Ciencia de los Pastos

Selección de rizobios promisorios para la inoculación de leguminosas herbáceas en suelos salinos

I. Hernández^{1  *} 

Susana L. Estévez² 
http://orcid.org/0000-0001-8616-2155

Maida D. Peña² 
http://orcid.org/0000-0002-7886-0399

María C. Nápoles¹ 
http://orcid.org/0000-0003-1413-1717

¹Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, C.P. 32 700

²Universidad de Holguín, Sede “Oscar Lucero Moya”. Gaveta postal 57, Holguín, C.P. 80100

Resumen

La salinidad de los suelos constituye un factor limitante del crecimiento y desarrollo de leguminosas de interés agrícola y ganadero. El objetivo de este trabajo fue seleccionar aislados de rizobios con potencialidades para mejorar el establecimiento de leguminosas herbáceas en suelos salinos. Se estudió el patrón de nodulación de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L.) DC., Alysicarpus vaginalis (L.) DC. y Crotalaria retusa L., establecidas en un suelo fuertemente salino y en condiciones de déficit hídrico. Se aislaron posibles rizobios de la rizosfera y de nódulos de estas plantas y se caracterizaron cultural, morfológica y fisiológicamente. Además, se realizaron ensayos de nodulación de los aislados de rizobios en plantas de siratro, en condiciones controladas. Las tres leguminosas presentaron nódulos pequeños y escasa nodulación. Se obtuvieron 12 aislados posibles rizobios. De ellos, 66.7 % presentó características culturales y fisiológicas similares a cepas de la familia Rhizobiaceae y 33.3 % a cepas del género Bradyrhizobium. De estos aislados, 100 % produjo nódulos efectivos en la fijación biológica del nitrógeno en plantas de siratro. Las plantas que se inocularon con los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 presentaron mayor número y masa seca de los nódulos, masa seca aérea y masa seca radical. Estos aislados sobreviven saprofíticamente en suelos afectados por el déficit hídrico y la salinidad, cualidad que los hace atractivos para la elaboración de biopreparados que permitan la rehabilitación de pastos y forrajes en las condiciones citadas.

Palabras clave: Rhizobium; salinidad; forraje; caracterización; crecimiento

Tradicionalmente, las leguminosas herbáceas de los géneros Desmodium, Alysicarpus y Crotalaria se han utilizado en el control de la erosión del suelo, en la restauración de sus propiedades químicas, y como forraje y abono verde (^{Midega et al. 2017} y ^{DemLew et al. 2019}). Además, incrementan la disponibilidad de macro y micronutrientes para cultivos acompañantes (^{Chidowe et al. 2014} y ^{Trevisan et al. 2017}). Desmodium y Alysicarpus tienen amplias perspectivas para el desarrollo de la ganadería, pues poseen elevada palatabilidad, no son tóxicos, tienen alto valor nutritivo y buena digestibilidad de su masa seca (^{Arango et al. 2016}). Los biopreparados elaborados basados en Crotalaria causan mortalidad a poblaciones de insectos plaga y herbicidas (^{Atuesta et al. 2017} y ^{da Costa et al. 2019}).

Gran parte de las bondades de estas leguminosas en los suelos dedicados a la ganadería se deben a la asociación simbiótica que establecen con bacterias fijadoras de nitrógeno, denominadas rizobios (^{García et al. 2018}). Sin embargo, muchos de estos suelos se encuentran afectados por factores como el déficit hídrico y la salinidad, que explican la baja calidad de los pastizales y su alto nivel de degradación, fenómeno que se traduce en insuficiente productividad ganadera (^{Machado 2009}). Estudios previos constataron que el déficit hídrico como la salinidad afectan a la leguminosa, al rizobio y, de manera más drástica, a la simbiosis entre ambos organismos (^{Yamal et al. 2016} y ^{Fuskhah et al. 2019}).

Las múltiples experiencias en el uso de las leguminosas para reforestar áreas degradadas, suelos carentes de materia orgánica y afectados por la salinidad, sirven como indicativo del potencial de este grupo de plantas en la sostenibilidad de los sistemas de producción agrícola y ganadera (^{Castro et al. 2017}). Una manera de hacer esto posible es inocular leguminosas forrajeras con cepas de rizobios previamente seleccionadas, que se encuentren adaptadas a las condiciones de estrés del suelo, y que tengan la capacidad de colonizar y formar nódulos efectivos en la fijación biológica del nitrógeno (FBN) (^{Franzini et al. 2019} y ^{Tewari y Sharma 2020}).

En investigaciones recientes se ha demostrado que la inoculación de leguminosas con rizobios en condiciones de estrés hídrico y salino produce disminución de la producción de etileno, aumenta la tolerancia de las plantas al estrés e incrementa la nodulación y la fotosíntesis (^{Khaitov et al. 2020}). A partir de lo anterior, el objetivo de esta investigación fue seleccionar aislados de rizobios con potencialidades para mejorar el establecimiento de leguminosas herbáceas en suelos salinos.

Materiales y Métodos

El estudio se realizó a partir de nódulos y suelo rizosférico de tres géneros de leguminosas herbáceas, identificadas taxonómicamente: Desmodium triflorum (L.) DC. Alysicarpus vaginalis (L.) DC., y Crotalaria retusa L, pertenecientes a la familia Fabaceae (^{Romero et al. 2015} y ^{Almaguer et al. 2017}). Las plantas se encontraban establecidas en un suelo Solonchak, fuertemente salino (^{Hernández et al. 2015}), de la Unidad Empresarial de Base (UEB) Ganadera “Rafael Quintana”, en el consejo popular Sabanazo, municipio Calixto García, provincia Holguín. El estudio taxonómico se desarrolló en el período de sequía, entre enero y febrero de 2014. Aunque no se conoce el tiempo de permanencia de las leguminosas en este ecosistema, se plantea que estuvieron sometidas a sequía moderada-severa, con acumulados promedio de lluvias, de solo 200 mm (^{Rromero et al. 2015}).

Caracterización de nódulos de leguminosas herbáceas establecidas en un suelo salino. Se seleccionaron tres plantas sanas de cada una de las especies, sin indicios de ataque de plagas o presencia de enfermedades, provenientes de seis puntos de muestreo de la UEB Ganadera “Rafael Quintana”. Se determinaron variables relacionadas con la nodulación: densidad de la nodulación total y de la nodulación en la raíz principal, tamaño y forma de los nódulos.

En cuanto a la densidad de la nodulación total y en la raíz principal, se calificó de escasa la de plantas que presentaron de 0 a 10 nódulos; media para las de 11 a 50, y abundante para las plantas de más de 50 nódulos. Los nódulos con diámetro de 1.0 a 1.5 mm se consideraron pequeños; de 1.5 a 3.0 mm medianos, y grandes los de más de 3.0 mm de diámetro. Se catalogaron además, como esféricos o polimórficos, según su morfología externa (^{Bécquer et al. 2016}). En el momento del muestreo, se colocaron en recipientes cerrados, que contenían cloruro de calcio (CaCl2) y se conservaron a 4 oC hasta su traslado al Laboratorio de Microbiología del Departamento de Fisiología y Bioquímica, del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA).

Aislamiento y caracterización de posibles rizobios asociados a leguminosas herbáceas establecidas en un suelo salino. El aislamiento de los posibles rizobios se realizó a partir del suelo rizosférico y de nódulos de las tres especies de leguminosas. Para el aislamiento a partir del suelo rizosférico, se realizaron diluciones decimales seriadas a partir de 1 g de suelo. Las diluciones se cultivaron por diseminación en placas Petri, que contenían medio sólido levadura manitol (LM) (^{Vincent 1970}) y se incubaron a 30 oC durante 10 d.

El aislamiento a partir de los nódulos comenzó con su hidratación en agua destilada, durante 5 min. Luego, se desinfectaron superficialmente con etanol al 95 %, durante 45 seg. y con hipoclorito de sodio al 0.1 % (p/v) por 4 min. Seguidamente, los nódulos se lavaron seis veces con agua destilada estéril en condiciones de asepsia. Con pinzas estériles se transfirieron a tubos de hemólisis, que contenían 500 μL de solución salina (NaCl 8.5 g L-1). Los nódulos se maceraron y 0.1 mL de la suspensión se cultivó por diseminación en placas que contenían medio LM sólido, las que se incubaron a 30 oC durante diez días (^{Sosa et al. 2004}).

De las colonias bacterianas resultantes de ambos procesamientos, se seleccionaron las que presentaron características culturales similares a las descritas en la literatura para el grupo de los rizobios (^{Wang y Martínez-Romero 2001}). Se realizaron cultivos sucesivos de los aislados en medio LM sólido para garantizar su pureza, y se conservaron a 4 oC en tubos de ensayo que contenían el mismo medio de cultivo.

Posteriormente, se realizó la caracterización cultural, morfológica y fisiológica de los aislados bacterianos antes seleccionados, con el propósito de un acercamiento a su identificación como posibles rizobios. Los aislados que no presentaron características similares a las antes descritas para este grupo de bacterias (^{Wang y Martínez Romero 2001}) se descartaron de las determinaciones sucesivas.

Para la caracterización cultural, los aislados se cultivaron por triplicado en el medio LM sólido, y se incubaron a 30 oC durante 10 d. Como aspectos culturales se tuvieron en cuenta el color, la mucosidad y el tamaño de las colonias. Con respecto al diámetro, se consideraron colonias grandes las de diámetro mayor de 2.0 mm; medianas las que tuvieron entre 1-2 mm, y pequeñas las de menos de 1 mm de diámetro. Se utilizó la tinción de Gram para la caracterización morfológica de los aislados, en la que se tuvo en cuenta la morfología de la célula, respuesta a la tinción y presencia de endoesporas.

Desde el punto de vista fisiológico, se determinó el tiempo de aparición de la colonia, producción de ácido o base y capacidad para producir nódulos en una leguminosa modelo. Para el primer caso, los aislados se sembraron en el medio LM sólido y se registró el momento en que se hicieron visibles a simple vista. Las colonias bacterianas se pudieron observar cada 24 h, durante 10 d de incubación, a 30 oC. Los aislados, cuyas colonias se pudieron ver en el medio a los dos o tres días, se consideraron de crecimiento rápido. Los aislados con colonias, que aparecieron de cuatro a cinco días, se catalogaron de crecimiento moderado, y aquellas que se observaron a partir de los siete, se clasificaron como microorganismos de crecimiento lento (^{Wang y Martínez-Romero 2001}).

Para determinar la capacidad de los aislados bacterianos para producir ácido o base, se cultivaron por triplicado y por agotamiento en el medio LM sólido, que se suplementó con el indicador azul de bromotimol (0.5 % en NaOH 0.016 N). Las placas se incubaron a 30 oC, durante 10 d. El cambio de coloración del medio, de verde a amarillo, se interpretó como la producción de ácidos orgánicos, y el cambio de verde a azul como la producción de bases (^{Sosa et al. 2004}).

Como parte de la caracterización fisiológica, también se evaluó la capacidad de los aislados bacterianos para formar nódulos en plantas de Macroptillium atropurpureum (Moc. y Sessé ex DC.) Urb. (siratro). Primeramente, se prepararon los inóculos de los aislados a partir de la inoculación de una asada de estos en Erlenmeyers de 100 mL, que contenían 20 mL de medio LM. Los frascos se mantuvieron en agitación, en zaranda orbital a 150 r.p.m. y 30 oC, de 18-20 h para los aislados de crecimiento rápido, y de 56-58 h para los de crecimiento lento. La pureza de los cultivos se determinó mediante la tinción de Gram. Por último, se ajustó la absorbancia de los cultivos bacterianos a una DO = 0.1 (λ= 600 nm), en un espectrofotómetro luz visible / luz ultravioleta (GENESYS 6).

Paralelamente, se realizó la desinfección superficial y la pregerminación de las semillas de siratro. Las semillas se desinfectaron con etanol a 70 %, durante 5 min. Luego, se lavaron con agua destilada y se sumergieron en ácido sulfúrico concentrado por 10 min. Después, las semillas se mantuvieron en una solución de hipoclorito de sodio al 25 % (v/v), durante 15 min. y se lavaron diez veces con agua destilada estéril. Por último, se colocaron en placas con agar-agua (0.75 % v/v) y se incubaron a 30 oC en la oscuridad, durante 24 h, para favorecer su germinación (^{Pérez et al. 2008}).

Las semillas pregerminadas con aproximadamente 1 cm de raíz emergente se colocaron en frascos de 70 mL de volumen, que contenían 50 mL de medio semisólido Norris y Date (^{Norris y Date 1967}), a razón de una semilla por frasco, y se inocularon con 1 mL de los inóculos bacterianos. Las plántulas que se inocularon con 1 mL de medio LM estéril, se consideraron como control negativo del experimento. Las plantas se mantuvieron en condiciones controladas de crecimiento, con fotoperíodo de 16 h luz/8 h oscuridad, a temperatura día / noche de 26 oC / 22 oC y humedad relativa de 70 %. Cuatro semanas después de la inoculación, se determinó el número de nódulos en la raíz principal (NNRP), número de nódulos totales (NNT), efectividad de los nódulos y masa seca de los nódulos totales (MSNT). Se determinó, además, la masa seca aérea (MSA) (g) y la masa seca radical (MSR) (g) de las plantas de siratro.

Diseño y análisis estadístico. El ensayo de inoculación de los aislados bacterianos en plantas de siratro se realizó mediante un diseño completamente aleatorizado. Se utilizaron siete réplicas por tratamiento. Los datos resultantes se sometieron a la prueba de normalidad (prueba de ^{Babtlett, Babtlett 1937}) y a homogeneidad de varianza (prueba de Kormogorov-Smirnov, ^{Kolmogorov 1933}). Se aplicó análisis de varianza de clasificación simple mediante la comparación de medias de Tukey, para P < 0.05, con el objetivo de determinar diferencias entre medias (^{Sigarroa 1985}). Se utilizó el programa Statgraphic plus, versión 5.0 para el procesamiento estadístico de los datos. Estos se graficaron en el programa Sigmaplot para Windows, versión 11.0.

Resultados

Las tres leguminosas herbáceas, establecidas en suelos fuertemente salinos y en condiciones de déficit hídrico, tienen nodulación escasa. Los resultados mostraron que todas las plantas tuvieron una nodulación total escasa, comportamiento que también se visualizó en la raíz principal. Incluso, en el punto de colecta número 5 (p5), las plantas de A. vaginalis (L.) DC. carecieron de nódulos. D. triflorum (L.) DC. y A. vaginalis (L.) DC. presentaron nódulos pequeños y esféricos. Sin embargo, en las raíces de C. retusa L. se visualizaron medianos y polimórficos (tabla 1).

Tabla 1 Patrón de nodulación de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L) DC., Alysicarpus vaginalis (L) DC. y Crotalaria retusa L., establecidas en condiciones de déficit hídrico, en un suelo fuertemente salino. 

Puntos de muestreo	Leguminosa herbácea	Nodulación
		Total	Raíz principal	Tamaño de los nódulos	Forma de los nódulos
P1	Desmodium triflorum (L.) DC	Escasa	Escasa	Pequeño	Esférica
P2	Desmodium triflorum (L.) DC.
P3	Alysicarpus vaginalis (L.) DC.		Escasa	Pequeño	Esférica
P4	Alysicarpus vaginalis (L.) DC.		Escasa	Pequeño	Esférica
P5	Alysicarpus vaginalis (L.) DC.		Sin nódulos	Pequeño	Esférica
P6	Crotalaria retusa L.		Escasa	Mediano	Polimorfo

En la rizosfera e interior de los nódulos de las tres leguminosas herbáceas habitan poblaciones de posibles rizobios.

Un total de 15 aislados posibles rizobios se obtuvieron de la rizosfera y de los nódulos de las tres leguminosas herbáceas estudiadas. De ellos, 20 % provino de D. triflorum (L.) DC., 53.3 % de A. vaginalis (l.) DC. y 26.7 % de C. retusa L. La mayoría de los aislados procedentes de Alysicarpus se obtuvieron de sus nódulos, mientras que en C. retusa L. fue 100 % (tabla 2).

Tabla 2 Caracterización y posible identificación de aislados bacterianos, provenientes de la rizosfera y nódulos de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L.) DC., Alysicarpus vaginalis (L.) DC. y Crotalaria retusa L., establecidas en suelos salinos 

Sitio de aislamiento	Aislados	Caracterización				Posible Identificación
		Cultural	Morfológica	Fisiológica
				Tipo de crecimiento	Ácido o base
Desmodium triflorum (L.) DC.
Nódulos	Riz 1-1	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
S. Rizosf	Riz 1-2	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 2-1	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Cocobacilos, G -, esporul.	-	-	-
Alysicarpus vaginalis (L.) DC.
Nódulos	Riz 5	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 5-1	Rosado pálido, secas, pequeñas	Bacilos, G -, no esporul.	Lento	Base	Bradyrhizobium
	Riz 5-2	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 6	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 6-1	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 7-1	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
	Riz 7-2	Semitranslúcidas, mucosas, grandes	Bacilos, G -, no esporul.	Rápido	Ácido	Rhizobaceae
S. Rizosf	Riz 5-0	beige, secas, grandes	-	-	-	-
Crotalaria retusa L.
Nódulos	Riz 8-11	Rosado pálido, secas, pequeñas	Bacilos, G -, no esporul.	Lento	Base	Bradyrhizobium
	Riz 8-12	Rosado pálido, secas, pequeñas	Bacilos, G -, no esporul.	Lento	Base	Bradyrhizobium
	Riz 8-13	beige, secas, grandes	-	-	-	-
	Riz 8-14	beige, secas, grandes	-	-	-	-

G:Gram positivos

Esporul: esporulados

La mayoría de los aislados se caracterizaron por formar colonias semitraslúcidas, mucosas y grandes en el medio de cultivo LM sólido. Sin embargo, los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 formaron colonias rosado pálido, secas y pequeñas. Los aislados Riz 8-13 y Riz 8-14 presentaron un tercer patrón desde el punto de vista cultural, pues formaron colonias beige, secas y grandes.

La tinción de Gram mostró que la mayoría de los aislados fueron bacilos Gram negativos, no esporulados. Solo el aislado Riz 2-1 se observó como cocobacilos Gram negativos esporulados. Los resultados mostraron además, dos patrones en cuanto al tiempo de aparición de las colonias en el medio LM sólido y la producción de ácido y base. Ocho aislados presentaron crecimiento rápido y produjeron ácido, mientras que otro grupo creció lento y produjo base.

Al tener en cuenta los resultados de la caracterización cultural, morfológica y fisiológica de los aislados bacterianos, se seleccionaron solo aquellos que presentaran características similares a las descritas para el grupo de los rizobios, con los cuales se realizarían ensayos de inoculación con plantas de siratro. Los resultados mostraron que, excepto Riz 7-1, todos los aislados produjeron nódulos en la raíz principal de las plantas. Además, se visualizaron nódulos efectivos en la FBN en todas las plantas, excepto en aquellas que se inocularon con los aislados Riz 7-1 y Riz 6 (figura 1).

Media con letras iguales no difieren estadísticamente.

esx (número de nódulos en raíz principal) = 0.29*;

esx (número de nódulos efectivos en raíz principal) = 0.21* (Tukey P = 0.012, N=7)

Figura 1 Número y efectividad de nódulos en la raíz principal de plantas de Siratro, inoculadas con aislados bacterianos procedentes de suelo rizosférico y de nódulos de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L.) DC., Alysicarpus vaginalis (L.) D.C. y Crotalaria retusa L, a los 30 d de cultivo en condiciones controladas. 

Las plantas que se inocularon con los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 presentaron los valores más elevados de número de nódulos en la raíz principal y número de nódulos efectivos en la FBN. En estas variables, no se observaron diferencias significativas entre las plantas tratadas con el aislado Riz 8-11, y las que utilizaron Riz 8-12.

Al analizar la nodulación total de las plantas de siratro, los resultados mostraron un comportamiento similar al que se constató en la nodulación en la raíz principal. Las plantas que se inocularon con los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 produjeron el mayor número de nódulos totales y efectivos totales. No se observaron diferencias significativas en estas variables entre las plantas que se trataron con los aislados Riz 8-11 y Riz 8-12. Sí las hubo entre estas últimas y aquellas donde se inoculó el aislado Riz 5-1 (figura 2).

Media con letras iguales no difieren estadísticamente. esx (número de nódulos totales) = 0.43*; esx (número de nódulos efectivos totales) = 0.38* (Tukey P=0.015, n=7)

Figura 2 Número y efectividad de los nódulos totales en plantas de Siratro, inoculadas con aislados bacterianos procedentes de suelo rizosférico y de nódulos de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L.) DC., Alysicarpus vaginalis (L.) DC.. y Crotalaria retusa L., a los 30 d de cultivo en condiciones controladas. 

En cuanto a la masa seca de los nódulos, los resultados mostraron que nuevamente la utilización de los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 produjo los mayores valores de masa seca de nódulos en la raíz principal y nodulación total (tabla 3).

Tabla 3 Masa seca de nódulos de la raíz principal y nódulos totales, y masa seca de la parte aérea y de raíz de plantas de siratro, que se inocularon con los posibles aislados de rizobios provenientes de la rizosfera y nódulos de las leguminosas herbáceas Desmodium triflorum (L.) DC., Alysicarpus vaginalis (L.) DC. y Crotalaria retusa L., a los 30 d de cultivo en condiciones controladas. 

Tratamientos	MSNRP (g)	MSNT (g)	MSA (g)	MSR (g)
Control	0.0000 e	0.0005 f	0.022 de	0.020 cd
Riz 1-1	0.0013 d	0.0024 de	0.028 d	0.024 c
Riz 1-2	0.0006 de	0.0028 d	0.021 de	0.020 cd
Riz 5	0.0009 de	0.0020 def	0.020 de	0.016 d
Riz 5-1	0.0196 c	0.0196 c	0.156 c	0.039 b
Riz 5-2	0.0007 de	0.0014 def	0.017 e	0.017 d
Riz 6	0.0002 de	0.0010 ef	0.021 de	0.019 cd
Riz 6-1	0.0003 de	0.0010 ef	0.014 e	0.016 d
Riz 7-1	0.0000 e	0.0006 f	0.020 de	0.020 cd
Riz 7-2	0.0009 de	0.0016 def	0.015 e	0.017 d
Riz 8-11	0.0238 a	0.0248 a	0.212 a	0.054 a
Riz 8-12	0.0214 b	0.0229 b	0.184 b	0.038 b
esx	0.0004*	0.0006*	0.003*	0.002*

Media con letras iguales no difieren estadísticamente (Tukey P=0.034, n=7)

MSNRP: masa seca de nódulos de la raíz primaria

MSNT: masa seca de nódulos totales

MSA: masa seca aérea

MSR: masa seca de raíz

Algo similar se constató con la masa seca aérea y radical de las plantas, pues las que se inocularon con estos tres aislados incrementaron significativamente ambas variables. Se destacaron las que se inocularon con el aislado Riz 8-11, con los mayores valores de MSA y MSR.

Discusión

En esta investigación se realizó un estudio del patrón de nodulación y de poblaciones de rizobios asociadas a tres leguminosas herbáceas establecidas en un suelo Solonchak muy fuertemente salino. La utilización de inoculantes basados en rizobios pudieran formar parte del manejo integrado de estos ecosistemas para incrementar el establecimiento de las leguminosas, incluso en condiciones limitantes de salinidad, y con ello aumentar la disponibilidad de pasto para el ganado.

En el momento del muestreo, las plantas estudiadas se encontraban establecidas en condiciones de déficit hídrico y salinidad del suelo, factores que pueden limitar el crecimiento y desarrollo de las leguminosas y de los microorganismos asociados a ella. Se conoce que el déficit hídrico limita la movilidad, viabilidad y concentración de los rizobios en la rizosfera de las leguminosas (^{Hussain et al. 2014} y ^{Gopalakrishnan et al. 2015}). Estudios previos comprueban disminución de la nodulación en plantas de frijol (Phaseolus vulgaris l.) cultivadas en déficit hídrico (^{Estrada et al. 2017}). Esta condición provoca cambios hormonales (ácido abscísico) y enzimáticos (sacarosa sintasa) en la leguminosa, lo que trae consigo afectaciones en la fotosíntesis, proceso que asegura la sobrevivencia del bacteroide dentro del nódulo. Como resultado, disminuye la tasa de multiplicación de los rizobios y, por ende, se produce la inhibición del crecimiento del nódulo (^{Liu et al. 2005}, ^{Ladrera et al. 2007} y ^{Azcón-Bieto y Tolón 2010}).

La salinidad también provoca efectos negativos en el crecimiento de las leguminosas y en la multiplicación de los rizobios. Investigaciones previas demostraron disminución del número y tamaño de los nódulos en plantas de caupí (Vigna unguiculata), con el incremento de la salinidad en el sustrato (^{Al-Saedi et al. 2016}). Este factor disminuye la colonización de la rizosfera por los rizobios, pues inhibe la síntesis de glucanos, lipopolisacáridos (LPS) y exopolisacáridos, moléculas superficiales de la bacteria que son esenciales para su interacción con la planta (^{Tewari y Sharma 2020}). Estos eventos producen disminución del número y masa de los nódulos, de la síntesis de la leghemoglobina y de la actividad de la nitrogenasa (^{Ballhorn et al. 2018} y ^{Sunita et al. 2019}).

En esta investigación se constataron, además, diferencias en la forma y tamaño de los nódulos que se encontraron en C. retusa (L) con respecto a D. triflorum (L.) DC. y A. vaginalis (L.) DC. Crotalaria produce nódulos indeterminados y polimórficos que presentan un meristemo permanente, tejido que permite el crecimiento constante del órgano (^{Renier et al. 2011}). Esta capacidad, mantenida incluso en condiciones limitantes de sequía y salinidad, sugiere mayor osmotolerancia de los nódulos indeterminados con respecto a los determinados (^{Fernández Pascual et al. 2007}, ^{Selami et al. 2014} y ^{Huang et al. 2018}). Estas características morfológicas y fisiológicas pudieran explicar el mayor tamaño de los nódulos de Crotalaria, incluso en condiciones de déficit hídrico y salinidad en el suelo.

A pesar de los efectos negativos del déficit hídrico y la salinidad para la leguminosa y los rizobios, situaciones como estas favorecen la selección natural de cepas bacterianas que establecen simbiosis con leguminosas con las que no eran compatibles (^{Andrews y Andrews 2017}). Aislar cepas de rizobios adaptadas a condiciones estresantes e incrementar su concentración en estos suelos a partir de su inoculación, pudiera tener efecto ecológico positivo en los ecosistemas.

Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó el aislamiento de posibles rizobios a partir de nódulos y del suelo rizosférico de tres géneros de leguminosas herbáceas. Para ello, se aplicaron métodos de taxonomía convencional, que incluyen el estudio de caracteres fenotípicos que permiten un acercamiento a la identificación de cepas bacterianas.

Los nódulos son estructuras que se forman en la simbiosis entre los rizobios y las leguminosas. Constituyen, unido a la rizosfera de estas plantas, los hábitats más frecuentes donde se encuentran los rizobios. De hecho, la manera de autentificar si una bacteria pertenece al grupo de los rizobios es comprobar su capacidad de formar nódulos en leguminosas en condiciones de asepsia (^{Howieson y Dilworth 2016}). Esto se explica porque en los últimos años se ha demostrado que en los nódulos de muchas leguminosas conviven, junto a los rizobios, poblaciones de bacterias que no tienen la capacidad de formar estas estructuras (^{Peix et al. 2015} y ^{Velázquez et al. 2017}).

Como criterio primario, se partió de las características culturales descritas para los rizobios, cuando crecen en el medio de cultivo LM sólido. Según ^{Wang y Martínez-Romero (2001)}, los rizobios forman dos fenotipos fundamentales de colonias en este medio: colonias semitraslúcidas, grandes y mucosas, y colonias semitraslúcidas, pequeñas y secas. Según lo anterior, los aislados Riz 8-13 y Riz 8-14 se descartaron como posibles rizobios, pues formaron colonias beige, grandes y secas (tabla 2) y se eliminaron de las determinaciones posteriores.

Como segundo criterio, se usó la tinción de Gram. Según ^{Madigan et al. (2019)}, los rizobios son bacilos o cocobacilos Gram negativos, y no esporulados. Por lo tanto, la observación de endosporas en las células del aislado Riz 2-1 (tabla 2) permitió descartarlo como posible rizobio, y tampoco se consideró en el resto de la caracterización.

La determinación de aspectos fisiológicos en los rizobios, como el tiempo de aparición de las colonias sobre el medio LM sólido y la producción de ácido o base, contribuyen también a la agrupación de estas bacterias en diferentes géneros (^{Wang y Martínez-Romero 2001}). En esta investigación, se distinguen dos patrones culturales y fisiológicos: al primero y más numeroso pertenecen los aislados de crecimiento rápido, productores de ácido, que forman colonias semitraslúcidas, grandes y mucosas (tabla 1). Este patrón concuerda con cepas de rizobios que previamente se han ubicado en la familia Rhizobiaceae, que agrupa los géneros Ensifer, Rhizobium y Shinella (^{Sahgal y Jaggi 2018}).

Los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 presentaron características que concuerdan con las del segundo patrón cultural y fisiológico. Este patrón consiste en aislados de crecimiento lento, productores de base, que forman colonias semitraslúcidas, pequeñas y secas en el medio LM sólido. Cepas con estas características se han agrupado en el género Bradyrhizobium (^{Sahgal y Jaggi 2018}).

Teniendo en cuenta los resultados de la caracterización cultural, morfológica y fisiológica, 80 % del total de aislados se seleccionaron como posibles rizobios. Todos los aislados provenientes de D. triflorum (l.) DC. se identificaron como de la familia Rhizobiaceae. En investigaciones anteriores se demostró la presencia del género Rhizobium, que pertenece a esta familia, en las especies Desmodium oldhami y Desmodium sequax (^{Xu et al. 2016}). En el caso de la leguminosa C. retusa L., todos los aislados bacterianos se clasificaron en el género Bradyrhizobium. Durante la simbiosis, la prevalencia de unos géneros con respecto a otros, se explica, entre otros aspectos, a partir de la especificidad de las señales moleculares entre la leguminosa y los rizobios (^{Liu y Murray 2016}, ^{Andrews y Andrews 2017} y ^{Salas et al. 2017}). Algunos grupos químicos en la estructura de los denominados factores de nodulación, determinantes más conocidos que rigen la interacción rizobio-leguminosa, tienen una función muy importante en dicha especificidad (^{Wang y Zhu 2018}).

A diferencia de D. triflorum (L.) DC. y C. retusa L., en los nódulos y la rizosfera de la leguminosa A. vaginalis (L.) DC., coexisten rizobios de la familia Rhizobiaceae y del género Bradyrhizobium. El establecimiento de la simbiosis con un amplio rango de géneros de rizobios no implica necesariamente que se realice una FBN eficiente con todos los microsimbiontes (^{Terpolilli et al. 2008} y ^{Chibeba et al. 2017}). Teniendo en cuenta lo anterior, se hace necesario seleccionar e inocular cepas eficientes en la colonización, establecimiento y FBN, para obtener incremento en el crecimiento y rendimiento de las leguminosas. En el suelo no siempre se encuentran las cepas nativas ni la concentración necesaria de estas para provocar los efectos deseados en las plantas (^{Lodeiro 2015}). En esta investigación se realizaron ensayos de inoculación de los doce posibles aislados de rizobios en plantas de siratro, con el propósito de determinar su capacidad de producir nódulos efectivos en la FBN y promover el crecimiento de esta planta.

Siratro se utiliza como leguminosa modelo para evaluar la nodulación, debido a su capacidad para establecer simbiosis con un rango amplio de géneros del grupo de los rizobios (^{Lima et al. 2009}). La capacidad para formar nódulos en las leguminosas es uno de los criterios que más se considera para clasificar bacterias como rizobios (^{Howieson y Dilworth 2016}). Por tanto, la presencia de nódulos en las raíces de siratro inoculadas con los doce aislados (figura 1 y 2) constituye una evidencia importante para poder considerar estos microorganismos como rizobios.

Los aislados Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 se destacaron en todas las variables evaluadas, en la nodulación como en la promoción del crecimiento de las plantas de siratro. La capacidad de las cepas para nodular la raíz principal es uno de los criterios más importantes en los estudios de selección de cepas, pues los nódulos que se ubican en esta posición presentan mayor actividad en la FBN (^{Samrudhi et al. 2013}). Por la raíz principal fluye la mayor cantidad de nutrientes resultantes de la fotosíntesis, los que emplean los bacteroides para obtener energía para fijar el nitrógeno (^{Azcón-Bieto y Tolón 2010}).

El tamaño de los nódulos se relaciona directamente con su masa. La presencia de altas concentraciones de bacteroides induce la multiplicación de las células del cortex de la raíz, lo que implica un aumento del tamaño nodular (^{Patriarca et al. 2004}). Esto explicaría las diferencias significativas que se encontraron en la masa seca de los nódulos de las plantas inoculadas con los aislados Riz 8-11 y Riz 8-12 (tabla 3), independientemente de las similitudes en el número de nódulos en la raíz principal y total (figuras 1 y 2) constatados entre estas plantas (tabla 3).

El nitrógeno proveniente de la FBN se emplea para la síntesis de proteínas estructurales y con función catalítica, que favorecen el crecimiento y el desarrollo de las leguminosas (^{Azcón-Bieto y Tolón 2010}). El incremento en la MSA y la MSR de las plantas de siratro inoculadas con Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12, aislados que se destacaron por provocar abundante nodulación efectiva en estas plantas, sugiere el efecto positivo de la FBN en la promoción del crecimiento vegetal. Investigaciones recientes con plantas de frijol común, (Phaseolus vulgaris l.), inoculadas con diferentes cepas de rizobios, mostraron que las plantas más noduladas y con mayor masa nodular presentan los mayores valores de masa seca de la raíz y de la parte aérea (^{Ferreira et al. 2018} y ^{Menge et al. 2018}).

Los rizobios se consideran bacterias promotoras del crecimiento vegetal que, además de la FNN, presentan otros mecanismos para promover el crecimiento de las plantas, como la síntesis de ácido 3-indol acético (AIA) y giberelinas (^{Flórez et al. 2017} y ^{Singha et al. 2017}). Ambas hormonas favorecen la formación de raíces laterales e incrementan el número y tamaño de los pelos radicales (^{Azcón-Bieto y Tolón 2010}). La capacidad de algunos microorganismos para producir AIA a partir de amonio (^{Chandra et al. 2018}) que, en el caso de los rizobios, provendría de la FBN, también podría contribuir a la acción fitoestimulante de estos microorganismos. La acción combinada de estos mecanismos explicaría la promoción del crecimiento que produjo la inoculación de cepas de rizobios como Riz 5-1, Riz 8-11 y Riz 8-12 en las plantas de siratro.

Las investigaciones que se encaminan a la búsqueda de soluciones ecológicamente viables para el aprovechamiento productivo de suelos dedicados a la ganadería son insuficientes en Cuba. La productividad de los cultivos en áreas salinas está limitada, fundamentalmente por la falta de nitrógeno en el suelo, lo que fundamenta la importancia de la fijación simbiótica del nitrógeno en áreas afectadas. Esta investigación sugiere el empleo de bacterias del grupo de los rizobios para la inoculación de leguminosas herbáceas, que de manera natural se establecen en suelos salinos, lo que permitiría el rescate de áreas para incrementar la productividad agrícola y ganadera en Cuba.

Conclusiones

El conjunto de los resultados de esta investigación permite seleccionar a los aislados Riz 5-1 (proveniente de nódulos de Alysicarpus) y Riz 8-11 y Riz 8-12 (provenientes de nódulos de Crotalaria) como promisorios para la inoculación de leguminosas herbáceas. Estos aislados sobreviven saprofíticamente en suelos afectados por el déficit hídrico y la salinidad, cualidad que los hace atractivos para la elaboración de biopreparados que permitan la rehabilitación de pastos y forrajes en estos suelos.

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Recibido: 28 de Febrero de 2020; Aprobado: 22 de Junio de 2020

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