a,b,c,d Letras distintas indican diferencias significativas para P<0,05 (^{Duncan, 1955}). DMS: digestibilidad de la materia seca; DMO: digestibilidad de la materia orgánica; DFDA: digestibilidad de la fibra detergente ácido y DC: digestibilidad de la celulosa.

^{Vargas y Pérez (2018)} plantearon que el empleo del bagazo de caña de azúcar se afecta por su baja digestibilidad, lo que constituye la razón fundamental para la aplicación de procesos de predigestión que permitan mejorar su calidad nutritiva. Estos pretratamientos varían desde el empleo de álcalis como el hidróxido de sodio hasta el empleo de métodos físicos con alto consumo energético que pueden llegar a incrementar la digestibilidad hasta 60%.

^{Lagos y Castro (2019)} inormaron que el bagazo de caña de azúcar a diferencia de la caña integral, presenta mayor contenido de fibra por lo que su digestibilidad es menor (alrededor de 25 %). Estos autores señalaron que el empleo de esta fuente fibrosa en la alimentación animal necesita la incorporación de diferentes metodologías y procedimientos que mejoren su bioconversión y extiendan su uso. En Veracruz, México, se desarrolló un alimento predigerido a partir del bagazo de caña de azúcar para alimentación animal. El incremento de la digestibilidad del componente fibroso se logró mediante el tratamiento químico alcalino, corroborándose mayor digestibilidad y aplicabilidad de este recurso en la alimentación de bovinos (^{Llanes 2012}).

Otra de las estrategias que también se utilizan con resultados positivos en la digestibilidad de fuentes fibrosas, es el empleo de las enzimas fibrolíticas (^{Gado et al. 2009}). Estas se emplean tanto en la alimentación de especies monogástricas como de rumiantes y permiten mejorar el grado de aprovechamiento del alimento.

En especies rumiantes, las enzimas fibrolíticas se emplean mayoritariamente como aditivos en la alimentación de bovinos, donde presentan importantes resultados al incrementar la digestibilidad de la fibra, mejorar el aprovechamiento eficiente de la energía de los pastos y disminuir los costos de las dietas (^{Mendoza, 2000}). En especies monogástricas, la adición de enzimas fibrolíticas permite alterar la estructura de la pared celular y mejorar la utilización de la fracción fibrosa del alimento. Según ^{Aranda et al. (2004)}, el tratamiento fibrolítico de fuentes alternativas de alimentación animal, permite aumentar sus niveles de inclusión en las dietas de estas especies. El empleo de productos enzimáticos fibrolíticos en la producción animal, permite no solo la optimización de las dietas sino el aprovechamiento de los nutrientes al estimular los complejos mecanismos de degradación de la fibra.

La mayoría de las compañías internacionales que comercializan productos enzimáticos fibrolíticos, presentan formulaciones basadas en enzimas celuloliticas y xilanolíticas, como es el caso de Grasszyme®, Alfazyme® y Fibrozyme® (^{Zilio et al. 2019}). En cambio, en el mercado, la mayoría de estas preparaciones adolecen de enzimas modificadoras de lignina. Se conoce que las enzimas ligninolíticas son fundamentales en la despolimerización de la lignina y por lo tanto permiten mejor acceso a las fibras de celulosa. Según ^{Lillington et al. (2020)}, la unión de la actividad celulolítica con la actividad ligninolítica es esencial para lograr mejor biodegradación de los sustratos fibrosos. Por estas razones, la inclusión de las enzimas lacasas en productos fibrolíticos, pudiera convertir estas formulaciones en tecnologías mucho más eficientes.

Capacidad lignolítica foliar de las lacasas de C. kusanoi L7 en el árbol de Limón (Citrus aurantifolia). Las hojas del árbol de limón constituyeron el sustrato de aislamiento de C. kusanoi L7, por lo que su actividad degradativa sobre éste, constituye un ejemplo de cómo las lacasas son fundamentales en el proceso de colonización y patogenicidad vegetal de este microorganismo. Por otra parte, se conoce que la actividad enzimática se afecta en gran medida por las condiciones del sustrato, por lo que es esencial evaluar diferentes condiciones de reacción para poder asegurar que se mantiene la capacidad catalítica de la enzima. Al respecto, la evaluación de la actividad lignolítica de las lacasas de C. kusanoi L7 en las hojas del árbol de limón, premite confirmar la actividad fibrolítica que poseen estas enzimas.

Se encontró que todos los tratamientos enzimáticos mostraron marcadas diferencias respecto al control sin tratar. El estado de marchitéz de las hojas, se observó casi inmediatamente después de la aspersión de la enzimas. Al cabo de las primeras 24 horas (figura 2) se encontró gran degradación de la superficie foliar y luego de las 72 horas de aplicación, se observó necrosis general del tejido y la caída de todas las hojas que se sometieron al tratamiento. Aunque las lacasas inducidas difieren de la enzima nativa, todos los tratamientos enzimaticos generaron en igual medida la despolimerización progresiva de la lignina y la consecuente degradación del tejido vegetal en corto tiempo.

Figura 2 Capacidad lignolítica foliar de las lacasas de C. kusanoi L7 a las 24 horas de tratamiento 

Se conoce que las especies de Curvularia, de conjunto con otras especies de los géneros Cladosporium, Alternaria, Epicoccum y Nigrospora son organismos degradadores primarios, que proliferan en la medida que las hojas envejecen. Sus esporas se acumulan en la superficie foliar y permanecen latentes hasta la muerte de los tejidos vegetales. Por lo general, estas especies son colonizadoras de la mayoría de los tejidos foliares senescentes de árboles caducifolios, arbustos y hierbas; acción que depende en gran medida de su producción enzimática (^{Hudson 1968}). Por su parte, ^{Valenzuela et al. (2001)} también plantearon que cerca del 80 % de la degradación de la hojarasca se debe a la actividad degradativa de las enzimas extracelulares de estos hongos. Es por ello que las enzimas aisladas a partir de estos microorganismos presentan gran potencial de degradación de estos sustratos.

Conclusiones

Las lacasas C. kusanoi L7, tanto nativas como inducidas, presentan gran potencial ligninolítico. Son capaces de modificar la estructura de la lignina y mejorar la calidad nutricional y la digestibilidad in vitro del bagazo de caña de azúcar. Estos resultados novedosos encaminan futuras investigaciones hacia la evaluación in vivo de dietas fibrosas pretratadas con lacasas para su empleo en la alimentación de especies monogástricas y rumiantes. A su vez, se presentan las primeras evaluaciones de esta enzima en la rama de la producción agropecuaria, donde la modificación de alimentos no convencionales puede constituir una alternativa sustentable para desarrollar la producción animal.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Departamento de Ciencias Agrarias, Alimentarias y Forestales de la Università degli Studi di Palermo, Sicilia, Italia, por el apoyo personal y material. Los autores también desean agradecer al laboratorio de Microbiología del Instituto de Ciencia Animal, Cuba, por el mantenimiento de las cepas.

REFERENCIAS

Alberto, M., Valiño, C.E., Ayala, M., Folch, J.L., Sánchez, R., Tapia, I. & Albelo, N. 2018. Manual de procesos para la obtención y purificación de la casa a partir del hongo Curvularia kusanoi L7. No. Registro 2137-07-2018, Oficina Cubana de la Propiedad Industrial, La Habana, Cuba

AOAC (Official Method of Analysis: Association of Official Analytical Chemists). 1995. 16th Edition. Ed. AOAC International, Arlington, Virginia, USA, ISBN: 0935584544

Aranda, E.M., Ruiz, P., Mendoza, G.D., Marcoff, C.F., Ramos, J. A. &. Elías, A. 2004. "Changes in the digestion of three varieties of sugarcane and their fiber fractions". Cuban Journal of Agricultural Science, 38(2): 137-144, ISSN: 2079-3480

Bradford, M.M. 1976. "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding". Analytical Biochemistry, 72 (1-2): 248-254, ISSN: 0003-2697, DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

Castro, M. & Martínez, M. 2015. Pig feeding with nontraditional products: fifty years of research at the Instituto de Ciencia Animal. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(2): 189-196, ISSN: 2079-3480

Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat version 2012 [Windows]. Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available: http://www.infostat.com.ar

Duncan, D.B. 1955. "Multiple range and multiple F test". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478

FAO. 2019. El estado de la seguridad alimentaria y la nutrición en el mundo. Protegerse frente a la desaceleración y el debilitamiento de la economía. Ed. Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, Roma, Italy, ISBN: 978-92-5-131600-9

Gado, H., Salem, A., Robinson, P. & Hassan, M. 2009. "Influence of exogenous enzymes on nutrient digestibility, extent of ruminal fermentation as well as milk production and composition in dairy cows". Animal Feed Science and Technology, 154(1-2): 36-46, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2009.07.006

Ghoul, M. & Chebil, L. 2012. Enzymatic Polymerization of Phenolic Compounds by Oxidoreductases. In: Enzymatic polymerization of phenolic compounds by oxidoreductases. SpringerBriefs in Molecular Science. Ed. Springer, Dordrecht, Holanda. ISBN: 978-94-007-3919-2, DOI: https://doi.org/10.1007/978-94-007-3919-2_1

Goering, H.K. & Van Soest, P.J. 1970. Forage fiber analyses: Apparatus, reagent, procedures and some applications. In: Agriculture Handbook No. 379. Ed. U.S.D.A. Agricultural Research Service, Department of Agriculture, United States of America, p. 20

Hudson. H.J. 1968. "The ecology of fungi on plant remains above the soil". New Phytologist, 67(4): 837-874, ISSN: 1469-8137, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1968.tb06399.x

Ibarra, D., Del Río, J.C., Gutiérrez, A., Rodríguez, I.M., Romero, J., Martínez, M.J. & Martínez, A.T. 2004. "Isolation of high-purity residual lignins from eucalypt paper pulps by cellulase and proteinase treatments followed by solvent extraction". Enzyme and Microbial Technology, 35(2-3): 173-181, ISSN: 0141-0229, DOI: https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2004.04.002

Kahar, P. 2013. Synergistic Effects of Pretreatment Process on Enzymatic Digestion of Rice Straw for Efficient Ethanol Fermentation. In: Environmental Biotechnology - New Approaches and Prospective Applications. Petre, M. (Ed.). Ed. IntechOpen Limited, London, United Kingdom, p. 65-87, ISBN: 978-953-51-5354-2, DOI: https://doi.org/10.5772/54949

Lagos, E. & Castro, E. 2019. "Sugar cane and by-products of the sugar agro-industry in ruminant feeding: A review". Agronomía Mesoamericana, 30(3): 917-934, ISSN: 2215-3608, DOI: https://doi.org/10.15517/am.v30i3.34668

Lillington, P., Leggieri, P., Heom, K. & O’Malley, M. 2020. "Nature’s recyclers: anaerobic microbial communities drive crude biomass deconstruction". Current Opinion in Biotechnology, 62: 38-47, ISSN: 0958-1669, DOI: https://doi.org/10.1016/j.copbio.2019.08.015

Liu, H., Wu, Z., Zeng, G., Huang, D., Shen, Y., He, X., Lai, M. & Yibin, Y. 2014. "Study on biodegradation process of lignin by FTIR and DSC". Environmental Science Pollution Research, 21: 14004-14013, ISSN: 0944-1344, DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-014-3342-5

Llanes, D. 2012. Desarrollo técnico-económicamente viable de harinas forrajeras predigeridas y enriquecidas proteicamente a partir del bagazo de caña de azúcar. MSc. Thesis. Instituto Politécnico Nacional, Altamira, México, Available: <http://repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/16125>

López, L.M., Pereda, I., Escobar, R., Pedraza, J. & Romero, O. 2018. "Efecto de la aplicación de métodos de pretratamientos en el proceso de digestión anaerobia de la biomasa lignocelulósica". Tecnología Química, 38(2): 324-334, ISSN: 2224-6185

Marrero, A.I., Dihigo, L.E., Savón, L., Machín, L. & Orta, M. 1998. "Uso del contenido fecal del cerdo para determinar in vitro la digestión de la fibra dietética en pollos de ceba". Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 32(2): 177-181, ISBN: 959-16-037-9

Mattinen, M.L., Kruus, K., Buchert, J., Nielsen, J.H., Andersen, H.J. & Steffensen, C.L. 2005. "Laccase‐catalyzed polymerization of tyrosine‐containing peptides". The FEBS Journal, 272(14): 3640-3650, ISSN: 1742-464X, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2005.04786.x

Mehandiaa, S., Shailendra, S. & Arya, K. 2020. "Isolation and characterization of an alkali and thermostable laccase from a novel Alcaligenes faecalis and its application in decolorization of synthetic dyes". Biotechnology Reports, 25(e00413): 1-9, ISSN: 2215-017X, DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00413

Mendoza, M.G.D. 2000. Uso de enzimas exógenas en la alimentación de rumiantes. In: Memorias del VIII Congreso Internacional de Nutrición Animal, Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua, Chihuahua, México, p.3-14.

Munk L., Sitarz, A.K., Kalyani, D.C., Mikkelsen, J.D., Meyer, A.S. 2015 "Can laccases catalyze bond cleavage in lignin? " Biotechnology Advances, 33(1): 13-24, ISSN: 0734-9750, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2014.12.008

Mwaikambo, Y. & Ansell, P. 2011. "Chemical modification of hemp, sisal, jute, and kapok fibers by alkalization". Journal of Applied Polymer Science, 84(12): 2222-2234, ISSN: 1097-4628, DOI: https://doi.org/10.1002/app.10460

Oliva, T., Moreno, A.D., Demuez, M., Ibarra, D., Pejó, E.T, González, C.F. & Ballesteros, M. 2015. "Unraveling the effects of laccase treatment on enzymatic hydrolysis of steam-exploded wheat straw". Bioresourse Technology, 175: 209-215, ISSN: 0960-8524, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.10.086

Perna, V., Agger, J.W., Holck, J. & Meye, A.S. 2018. "Multiple Reaction Monitoring for quantitative laccase kinetics by LC-MS". Scientific Reports, 8: 8114- 8122, ISSN: 2045-2322, DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-26523-0

Pinos, S., Rojas, C.A., Mesa, M., Londoño, L., Villavicencio, P., Montoya, J. & González, E. 2019. "Obtención de celulasas en Ecuador para la disminución de gastos en enzimas en la hidrólisis de bagazo". Centro Azúcar, 46(1): 18-28, ISSN: 2223-4861

Sun, Y. & Cheng, J. 2002. "Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review". Bioresource Technology, 83(1): 1-11, ISSN: 0960-8524, DOI: https://doi.org/10.1016/S0960-8524(01)00212-7

Valenzuela, E., Leiva, S. & Godoy, R. 2001. "Seasonal variation and enzymatic potential of microfungi associated with the decomposition of Nothofagus pumilio leaf litter". Revista Chilena de Historia Natural, 74(4): 737-749, ISSN: 0717-6317, DOI: http://dx.doi.org/10.4067/S0716-078X2001000400001

Vargas, Y.A. y Pérez, L.I. 2018. "Aprovechamiento de residuos agroindustriales en el mejoramiento de la calidad del ambiente". Revista Facultad de Ciencias Básicas, 14(1): 59-72, ISSN: 2500-5316, DOI: https://doi.org/10.18359/rfcb.3108

Wang, L.Y., Cheng, G.N & May, A.S. 2014. "Fungal solid-state fermentation and various methods of enhancement in cellulase production". Biomass and Bioenergy, 67: 319-338, ISSN: 0961-9534, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2014.05.013

Xu, F., Sun, J.X., Sun, R.C., Fowler, P. & Baird, M.S. 2006. "Comparative study of organosolv lignins from wheat straw". Industrial Crops and Products, 23(2): 180-193, ISSN: 0926-6690, DOI: https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2005.05.008

Xu, Y. Miladinov, V. & Hanna, M.A. 2004. "Synthesis and Characterization of Starch Acetates with High Substitution". Cereal Chemestry, 81(6): 735-740, ISSN: 0009-0352, DOI: https://doi.org/10.1094/CCHEM.2004.81.6.735

Zhao, C., Xie, B., Zhao, R. & Fang, H. 2019. "Microbial oil production by Mortierella isabellina from sodium hydroxide pretreated rice straw degraded by three-stage enzymatic hydrolysis in the context of on-site cellulase production". Renewable Energy, 130: 281-289, ISSN: 0960-1481, DOI: https://doi.org/10.1016/j.renene.2018.06.080

Zilio, C, Del Valle, A., Ghizzi, .G, Takiya, S., Dias, S.S., Nunes, T., Silva, G. & Rennó, P. 2019. "Effects of exogenous fibrolytic and amylolytic enzymes on ruminal fermentation and performance of mid-lactation dairy cows". Journal of Dairy Science, 102(5): 4179-4189, ISSN: 0022-0302, DOI: http://doi.org/10.3168/jds.2018-14949

Recibido: 15 de Enero de 2020; Aprobado: 29 de Marzo de 2020

^*Email. [e-mail]