CIENCIA ANIMAL

Evaluación de la actividad antioxidante y hepatoprotectora de la harina de forraje de Mucuna pruriens (L) vc. utilis y su extracto de polifenoles en ratas Sprague Dowley

Idania Scull Rodríguez^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0002-9516-7182

Lourdes Savón Valdés¹ 
http://orcid.org/0000-0001-9880-0310

Iraida Spengler Salabarria² 
http://orcid.org/0000-0002-2181-4535

Magaly Herrera Villafranca¹ 
http://orcid.org/0000-0002-2641-1815

¹Dpto. Monogástrico, Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

²Centro de Estudios de Productos Naturales, Facultad de Química, Universidad de La Habana, Cuidad de La Habana, Cuba.

Resumen

Para evaluar el efecto antioxidante y hepatoprotector de la harina de forraje de Mucuna pruriens (L) vc. utilis y su extracto de polifenoles, se utilizó un modelo de intoxicación inducida con tetracloruro de carbono (CCl₄). Se emplearon 60 ratas Sprague Dowley de ambos sexos, de 7-8 semanas de edad, distribuidas en tres tratamientos, según diseño completamente aleatorizado. Los tratamientos consistieron en un grupo control con dieta EAO-1004, que contenía la premezcla con los antioxidantes, y dos grupos experimentales, a los que se les suministró la harina de forraje de Mucuna pruriens y su extracto de polifenoles, en una dosis de 300 mg/kg de peso corporal respectivamente, en sustitución de la premezcla de la dieta control. Todos los grupos recibieron la dieta de sus respectivos tratamientos y el agua ad libitum. Al término del período experimental (30 d), los animales se sacrificaron y se estudiaron indicadores de la bioquímica sanguínea, se cuantificaron las enzimas alanino aminotrasferasa (ALT) y el aspartato aminotransferasa (AST). También se determinó la actividad de la enzima antioxidante catalasa y el estatus antioxidante de los animales. El incremento de la concentración de la enzima catalasa en hígado (10.42 UI/L) y suero (20.50 UI/L) indicó que la harina y su extracto transformaron el estado redox producido por el CCl₄. La harina de forraje y su extracto de polifenoles mostraron su efecto hepatoprotector ante la acción nociva del CCl₄, evaluado por la alanino aminotrasferasa y aspartato aminotransferasa. Los resultados señalan que es posible utilizar en la dieta de las ratas la harina de forraje y su extracto de polifenoles con efectos antioxidantes similares a los que manifiesta la dieta control, que utiliza antioxidantes sintéticos, vitaminas y minerales. Se sugiere desarrollar en animales productivos estudios similares, que incluyan trabajos de optimización de dosis para diferentes categorías de animales.

Palabras clave: estrés oxidativo; polifenoles séricos; catalasa; aspartato aminotransferasa

Los vegetales contienen sustancias biológicamente activas que pueden ejercer efectos benéficos en la fisiología, productividad y salud de los animales, al actuar como antioxidantes, antimicrobianos y antiparasitarios (^{Salazar et al. 2019}).

Evidencias científicas demuestran que el uso de algunas plantas, como las leguminosas, o de algunos de sus componentes, protegen el organismo de los daños del estrés oxidativo (^{Rojas et al. 2015}). Las leguminosas tropicales, además de constituir una fuente excelente de nutrientes, también proporcionan compuestos secundarios con determinadas estructuras químicas, capaces de aportar nuevos productos con actividad antioxidante (^{García et al. 2014}). Este es el caso de Mucuna pruriens, una leguminosa de la familia Fabaceae, con potencial para la prevención de daños derivados del estrés oxidativo, aspecto poco estudiado en Cuba hasta el momento (^{Longhi et al. 2011}).

El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antioxidante y hepatoprotectora de la harina de forraje de Mucuna pruriens (L) vc. utilis y su extracto de polifenoles, con la utilización de ratas como modelo animal.

Materiales y Métodos

Recolección del material vegetal. Se emplearon plantas de Mucuna pruriens (L) DC. vc. utilis (Wall. ex Wight) L. H. Bailey, sembradas en junio, en la época lluviosa, en un suelo de tipo pardo con carbonato (^{Hernández et al. 2019}). Se utilizó para ello un área de la finca “Ayala” del Instituto de Ciencia Animal (ICA) de la República de Cuba. Las semillas se obtuvieron en el banco de semillas de leguminosas de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes “Miguel Sistach Naya” del propio instituto. No se aplicó fertilización ni riego.

El corte de las plantas se efectuó manualmente, con cuchillo, a los 80 d de sembradas, a altura de 5 cm sobre el nivel del suelo, y cuando 100 % se encontraba en flor, según describe ^{Díaz et al. (2003)}. La parcela se cortó totalmente durante la mañana, momento en el que se seleccionaron las muestras, y se consideró la eliminación de 50 cm de efecto de borde.

Elaboración de las harinas. Las plantas (hojas, tallos tiernos y flores) se cortaron y trocearon. Posteriormente, se secaron a temperatura ambiente, en un local ventilado. Se redujo la humedad hasta 20 %, lo que se monitoreó con la determinación de la materia seca (MS) en diferentes momentos del proceso de secado. Las muestras se molinaron a tamaño de partícula de 1 mm y se almacenaron en bolsas de papel hasta el momento de su uso.

Elaboración del extracto de polifenoles. Para evaluar el efecto de los compuestos fenólicos en la actividad antioxidante in vivo, se elaboró por triplicado un extracto a partir de la harina de forraje de M. pruriens, según la metodología propuesta por ^{Makkar (2003)}. Se pesaron 100 g de la harina y se le añadieron 1000 mL de la solución hidroalcohólica (70%). Se realizó la extracción durante 15 min. con la asistencia de un equipo de ultrasonido marca Bandelin Sonorlex, serie 2000, fabricado en Alemania. Se separó el sobrenadante y al residuo sólido se le repitió tres veces el proceso de extracción. La solución resultante se filtró y se rotoevaporó (se redujo el volumen a 50%). El extracto obtenido se guardó en frascos de color ámbar y refrigeración, a temperatura de 5-8 °C hasta su uso.

Las características organolépticas del extracto hidroalcohólico, obtenido a partir de la harina de forraje de M. pruriens, fueron el color verde intenso, olor herbario y sabor insípido.

Área de la investigación. Este estudio se realizó en el Centro de Toxicología Experimental (CETEX) del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), Cuba.

El ensayo se realizó con la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL) del CENPALAB. El experimento tuvo en cuenta los Principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio (^{MINSAP 2004}), los Procedimientos Operacionales de Trabajo para la Toxicología Experimental (POT) del ^{CETEX (2012)}, y por las consideraciones sobre bioseguridad expresadas en el Manual de Bioseguridad del ^{CETEX (2012)}.

Condiciones ambientales. Las condiciones ambientales se registraron diariamente mediante un medidor de temperatura y humedad relativa, marca RH 600 (^{POT 2010}, 05.01.06.067). La temperatura media de la sala fue 23.3 ± 0.3 ºC, la humedad 67.7 ± 0.9 % y el fotoperíodo de 12:12 horas luz/oscuridad.

Animales y dietas. Se utilizaron 60 ratas jóvenes Sprague Dawley, de ambos sexos, con peso entre 125-150 g y edad promedio entre 7 y 8 semanas. Se alojaron de manera aleatoria en cajas T3 autoclaveables TECNIPLAST, plásticas traslúcidas, individuales, con fondo y tapa de rejilla de metal inoxidable.

Se distribuyeron 20 animales (10/sexo) por tratamientos. Se estableció un control, con dieta EAO 1004, que contenía la premezcla de antioxidante (butilhidroxitolueno BHT, vitaminas y minerales) (tratamiento 1), y otros dos grupos experimentales, a los que se suministró la harina de forraje de M. pruriens (tratamiento 2) y su extracto de polifenoles (tratamiento 3) en sustitución de la premezcla antioxidante, presente en la dieta control, que representó 2 %. A los grupos experimentales se les administró una dosis única de la harina de forraje (300 mg/kg de peso vivo) y su extracto de polifenoles. Las dietas se formularon de acuerdo con los requerimientos nutricionales para esta especie (^{NRC 1995}) (tabla 1).

Tabla 1 Composición química de las dietas experimentales. 

Indicadores (%)	Dieta control EAO 1004	Harina forraje (M. pruriens)	Extracto polifenoles
MS	93.40	88.54	88.91
PB	26.23	26.61	27.90
Ca	0.80	0.56	0.59
P	0.48	0.42	0.43

Ingredientes de la dieta. Las dietas estuvieron compuestas por trigo, cebada, soya, girasol, harina de pescado, azúcar, carbonato de calcio y sal común. La premezcla contenía retinol, colecalciferol, tocoferol, filoquinonas, tiamina, riboflavina, ácido pantoténico, colina, piridoxina, cobalamina, ácido fólico, ácido nicotínico, ácido ascórbico, antioxidante (BHT), magnesio, potasio, iodo, hierro, cobre, cobalto, manganeso, zinc, selenio y molibdeno.

La adaptación de los animales al alimento se efectuó al suministrar una mezcla 50:50 de la dieta EAO 1004 y la dieta correspondiente a cada grupo experimental durante tres días. Posteriormente, en un período de 7 d, consumieron la fórmula destinada a cada grupo, para culminar la adaptación al alimento. El agua y el alimento se ofrecieron ad libitum.

Procedimiento experimental. El experimento se desarrolló durante treinta días. Veinticuatro horas antes de concluir el período experimental, se les administró a los animales tetracloruro de carbono (CCl₄) al 10 % por vía intraperitoneal (dosis: 1 mL/kg de peso vivo) (POT 05.02.02.008), con el propósito de inducir el estrés oxidativo en el organismo. Posteriormente, las ratas se sacrificaron por la aplicación de una dosis letal de éter dietílico. Con previo ayuno de 12 h, se les extrajo sangre (POT 05.02.02.009) a los animales a través del seno orbital (cinco/sexo). La sangre se recolectó en viales de 2 mL, donde se dejó coagular. Luego, se centrifugó a 12 000 r.p.m. en una centrífuga Eppendorf durante 10 min. (^{POT 2010}, 05.01.06.075) y se separó el suero. Una parte se utilizó para realizar las determinaciones bioquímicas, y la otra se conservó a -80ºC para realizar otras determinaciones enzimáticas. Por último, se realizó la incisión de la cavidad abdominal y se extrajo el hígado y el intestino para preparar los homogenatos.

Preparación de los homogenatos de hígado e intestino . Se cortó una porción de los tejidos respectivos, con peso entre 1.2 y 1.5 g, aproximadamente. Se dividió en pequeños fragmentos y se lavó dos veces con 10 mL de una disolución de cloruro de sodio (NaCl) 0,9 % a 4°C. Se pesó 1 g de tejido y se adicionó10 mL de una disolución de ácido tricloroacético (5 %) con sal disódica y ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 1x10-3 M. Se homogenizó durante 6 min. a 10000 rpm, a temperatura de 4 °C. Posteriormente, se introdujo en una centrifuga refrigerada durante 15 min, a 5000 rpm y 4 °C. Al terminar se desechó el precipitado y se conservó el sobrenadante a 4 °C hasta realizar las determinaciones enzimáticas convenientes.

Observaciones clínicas. Las observaciones clínicas se realizaron diariamente en horas de la mañana durante todo el período experimental. Se evaluó el estado general de los animales (^{POT 2010}; 05.02.02.002), así como la aparición de cambios en piel y pelaje, membranas mucosas y ojos, sistemas respiratorio, circulatorio, nervioso central y autónomo, actividad somatomotora, y patrón de comportamiento. Se prestó particular atención a la aparición de diarreas, temblores, convulsiones, letargos, salivaciones, sueño, coma y/o posibles muertes.

Determinación de la catalasa. La actividad de esta enzima se determinó según la metodología descrita en el ^PNO/TEC/0314, del Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas (CEIEB) en Cuba. El método se basa en medir la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno, catalizada por la enzima catalasa, a longitud de onda de 240 nm. Se utilizó para ello un espectrofotómetro (^{Boehringer 1987}). La actividad de la catalasa se expresó en unidades internacionales por litro (UI/L).

Fenoles totales en suero (FT). Para determinar la concentración de polifenoles totales se utilizó una disolución de referencia de ácido tánico (Sigma Aldrich), a concentración 0.5 g/L. El análisis se realizó mediante el uso del reactivo de Folin-Ciocalteau, según la metodología descrita por ^{Makkar (2003)}.

Indicadores de la bioquímica sanguínea. Se utilizaron 10 animales por tratamiento (5 por sexo). Se determinó colesterol total (CHOL-T), triglicéridos (TG), ácido úrico (AU), proteínas totales (PT), fosfatasa alcalina (ALP), alanino aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST). Se usó para estas determinaciones un analizador automático Cobas Integra 400 PLUS (Roche Diagnostic Systems) (POT 05.01.06.081).

Análisis estadístico. Se probaron los supuestos teóricos del análisis de varianza para las variables ALT y AST para la normalidad de los errores. Se utilizó la dócima de ^{Shapiro-Wilk (1965)} y la homogeneidad de varianza (^{Levene 1960}). Ambas variables cumplieron con dichos supuestos, por lo que se empleó un diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial 3 x 2. Los factores fueron los tres tratamientos (control, harina de forraje y extracto de polifenoles) y los sexos (hembras y machos). Los resultados se analizaron por el paquete estadístico Infostat (^{Di Rienzo et al. 2012}). Para la comparación de medias se empleó la dócima de comparación de rangos múltiples de ^{Duncan (1955)} para P<0.05.

Resultados y Discusión

Durante el desarrollo del experimento no se hallaron alteraciones asociadas a efectos del tratamiento en los signos clínicos de los animales, cuyo comportamiento fue normal para la especie, excepto un animal macho del tratamiento 3, que mostró ruidos crepitantes y aparente aumento de la frecuencia respiratoria, entre los días 9 y 11 del estudio. El ensayo concluyó con supervivencia del 100 %.

La determinación del efecto antioxidante de la harina de forraje y su extracto de polifenoles se evaluó por la cuantificación de la actividad enzimática de la catalasa en suero, hígado e intestino. Se encontró interacción de los factores tratamiento y sexo para esta enzima (tabla 2).

Tabla 2 Actividad de la enzima antioxidante catalasa en suero, hígado e intestino de ratas Sprague Dawley, tratadas con la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles. 

Actividad catalasa (UI/L)	Sexo	Treatment			(±) EE Signif.
		Control	Harina forraje	Extracto polifenoles
Suero	Macho	15.08 ^a	16.42 ^a	20.50 ^b	0.11 P=0.0493
	Hembra	15.08 ^a	16.00 ^a	15.33 ^a
Hígado	Macho	12.17 ^b	10.42 ^b	6.67 ^a	0.76 P=0.0063
	Hembra	6.42 ^a	6.05 ^a	6.03 ^a
Intestino	Macho	4.33 ^a	4.33 ^a	3.92 ^a	0.53 P=0.0166
	Hembra	8.00 ^b	5.08 ^a	4.77 ^a

^a,b Letras distintas por filas indican diferencias significativas para P < 0.05

La actividad sérica de la catalasa mostró valores superiores (P < 005) en los machos del tratamiento con el extracto de polifenoles. Mientras, en el hígado se observó mayor actividad de la enzima en los machos del tratamiento con la harina de forraje, que fue similar al control. En el caso del intestino, los tratamientos experimentales y el control de los machos presentaron menor actividad de la catalasa que la hallada en las hembras del grupo control.

Los compuestos fenólicos que aporta el extracto de polifenoles son los principales responsables del incremento de la actividad de la enzima antioxidante catalasa en el suero sanguíneo. La literatura informa que los polifenoles, que componen los diferentes extractos vegetales y alimentos, incrementan los niveles de antioxidantes endógenos, como las enzimas superóxido dismutasa y catalasa (^{Gupta et al. 2006}).

A varios flavonoides se les conoce por su capacidad de inhibir la formación de radicales libres, aspecto relacionado con la estructura química básica de estos compuestos. Los grupos hidroxilos en los C₅ y C₇, unidos por el doble enlace entre los C₂ y C_3, son esenciales para su alta actividad inhibitoria en la formación de los radicales libres (^{Spanou et al. 2012}). ^{Scull (2018)} identificó flavonas glicosiladas en la harina de forraje de M. pruriens, compuestos que corresponden con este tipo de estructura, por lo que la actividad inhibidora observada en este estudio se le puede atribuir, en parte, a las características estructurales de estos compuestos fenólicos.

En el hígado, el aumento de la actividad de la enzima, en el grupo control como en el tratamiento de la harina, parece responder al efecto del elevado número de compuestos bioactivos de diferente estructura química presentes en la dieta. Resultados similares a los de este estudio señalaron ^{Batista et al. (2015)}, al evaluar la actividad antioxidante in vivo de la fruta de buriti (Mauritia flexuosa) en la ratas Wistar, y no encontrar diferencias entre los valores de catalasa de los grupos experimentales y el control.

Al analizar el intestino, se observó que hubo diferencias significativas entre los tratamientos y el sexo. Sin embargo, las hembras que consumieron el tratamiento control fueron las que presentaron mayor actividad en este órgano. Este resultado puede estar relacionado con que la utilización de un solo nivel de dosis para los productos de ensayos (300 mg/kg de peso vivo) no fue suficiente para que la harina y su extracto de polifenoles mostraran defensas antioxidantes en este órgano. Este aspecto se agrava, debido a que el alto contenido de fibra (FDN) que tiene la harina pudo incrementar estos daños.

El CCl₄ induce el estrés oxidativo y daños en el intestino, los que superan la capacidad antioxidante de la enzima catalasa, con la consecuente disminución de su actividad respecto al control de las hembras. Estos resultados son similares a los informados por ^{Stojanović et al. (2016)}, quienes observaron la disminución de la actividad de la enzima catalasa en el intestino de ratas Wistar, al administrarle una solución de D.L homocisteina tiolactona.

El estado antioxidante de los animales se determinó mediante la concentración de compuestos fenólicos en el plasma. No se encontró interacción de los tratamientos y los sexos para los polifenoles séricos. En las figuras 1 y 2 se muestran los resultados de los polifenoles totales en el suero de las ratas Sprague Dawley en experimentación, para los componentes tratamiento y sexo.

P=0.0098; EE (±) 0.67

Figura 1 Concentración de polifenoles totales en el suero de ratas tratadas con la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles. 

La concentración de polifenoles totales en el suero de los animales que consumieron la harina de forraje fue similar a la del control, y difirió del contenido de polifenoles del grupo que ingirió el extracto de polifenoles. Esto se puede deber a las estructuras químicas de los flavonoides glicosilados presentes en el extracto, ya que las agliconas y su glucósido pueden generar derivados, que pueden ser hidrosolubles y más fácilmente excretables (^{Kamiloglu et al. 2013}).

Varios estudios coinciden en señalar que compuestos con propiedades antioxidantes, como los polifenoles, pueden mejorar el estado antioxidante/oxidante en el organismo (^{Quiñones et al. 2012} y ^{Prescha et al. 2018}). Sin embargo, los resultados están relacionados con la fisiología de cada especie animal, ya que la acción de estos compuestos dependerá directamente de su biodisponibilidad y de factores intrínsecos (pH gástrico, actividad de las enzimas digestivas y microflora bacteriana). Estos aspectos pueden inducir la hidrólisis y/o transformación de los polifenoles a moléculas biológicamente activas y biodisponibles (^{Lizárraga-Velázquez et al. 2018}).

P=0.0008; EE (±) 0.54

Figura 2 Concentración de polifenoles totales en el suero de ratas hembras y machos, tratadas con la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles. 

En el componente sexo se encontró mayor (P<005) concentración de polifenoles en el suero del total de ratas hembras con respecto al total de los machos. El género es otro factor que está asociado con las diferencias en el estrés oxidativo, probablemente debido a la presencia de estrógenos con propiedades antioxidantes en las hembras. Los estrógenos presentan un grupo hidroxilo en la posición C_3, que permite eliminar especies reactivas del oxígeno y por tanto, manifestar su efecto protector ante el daño celular de los radicales libres (^{Kander et al. 2017}).

La evaluación del efecto antioxidante y hepatoprotector de la harina de forraje y su extracto de polifenoles ante la intoxicación hepática, inducida por el tetracloruro de carbono (CCl₄), se realizó por la actividad de las transaminasas. En los niveles séricos de las enzimas alanino aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) se encontró interacción de los factores tratamientos y sexos para ambas enzimas (tabla 3).

Tabla 3 Enzimas transaminasas en suero sanguíneo de ratas tratadas con la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles.  

Variable	Sexo	Treatment			(±) EE Signif.
		Control	Harina forraje	Extracto polifenoles
ALT (U/L)	Macho	67.00 ^a	126.67 ^ab	72.00 ^a	28.62 P=0.0385
	Hembra	187.00 ^b	80.67 ^a	133.33 ^ab
AST (U/L)	Macho	187.00 ^a	349.67 ^bc	202.67 ^ab	50.11 P=0.0366
	Hembra	488.00 ^c	389.33 ^c	496.67 ^c

^a,b,c Letras distintas por filas indican diferencias significativas para P<0.05

La actividad sérica de la enzima ALT difirió (P<0,05) entre hembras y machos que recibieron el tratamiento control. Los grupos que consumieron los tratamientos restantes presentaron comportamiento similar en ambos sexos. La actividad enzimática de la ALT en el grupo control de los machos no tuvo diferencias significativas entre los grupos a los que se le añadió el extracto de polifenoles y el forraje de mucuna para las hembras y machos, respectivamente. En los niveles séricos de la enzima AST no se apreciaron diferencias entre los grupos de hembras que consumieron estos tratamientos, los que mostraron los mayores valores de actividad. Con respecto a los machos, se observó que no hubo diferencias significativas en los grupos del control, y aquellos que consumieron el tratamiento de la harina.

Al analizar estos resultados, se observó que la administración de CCL₄ produjo en las ratas hembras del tratamiento control incremento de los niveles séricos de ALT por encima de los valores de referencia (32,2-80,9 UI/L), informados por ^{Alemán et al. (1998)} y ^{León et al. (2011)} para la especie Sprague Dawley. Esta observación se documentó por distintos autores durante la evaluación de la actividad antioxidante de diferentes sustancias, en las que se utilizó un modelo de intoxicación hepática con tetracloruro de carbono (^{Gupta et al. 2006} y ^{Bhoomannavar et al. 2011}). En contraposición, los machos mostraron una actividad que se considera en los límites referenciados para este sexo, según los autores previamente citados.

Un aspecto a destacar en las ratas hembras es la disminución de los niveles séricos de ALT en el grupo correspondiente a la harina de forraje de mucuna con relación al grupo control (P<005). Esto evidencia la eficiencia de la harina de forraje como antioxidante natural para contrarrestar los efectos tóxicos del CCl₄.

La ALT es una enzima que se halla en la mitocondria de los hepatocitos, cuyo paso al medio circundante se produce debido a un daño en el funcionamiento hepático. El CCl₄ es un inductor químico del daño hepático, por lo que el suministro ocasiona aumento de los niveles séricos de esta enzima como un efecto secundario (^{Weber et al. 2003}). En este sentido, la administración de sustancias con propiedades antioxidantes podría evitar o disminuir el efecto tóxico de esta sustancia.

En el caso de la enzima AST, el efecto protector se observa mejor para los machos del tratamiento donde se administró el extracto de polifenoles. En las hembras, aunque las concentraciones séricas de esta enzima no difirieron entre tratamientos, la actividad enzimática fue superior a los niveles referenciados (253 UI/L) (^{León et al. 2011}). Lo anterior se puede deber a la alta dispersión de los datos (EE= 50.11 %).

Asimismo, la AST está presente en el citosol y mitocondria de células hepáticas, corazón, músculo esquelético, cerebro, riñón, páncreas, pulmón, eritrocitos y linfocitos, por lo que los niveles elevados de AST no son específicos de daño hepático (^{Grattagliano et al. 2009}). Los resultados con la enzima ALT son similares a los señalados por ^{Yang et al. (2018)} en la evaluación del efecto hepatoprotector del ácido metil ferúlico ante el estrés oxidativo inducido por el CCl₄ en ratas.

Sustancias como las proteínas totales y el ácido úrico actúan como mecanismos de defensa contra el daño oxidativo de fluidos corporales. En este experimento, donde se analizó el efecto de la sustitución de la premezcla antioxidante del grupo control por la harina de forraje y su extracto de polifenoles en los indicadores de la bioquímica sanguínea, no se observaron interacciones significativas entre sexos y tratamientos. En las tablas 4 y 5 se muestran las determinaciones para los efectos principales.

Tabla 4 Comportamiento de los indicadores de la bioquímica sanguínea en ratas tratadas con harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles. 

Bioquímica sanguínea	Control	Harina forraje	Extracto polifenoles	(±) EE Signif.	Valores de referencia^1
ALP (U/L)	110.33	119.67	120.00	11.66 P=0.8047	82.8-311.7
PT (g/L)	68.00	66.48	67.93	1.49 P=0.7246	56.69-73.5
AU (mg/dL)	0.89	1.01	0.84	0.12 P=0.5957	0.87-4.72
CHOL-T (mmol/L)	1.95	1.91	1.84	0.15 P=0.8670	2.23-4.70
TG (mmol/L)	0.66	0.82	0.60	0.12 P=0.4242	2.49-6.65

¹Valores de referencias, según ^{León et al. (2011)}.

Tabla 5 Componente sexo para los indicadores de la bioquímica sanguínea en ratas tratadas con la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles.  

Bioquímica sanguínea	Hembra	Macho	(±) EE Signif.	Valores de referencia^1
ALP (U/L)	86,33	147,00	9,52 P=0,0007	H: 82,8- 297,3 M: 85,4- 311,7
PT (g/L)	69,30	65,64	1,22 P=0,0550	H: 56,69-73,5 M: 59,9- 73,5
AU (mg/dL)	0,89	0,94	0,10 P=0,7289	H: 2,22- 4,72 M: 0,97- 4,72
CHOL-T (mmol/L)	2,14	1,66	0,12 P=0,0188	H: 2,28- 3,28 M: 2,23- 4,70
TG (mmol/L)	0,52	0,86	0,10 P=0,0313	H: 4,24-7,37 M: 2,49-6,65

¹Valores de referencia, según ^{León et al. (2011)}.

La administración de CCl₄ a las ratas no ocasionó diferencias para el factor tratamiento (tabla 5). Todos los indicadores analizados fueron similares a los valores de referencia para la especie (^{León et al. 2011}).

^{Al Said et al. (2011)} encontraron al utilizar el modelo de CCl₄ en ratas que el extracto etanólico de Grevistenax, en dosis de 250 mg/kg, previno significativamente la elevación de la fosfatasa alcalina.

En diferentes investigaciones de productos naturales con actividad hepatoprotectora y antioxidante se refiere, generalmente, disminución de la síntesis de proteínas, causada por el tetracloruro de carbono (^{Bhoomannavar et al. 2011} y ^{Heba et al. 2011}). Estos informes no se corresponden con los resultados hallados en este experimento, lo que pudiera significar que la harina de forraje de mucuna y su extracto de polifenoles ejercieron su acción antioxidante. Esto no permitió que se afectara la capacidad biosintética del hígado.

Los niveles séricos de colesterol y triglicéridos de los tratamientos experimentales fueron similares al control. Se conoce que el CCl₄ causa daño hepático por medio de procesos de peroxidación de los lípidos presentes en la membrana del tejido hepático, o sea, a través de mecanismos oxidantes (^{Surendra y Bodakhe 2007}, ^{Bhoomannavar et al. 2011} y ^{Heba et al. 2011}). A este hecho contribuye que el tetracloruro de carbono es un compuesto muy lipofílico, que pudiera también actuar aumentando la solubilidad de las grasas y facilitando su transporte hacia el torrente sanguíneo (^{Surendra y Bodakhe 2007}).

Con relación al factor sexo (tabla 5), se encontró que los machos difirieron de las hembras en todos los indicadores analizados, excepto en los niveles de AU. Las hembras, en general, fueron superiores a los machos para proteínas totales y colesterol, en tanto que los machos superaron a las hembras en los valores séricos de fosfatasa alcalina y triglicéridos.

El hecho de que los machos tengan concentraciones séricas de fosfatasa alcalina más elevadas que las hembras se puede deber a que crecen más rápido, y esta enzima alcanza valores más altos en animales de rápido crecimiento (^{Wolford et al. 1986}). Resultados similares hallaron ^{Alemán et al. (1998)} y ^{Hatayama et al. (2003)}, cuando analizaron indicadores de la bioquímica sanguínea en las ratas de laboratorio de la especie Sprague Dawley.

^{León et al. (2011)}, al informar los rangos de comportamiento normal para los indicadores hematoquímicos en ratas, argumentaron que las diferencias entre género se pueden explicar debido al tamaño físico del organismo y a los cambios hormonales de cada sexo. ^{Kander et al. (2017)} señalaron la relación entre el género y el estrés oxidativo, ya que el estrés está involucrado en muchas enfermedades que se presentan de manera diferente entre varones y hembras. Para que ocurra el estrés oxidativo, debe existir desequilibrio entre la producción de ERO y el sistema de defensa antioxidante. Por tanto, se considera que hay diferencia en la expresión y/o actividades de las enzimas antioxidantes entre hombres y mujeres.

A pesar de los resultados mostrados hasta el momento, se necesita mayor número investigaciones para explorar mejor la función que desempeña el género en la expresión génica de los antioxidantes y otros genes asociados al estrés oxidativo.

Los resultados de este experimento mostraron que la harina de forraje de M. pruriens y su extracto de polifenoles poseen actividad antioxidante y funciones hepatoprotectoras contra el daño del estrés oxidativo en ratas Sprague Dawley. Se sugiere evaluar su potencial antioxidante en animales productivos e incluir estudios de optimización de dosis para diferentes categorías de animales.

El estudio realizado debe contribuir e incentivar el aprovechamiento del valor agregado de esta leguminosa como recurso local para la alimentación animal, ya que el uso de plantas en los sistemas productivos todavía es insuficiente.

Agradecimientos

Se agradece a los investigadores, especialistas y técnicos del Centro de Toxicología Experimental (CETEX), del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), por la realización de una parte de este experimento.

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Recibido: 24 de Junio de 2019; Aprobado: 21 de Febrero de 2020

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