Ciencia Animal

Caracterización química y microbiológica del aditivo zootécnico VITAFERT en condiciones de producción a pequeña escala

A. Beruvides^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0002-8525-6595

A. Elías †² 

Elaine C Valiño² 
http://orcid.org/0000-0003-4178-3286

Grethel Milián¹ 
http://orcid.org/0000-0001-6074-7464

Ana J. Rondón¹ 
http://orcid.org/0000-0003-3019-1971

Marlen Rodríguez¹ 
http://orcid.org/0000-0003-4248-3728

J. Milián¹ 
http://orcid.org/0000-0003-3541-3094

¹Universidad de Matanzas, Autopista Varadero km 3 ½. Matanzas, Cuba

²Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas. Mayabeque, Cuba

Resumen

El objetivo de esta investigación fue caracterizar química y microbiológicamente el aditivo zootécnico VITAFERT y evaluar su estabilidad durante 90 días. Para analizar los resultados de la caracterización química y microbiológica, se aplicó estadística descriptiva (media, desviación estándar y coeficiente de variación). Para estudiar la estabilidad se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple. Se usó el paquete INFOSTAT, versión 2012. La composición química se comportó de forma similar en los cinco lotes estudiados, con media para materia seca (9.70 %), cenizas (10.5 %), calcio (1.33 %), fósforo (0.65 %) proteína bruta (7.12 %) y pH (4.0). El aditivo presentó conteos elevados de bacterias ácido lácticas, con valores entre 3.24 x 1012 UFC.mL-1 y 4.95 x 1012 UFC.mL-1 y levaduras entre 7.00 x 107 UFC.mL-1 y 9.66 x107 UFC.mL-1 respectivamente, así como pH de 4.0. El estudio de estabilidad mostró que el producto mantiene pH de 4.0 hasta los 90 días. Se concluye que el aditivo zootécnico VITAFERT presenta características químicas y microbiológicas para su aplicación en la alimentación animal.

Palabras clave: preparado microbiano; estabilidad; bacterias ácido lácticas; levaduras

En la producción animal es de gran importancia conocer la composición bromatológica de los alimentos, como los niveles de proteína, fibra, energía y minerales para establecer el balance alimentario en las dietas destinadas a los animales. Al mismo tiempo, es necesario determinar la calidad microbiológica del alimento para evitar que pueda afectar el comportamiento animal, en cuanto al consumo, la digestibilidad y la absorción de nutrientes (^{Lezcano et al. 2014}, ^{Caicedo 2015}, ^{Brea 2015} y ^{Milián et al. 2019}).

Por las razones anteriores, el estudio de las características microbiológicas y químicas de un aditivo constituye una premisa para introducir un nuevo producto en la alimentación animal (^{Caicedo y Valle 2017} y ^{Rodríguez et al. 2020}). En trabajos de ^{Elías y Herrera (2008)} y ^{Vitaluña (2014)} se informa acerca de la caracterización química y microbiológica del VITAFERT, producido en fermentadores a escala de laboratorio. No obstante, se desconoce si esta composición se mantiene en condiciones de producción a pequeña escala. Es por ello que el objetivo de esta investigación es caracterizar química y microbiológicamente el aditivo zootécnico VITAFERT, obtenido en condiciones de producción a pequeña escala.

Materiales y Métodos

Obtención del inóculo. El inóculo se obtuvo a partir de yogurt natural, producido en la Empresa Combinado de la Industria Láctea (ECIL) de Matanzas, Cuba. Este producto se elaboró con cepas procedentes de la colección del Instituto de Investigaciones de la Industria de los Alimentos (IIIA): Streptococcus salivarius subespecie thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus. El cultivo se encontraba a una concentración de 107 UFC.mL-1, lo que se corresponde con los valores normales para la producción de yogurt natural. El inóculo se conservó a 4ºC hasta su utilización.

Para la obtención del preparado microbiano se siguió la metodología propuesta por ^{Elías y Herrera (2008)}, modificada por ^{Beruvides et al. (2018)}. Para esta investigación se elaboraron cinco lotes, preparados en tanques plásticos de 20 L al mismo tiempo, en los que se pesaron y mezclaron todos los componentes con la sustitución de la miel final, como fuente de carbono, por azúcar crudo más la adición del inóculo (yogurt natural). El biopreparado se mantuvo durante 96 h en fermentación a temperatura ambiente (24 OC) y se activó cada 12 h mediante agitación con una paleta de madera. Su formulación se presenta en la tabla 1, así como los aportes energéticos y proteicos de las materias primas utilizadas.

Tabla 1 Formulación del aditivo zootécnico VITAFERT, obtenido en condiciones de producción a pequeña escala 

Composición	Niveles de inclusión, kg	Aportes
		Energético, MJ.kg-1	Proteico, %
Inóculo (yogurt natural)**	1	3.014	0.3
Harina de maíz*	4	0.040	0.85
Harina de soya*	4	0.039	0.83
Urea***	0.5	-	281
Sulfato de amonio*	0.25	-	21
Sal mineral*	0,5	-	-
Azúcar crudo*	15	0.041	-
Agua	100L	-	-

Fuente: ^{NRC (2012)}*, IIIA**, ^{De Blos et al. (2007)}***

Caracterización química. Se tomaron tres muestras de cada lote de VITAFERT para determinar el contenido de materia seca (MS), cenizas (C), calcio (Ca), fósforo (P) y proteína bruta (PB), según la metodología descrita por ^{AOAC (2010)}.

Determinación de pH y conteo de bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras. Para determinar el comportamiento del pH y la presencia de estos microorganismos durante la elaboración de este aditivo zootécnico, se realizaron mediciones cada cuatro horas hasta las 96 h en los cinco lotes estudiados.

Para efectuar el conteo de las BAL y las levaduras se realizaron diluciones seriadas de las muestras (1:10, v/v) en agua de peptona hasta 10-11. De estas diluciones, en las primeras 12 h, se utilizaron para las BAL 10-7, 10-8 y 10-9, y en horas posteriores 10-9 10-10 y 10-11, con el propósito de su siembra a profundidad en placas con agar MRS (^{De Mann et al. 1960}) (BIOCEN, Cuba). Para las levaduras, se tomaron las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 en las primeras 12 h, y posteriormente se emplearon las de 10-5, 10-6 y 10-7. Cada una de ellas se repitió tres veces (1 mL) en agar rosa de bengala (rosa de bengala 0.05 % y cloranfenicol 0.5 %) (HISPANLAB, España). Después de incubar a 37 ºC (durante 72 h para BAL y 48 h para levaduras), se realizó el conteo microbiano. El número de UFC se determinó por conteo visual de colonias mediante una lupa.

Conteo de microorganismos contaminantes. Se realizó de acuerdo con las normas vigentes, descritas para los estudios de la calidad microbiológica de los alimentos para el consumo humano y animal NC-ISO (tabla 2). Para ello se realizaron diluciones seriadas de las muestras (^{NC ISO 6887-1: 2002}) y se ejecutaron las técnicas de determinación de los diferentes grupos de microorganismos.

Tabla 2 Pruebas microbiológicas para la determinación de microorganismos contaminantes en el aditivo zootécnico VITAFERT 

Pruebas microbiológicas	Referencias NC- ISO
Conteo de coliformes fecales y totales	4832: 2010
Conteo de Bacillus cereus	4833-1: 2014
Conteo de Salmonella en 25 mL	6579: 2008

Para el estudio de la estabilidad del VITAFERT a temperatura ambiente (24 ± 5ºC) durante 90 d, se desarrolló un experimento con diseño completamente aleatorizado. Este se realizó en el laboratorio de microbiología de la Planta de Conservas y Alimentos Libertad, del municipio Colón, ubicado en la provincia Matanzas, Cuba.

Según la metodología descrita anteriormente, se prepararon 20 L del aditivo zootécnico y se distribuyeron en recipientes plásticos de 1 L de capacidad que se mantuvieron bajo techo. Durante los días 1, 3, 7, 15, 30, 60 y 90 se tomaron tres muestras para su análisis. La estabilidad de este producto biológico se determinó a partir del análisis de pH y el conteo de BAL y levaduras viables.

Análisis estadístico. Para la caracterización química y microbiológica del VITAFERT se utilizaron los estadígrafos de dispersión (media, desviación estándar y coeficiente de variación). Los valores de pH, concentraciones de BAL y levaduras se procesaron mediante un análisis de varianza de clasificación simple y la dócima de ^{Duncan (1955)} para P < 0.05. Los datos se procesaron en el paquete estadístico INFOSTAT, versión 2012 (^{Di Rienzo et al. 2012}).

Resultados y Discusión

En las tablas 3 y 4 se muestran los resultados de la caracterización química y microbiológica del VITAFERT. Los valores de la composición química estuvieron en correspondencia con las determinaciones informadas por ^{Elías y Herrera (2008)}, a excepción de la MS, que presentó cifras en el orden de 9.72 %. En tanto, los autores citados obtuvieron valores de 15.05 %. Estos resultados se relacionan con la sustitución de la miel de caña de azúcar por azúcar crudo.

Tabla 3 Composición química del aditivo zootécnico VITAFERT 

Estadígrafos Indicadores, %	Media	DE	CV
Materia seca	9.72	0.05	0.46
Cenizas	10.52	0.08	0.80
Calcio	1.33	0.01	0.41
Fósforo	0.65	0.01	2.01
Proteína bruta	7.12	0.02	0.26
pH	3.95	0.05	1.29

Los resultados son el promedio de tres determinaciones DE- desviación estándar; CV- coeficiente de variación, %

Tabla 4 Composición microbiológica del aditivo zootécnico VITAFERT, luego de la fermentación a las 96 h. Conteo de microorganismos (UFC mL-1) 

Estadígrafos indicadores	Media	DE	CV
BAL	4.19x1012	0.3220	0.45
Coliformes fecales y totales	Negativo	-	-
Bacillus cereus	Negativo	-	-
Levaduras viables	8.39 x107	0.8321	1.20
Salmonella en 25mL	Negativo	-	-

Los resultados de los indicadores MS y Ca oscilaron en los rangos determinados por ^{Gutiérrez et al. (2012)} en caracterizaciones del mismo producto con miel final como fuente energética. De igual manera, ^{Beruvides (2013)} elaboró en condiciones de producción el aditivo zootécnico VITAFERT, formulado también con miel final como fuente energética. Realizó su caracterización química desde la hora 0 hasta las 96 h, y obtuvo valores similares a los informados en este estudio para la MS, PB y pH.

Se confirma que la metodología aplicada para la obtención de este biopreparado en condiciones de producción a pequeña escala no provoca variaciones considerables en su composición química, si se compara con fermentadores a escala de laboratorio. Los datos indican que existe repetibilidad en los resultados obtenidos. Esto significa que cuando se emplean estos componentes, en las mismas condiciones, no se producen modificaciones en los parámetros estudiados.

En esta investigación, el pH (3.9-4.0) se mantuvo en los rangos establecidos para productos biológicos de esta categoría (^{Elías y Herrera 2008} y ^{Roján 2009}). ^{Caicedo y Valle (2017)} definieron que estos valores de pH permiten la estabilidad en el tiempo y la conservación de los productos biológicos. Por tanto, este aditivo zootécnico se puede considerar de una calidad aceptable para su utilización en la alimentación animal. Además, estos niveles de acidez disminuyen la presencia de microorganismos patógenos y de otros contaminantes (^{Vega et al. 2013}, ^{Vélez et al. 2015} y ^{Milián et al. 2017}).

^{Flores-Mancheno et al. (2015)} caracterizaron el pH de un producto biológico, destinado a cerdos en la etapa de preceba y crecimiento-ceba, formulado con suero de leche fresca, urea y melaza de caña de azúcar. Estos autores informaron un pH de 3.87, similar al obtenido en este estudio. Esto se pudiera relacionar con la presencia de una población considerable de BAL, que produce ácidos orgánicos (láctico, acético, propiónico y butírico) y disminuye el pH (^{Belkacem-hanfi et al. 2014}). En estudios realizados por ^{Caicedo y Valle (2017)} se informa un comportamiento similar al observado en este trabajo para la expresión del pH, cuando elaboraron un biopreparado microbiano destinado a cerdos, que contenía yogurt natural, suero de leche, miel B y tubérculos de papa china.

El análisis microbiológico no mostró microorganismos contaminantes en las muestras de VITAFERT (tabla 4). Estos resultados se pueden deber a la presencia de concentraciones altas de ácidos orgánicos (fundamentalmente láctico y acético) o bacteriocinas aportados por las BAL (superiores a 109 UFC.mL-1), que permiten mantener el producto libre de contaminantes, lo que hace viable su utilización en los animales.

^{Elías y Herrera (2008)}, ^{Gutiérrez et al. (2012)} y ^{Beruvides (2013)} caracterizaron desde el punto de vista microbiológico una de las variantes de VITAFERT que contenía como fuente energética miel final, y obtuvieron valores para Lactobacillus spp. en los rangos de 109 y 1010 UFC.mL-1, y para las levaduras entre 106 y 107 UFC.mL-1. En el presente trabajo se cuantificaron valores superiores para las BAL, lo que se pudiera relacionar con la sustitución de la miel final por azúcar crudo o por la población inicial que presentaba el inóculo (yogurt natural).

En la figura 1 se presentan los resultados del conteo de BAL y levaduras en el tiempo. Se comprobó que durante el proceso de fermentación, las BAL crecen hasta valores de 29 logaritmo neperiano (LN) UFC.mL-1 y las levaduras, en el orden de 20 LN UFC.mL-1.

a,b,c,d,e,f,g,h,i,j Medias con letras diferentes difieren para P < 0.05 (^{Duncan 1955}) (BAL: EE = ± 0.10, P = 0.0262; levaduras: EE = ± 0.03, P = 0.0348; pH = ±0.01, P = 0.0654).

Figura 1 Cinética de crecimiento de las bacterias ácido lácticas y levaduras y comportamiento del pH durante el proceso fermentativo del aditivo zootécnico VITAFERT 

El pH disminuyó de 8.5 a 4.0 desde el inicio de la fermentación hasta los 96 h. Mediante el estudio de la cinética de crecimiento de las BAL y las levaduras en el proceso de fermentación a pequeña escala se comprobó que a medida que disminuye el pH, aumenta progresivamente el crecimiento de ambos grupos microbianos. Esto confirma lo informado por ^{León (2012)} acerca de que estos microorganismos pueden crecer en un amplio rango de pH (entre 4-7), a diferencia de otros grupos microbianos como coliformes, Salmonella spp. y Bacillus spp., que en condiciones de acidez inhiben su crecimiento (^{Pavlović et al. 2016}). Estos valores de pH y concentración microbiana se encuentran en los rangos óptimos para la aplicación de este producto en la alimentación de cerdos. No obstante, no se conoce si esta composición se mantiene en el tiempo, por lo que se hace necesario el estudio de su estabilidad por un período de 90 d.

a,b,c,d Medias con letras diferentes difieren para P < 0.05 (^{Duncan 1955}) (BAL: EE ± 0.07 P = 0.04568; Levaduras: EE ± 0.05, P = 0.0152; pH: EE ± 0.02, P=0.5670)

Figura 2 Comportamiento de la estabilidad de los indicadores microbiológicos y químicos en el aditivo zootécnico VITAFERT en condiciones de producción a pequeña escala durante 90 d 

En la figura 2 se presentan los valores de pH y conteos de BAL y levaduras de los diferentes lotes de VITAFERT. Estas determinaciones se encuentran en los rangos establecidos por ^{Elías y Herrera (2008)} y ^{Beruvides (2013)}.

Como muestra la figura 2, las levaduras a partir de los tres y hasta los 15 d mantuvieron valores de 107 UFC.mL-1. Posteriormente, se produjo la disminución de las células viables (106 UFC.mL-1) desde los 30 d, manteniéndose en este orden hasta el final del estudio. Las BAL aumentaron gradualmente durante los primeros 15 d hasta 1012 UF C.mL-1. Luego, hubo un decrecimiento hasta 109 UFC.mL-1 a los 90 d. El pH mostró valor de 4.0 a partir de las 72 h, y mantuvo su estabilidad hasta los 90 d. Este resultado se pudiera asociar a la producción de ácidos orgánicos (láctico, acético, propiónico y butírico) por las BAL (^{Vázquez et al. 2009}).

Los resultados concuerdan con los obtenidos por ^{Brizuela (2003)}, quien evaluó algunos parámetros de estabilidad de un biopreparado con fines probióticos, destinado a cerdos y elaborado con cepas de Lactobacillus rhamnosus. Estudios similares realizó ^{Rondón (2009)} cuando determinó la estabilidad de dos biopreparados de Lactobacillus salivarius subespecie salivarius C-7 y C-65. Esta autora comprobó que a partir de los 30 d se afecta la viabilidad de las BAL, debido a que en estas condiciones las células continúan su metabolismo y se agotan los nutrientes esenciales para su desarrollo.

^{Ramírez et al. (2011)} y ^{Powthong y Suntornthiticharoen (2015)} refieren que la presencia de las BAL en los productos biológicos garantiza la seguridad y estabilidad para su uso en la alimentación animal. Estos microorganismos tienen diversas aplicaciones, y una de las más importantes lo constituye la fermentación de alimentos (leche, carnes y vegetales) para obtener productos como el yogurt, el queso, los encurtidos, embutidos y ensilajes. De esta forma se contribuye a la biopreservación y a la calidad de las características sensoriales de los alimentos.

Cuando fermentan carbohidratos, los microorganismos BAL producen una mezcla de compuestos con acción antimicrobiana, como es el caso del ácido láctico, ácido acético, ácido butírico, peróxido de hidrógeno, diacetilo y péptidos de bajo peso molecular, llamados bacteriocinas, que inhiben la proliferación de otros grupos microbianos que no toleran la presencia de estos compuestos (^{Rodríguez et al. 2013}).

^{Caicedo y Valle (2017)} refirieron que el pH es un indicador de gran importancia en los procesos fermentativos. Su disminución es uno de los cambios más sustanciales que se producen durante la elaboración del biopreparado. ^{Adedeji et al. (2011)} definieron que el pH se relaciona directamente con los procesos degradativos que ocurren durante la conservación. En este sentido, cuando un producto biológico alcanza valores de pH entre 3.8 y 4.2, se logra su estabilidad. Esta condición hace que ocurra una restricción de la actividad de las enzimas proteolíticas y la supresión de enterobacterias y Clostridium (^{López et al. 2013}). Los resultados de esta investigación se encuentran en los índices de pH recomendados para este tipo de aditivo.

Según ^{Rendón et al. (2015)}, los mecanismos de acción de los productos biológicos con valores de pH iguales o inferiores a 4, implican la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas, la producción de ácido láctico y la disminución de la permeabilidad intestinal cuando se producen diarreas, así como el aumento de la actividad de la lactasa y la estimulación de la inmunidad. De esta manera, la disminución del pH en el producto obtenido es indicador de la presencia de bacterias lácticas, como resultó en esta investigación.

Se concluye que la metodología empleada para la elaboración del aditivo zootécnico VITAFERT, en condiciones de producción a pequeña escala, permitió obtener un producto biológico de calidad, constituido por altos niveles de BAL y levaduras. Estos niveles de microorganismos presentes en el preparado microbiano muestran estabilidad en su viabilidad hasta los 15 d, mientras que el pH permanece con valor de 4 por 90 d.

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Recibido: 10 de Julio de 2020; Aprobado: 24 de Noviembre de 2020

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