Ciencia de los Pastos y otros Cultivos

Metabolitos primarios y secundario de seis especies de árboles, arbustos y leguminosas herbáceas

D.M. Verdecía^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0002-4505-4438

R. del Carmen. Herrera-Herrera² 
http://orcid.org/0000-0002-4136-4746

E. Torres³ 
http://orcid.org/0000-0002-9212-5593

A.R. Sánchez³ 
http://orcid.org/0000-0001-5428-4473

L.G. Hernández-Montiel⁴ 
http://orcid.org/0000-0002-8236-1074

R.S. Herrera⁵ 
http://orcid.org/0000-0003-1424-6311

J.L. Ramírez¹ 
http://orcid.org/0000-0002-0956-0245

R. Bodas⁶ 
http://orcid.org/0000-0001-9736-7041

F.J. Giráldez⁷ 
http://orcid.org/0000-0002-0680-1541

J. Guillaume⁸ 
http://orcid.org/0000-0001-5527-412X

H. Uvidia⁹ 
http://orcid.org/0000-0002-2961-6963

S. López⁷ 
http://orcid.org/0000-0001-6267-683X

¹Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Granma, Apartado Postal 21, Bayamo, C.P. 85 100, Granma, Cuba.

²Universidad Nacional de Loja, La Argelia 110150. Loja, Ecuador.

³Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Los Ríos, Ecuador

⁴Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Av. Instituto Politécnico Nacional 195, Col. Playa Palo de Santa Rita Sur. CP 23096. La Paz, Baja California Sur, México

⁵Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

⁶Instituto Tecnológico Agrario ITACYL, Junta de Castilla y León, Finca Zamadueñas, Ctra. Burgos km. 119, E-47071 Valladolid, España

⁷Instituto de Ganadería de Montaña (IGM), CSIC Universidad de León, Finca Marzanas, 24346 Grulleros, León, España

⁸Innovative University of Grand Anse Haiti (INUGA), 11, Rue Albert Saindoux, Moron, Haití

⁹Universidad Estatal Amazónica, Pastaza, Ecuador

Resumen

Se realizaron seis experimentos simultáneos para determinar el contenido de metabolitos primarios y secundarios de seis especies de árboles, arbustos y leguminosas herbáceas forrajeras en las condiciones edafoclimáticas del Valle del Cauto, Cuba. Se empleó un diseño en bloques al azar con seis réplicas y los tratamientos fueron las edades de rebrote de 60, 120 y 180 días para los árboles y arbustos (Leucaena leucocephala, Tithonia diversifolia, Gliricidia sepium y Eritrina variegata) y de 30, 45, 60, 75 y 90 días para las leguminosas rastreras (Neonotonia wightii y Teramnus labialis), en los periodos lluvioso y poco lluvioso. Se determinaron N, glucosa, fructosa y sacarosa (primarios); fenoles totales, taninos totales, taninos condensados totales, taninos condensados ligados totales, taninos condensados libres, alcaloides, flavonoides, saponinas, triterpenos, esteroides totales, estaquiosa, verbascosa y rafinosa. Se realizaron análisis de conglomerados para agrupar las especies con características similares. Durante el periodo lluvioso se encontraron siete grupos y en el poco lluvioso ocho; con los mejores resultados, de forma integral, para la Gliricidia sepium y Tithonia diversifolia en ambos períodos estacionales. La edad presentó marcado efecto en el contenido de metabolitos primarios y secundarios al disminuir los primeros e incrementar los segundos en la medida que la madurez avanzaba. Este comportamiento se evidenció al constatar, mediante el análisis de conglomerados, que los grupos donde se encontró los mayores contenidos de los compuestos secundarios estaban integrados por las edades más avanzadas de las especies Neonotonia wightii, Teramnus labialis, Erythrina variegata y Leucaena leucocephala, en ambos periodos estacionales. Aspectos de vital importancia para trabajos futuros donde se analicen los efectos asociativos de especies con menor contenido de estos compuestos (Tithonia diversifolia y Gliricidia sepium) tanto en el ecosistema como en la respuesta animal.

Palabras clave: conglomerado; dendrograma; nitrógeno; oligosacáridos; polifenoles

Introducción

Las plantas contienen numerosos compuestos orgánicos denominados “metabolitos primarios”, entre los que se encuentran en primer término, los azúcares o carbohidratos, que se producen como resultado de la fotosíntesis. Por otra parte, se sintetizan en concentraciones variables diferentes compuestos químicos denominados, en general, “metabolitos secundarios”, ya que no intervienen directamente en su metabolismo, o al menos, no se conoce con profundidad su función en la planta y se asume que se emplean como mecanismo de defensa. Ellos pertenecen a diferentes grupos como son: aceites esenciales, alcaloides, cumarinas, esteroides, fenoles, flavonoides, glucósidos, gomas, iridoides, lignanos, mucílagos, pectinas, quinonas, saponinas, taninos y terpenos, entre otros (^{Paumier et al. 2018}y^{Pinard et al. 2019}).

Estas sustancias se sintetizan como respuesta de las plantas al ataque de hongos, bacterias, plagas, efecto alelopático, contaminación, efectos adversos de los factores climáticos y los animales herbívoros. Estas defensas químicas se encuentran en concentraciones variables en la naturaleza y depende del tipo metabolito, las características de la planta y las condiciones a las cuales son sometidas. La defensa basada en estos compuestos provoca toxicidad a sus depredadores e influye en la palatabilidad del forraje, provocando rechazo al consumirlo (^{Reyes-Silva et al. 2020}y⁶⁰).

En los últimos diez años ha cobrado gran importancia el uso de árboles, arbustos y leguminosas u otras especies, como suplemento para la dieta de los animales rumiantes, para mejorar la calidad y cantidad la dieta. Estas plantas contienen metabolitos secundarios, los que pueden modificar la velocidad de degradación y pasaje de los nutrientes a través del tracto gastrointestinal como resultado de un efecto directo en la ecología ruminal. Al tener en cuenta estos efectos, se precisa estudiar los niveles de los mismos en las plantas que pueden ser usadas para alimento animal (^{Huang et al. 2020}). De acuerdo con lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue determinar el contenido de metabolitos primarios y secundarios de seis especies de árboles, arbustos y leguminosas herbáceas, así como establecer los grupos con valores similares de su contenido.

Materiales y Métodos

Área de la Investigación, clima y suelo . Se realizaron seis experimentos, uno para cada especie, simultáneos en la misma área agrícola (suelo y clima) del Departamento Docente Productivo de la Universidad de Granma. Esta instalación se encuentra al sureste del país, en la provincia de Granma, Cuba.

Los experimentos se desarrollaron durante dos años, dividiendo el estudio en dos periodos: el lluvioso (mayo-octubre) y poco lluvioso (noviembre-abril) para cada uno de los años. Durante el periodo lluvioso las precipitaciones fueron 893.67 mm; la temperatura media, mínima y máxima registró valores de 26.73, 22.31 y 33.92 ºC, respectivamente y la humedad relativa media, mínima y máxima fue de 80.78, 51.02 y 96.22%, respectivamente.

En el poco lluvioso las precipitaciones alcanzaron valores de 364 mm; la temperatura estuvo en el orden de 24.05, 18.29 y 31.58ºC para la media, mínima y máxima, respectivamente y la humedad relativa mínima, media y máxima alcanzó promedios de 76.21, 44.16 y 97.03%, respectivamente. Estos valores se encuentran dentro del rango de valores históricos de la región.

El suelo del área experimental fue Pardo con carbonato (^{Hernández et al. 2015}), con pH de 6.2. El contenido de P2O5, K2O y N total fue de 2.4, 33.42 y 3 mg/100g de suelo, respectivamente y 3.6% de materia orgánica.

Tratamientos y diseño experimental. En cada experimento se empleó un diseño de bloques al azar, con seis réplicas agronómicas para cada uno de los tratamientos. Éstos, consistieron en las edades de rebrote de 60, 120 y 180 días para Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium, Erythrina variegata y Tithonia diversifolia; y de 30, 45, 60, 75 y 90 días para Teramnus labialis y Neonotonia wightii.

Procedimientos. Al inicio de cada periodo estacional se realizó un corte de uniformidad a 1m de altura en las parcelas (0.5 ha) de Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium y Erythrina variegata y a 15 cm de altura del suelo para la Tithonia diversifolia. En cada una de las edades de rebrote (60, 120 y 180 días), se cosecharon al azar 10 plantas/parcela y se separaron manualmente las hojas, los pecíolos y los tallos con diámetro inferior a 2 cm para los análisis de laboratorio.

Para el caso de Teramnus labialis y Neonotonia wightii, en cada periodo, al inicio de la evaluación, se realizó el corte de uniformidad a 5 cm del suelo. Se delimitaron parcelas de 25 m2, correspondientes a las edades de rebrote (30, 45, 60, 75 y 90 días), las que se cortaron de forma manual, previa eliminación de 50 cm de efecto de borde y se tomaron 200 g para los análisis de laboratorio. El área no se regó ni fertilizó durante la etapa experimental.

Determinación de metabolitos primarios y secundarios. Las muestras se secaron a temperatura ambiente en un local oscuro y ventilado durante 12 días, con posterioridad se molinaron hasta tamaño de partícula de 1 mm y se almacenaron en frascos de color ámbar a temperatura ambiente hasta su análisis en el laboratorio.

El N se determinó de acuerdo con ^{AOAC (2016)} y para glucosa (Glu), fructosa (Frut), sacarosa (Sac), rafinosa (Raf), verbascosa (Verb) y estaquiosa (Estq) se tomó 1 g de la muestra seca y molida, se le añadieron 9 mL de metanol al 70% y se calentó durante 20 minutos a 100 ºC, posteriormente se enfrió a temperatura ambiente y se filtró por Watman 42, luego se añadieron 0.2 mL de solución Carrez I [K 4Fe(CN)] al 15% en agua destilada y Carrez II [Zn(CH3COO)] al 30% en agua destilada y se completó a 10 mL con la solución de metanol al 70%. Se centrifugó a 4000 rpm por 15 minutos. Se tomaron 5 mL del sobrenadante y se le añadieron 5 mL de diclorometano, agitando vigorosamente en Vortex. Con posterioridad se dejó que las dos fases se definieran y se tomó la fase superior con una pipeta. Se hicieron dos extracciones más con diclorometano igual a la descrita anteriormente. La muestra se filtró con un filtro de 0.45 µm de poro. Para la detección se utilizó un HPLC (WATERS) de 2410, detector de índice de refracción utilizando el software (Empower Pro 2002), el método cromatográfico empleado fue el isocrático (flujo constante) de 1 mL/min con fase móvil de agua + ácido sulfúrico 0,01 N, 50 ºC de temperatura de columna, la columna empleada fue de exclusión iónica BioRad Amino HPX-87M de 300 mm x 7,8 mm. Se emplearon patrones de renombrada calidad analítica.

El análisis de los fenoles totales (FT) y los taninos totales (TT) se realizó mediante el método de Folin-Ciocalteu, antes y después del tratamiento de los extractos con polivinilpolipirrolidona (PVPP) según ^{Makkar (2003)}, mientras que los taninos condesados totales (TCT), taninos condensados libres (TCL) y taninos condensados ligados totales (TCLT) se determinaron por el método nbutanol/HCl/Fe3+ (^{Porter et al. 1986}). Los flavonoides (Flv) según ^{Boham y Kocipai-Abyazan (1994)}. Las saponinas (Sap) mediante el método descrito por ^{Obdoni y Ochuko (2001)}. Los triterpenos (Trit) según ^{Jie-Ping y Chao-Hong (2006)}. Los esteroides (ET) mediante ¹⁴ y los alcaloides (Alc) por el método descrito por ³⁴. Los análisis se realizaron en el departamento de Producción Animal, de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de León, España. Todos los análisis se hicieron por duplicado en las seis réplicas de cada edad para todas las especie y período estacional.

Análisis estadístico. Los resultados de los dos años se agruparon por período estacional (período lluvioso y poco lluvioso) y se realizó en cada uno de ellos análisis de conglomerados (^{Visauta 1998}) para establecer los grupos con similitud en su contenido de metabolitos primarios y secundarios. Se siguió la secuencia utilizada por ⁶⁴, que incluye dos fases: en la primera se utilizó el método de agrupación jerárquico de Ward, con el fin de determinar un número preliminar de grupos (conglomerados) a formar. Se exploraron niveles de agrupación progresivos y el nivel óptimo se definió la mejor distribución de los casos en estudio, según los grupos formados. En la segunda fase del análisis, se procedió a obtener la agrupación definitiva de los casos; se utilizó el método no jerárquico K- medias, especificando como punto de partida el número de conglomerados identificado como óptimo en el paso anterior y la experiencia del investigador.

Resultados y Discusión

En el período lluvioso se formaron siete grupos (figura 1) N. wightii (30, 45, 60, 75 y 90 días), T. labialis (30 y 45 días), E. variegata (60 y 120 días) y G. sepium (60 días) se situaron en el primer grupo caracterizado por bajos tenores de Verb y ET. La G. sepium (120 y 180 días) en el segundo grupo mostró el menor valor de TCL y el mayor de Sap. La E. variegata (180 días) con las mayores cantidades de Verb, Alc y Trit, y las menores de Estq formó el tercer grupo. La T. diversifolia (60, 120 y 180 días) conformó el cuarto grupo con los valores más bajos de TCT, TCLT, Glu y Trit, y los más altos de Estq. La L. leucocephala (120 y 180 días) en el quinto grupo mostró las mayores concentraciones de TT, FT, TCT, TCLT, Estq, Glu, Frut, Sac y Flv. En el sexto se ubicó T. labialis (60, 75 y 90 días) con los menores valores de FT, Raf, Frut, Sac, Flv, Alc y Sap. En el séptimo L. leucocephala (60 días) tuvo los resultados más bajos en TT y los mayores de Raf (tabla 1).

Figura 1 Dendograma del contenido de metabolitos primarios y secundarios de árboles, arbustos y leguminosas herbáceas durante el período lluvioso 

Tabla 1 Concentración de metabolitos primarios y secundarios según los grupos obtenidos por análisis de conglomerado en el período lluvioso 

Metabolitos primarios secundarios, g/kg	Grupos
	1-N, wightii (30, 45, 60, 75, 90 d) T, labialis (30, 45 d) E, variegata (60, 120 d) G, sepium (60 d)	2-G, sepium (120, 180 d)	3-E, variegate (180 d)	4-T, diversifolia (60, 120, 180 d)	5-L, leucocephala (120, 180 d)	6-T, labialis (60, 75, 90 d)	7-L, leucocephala (60 d)
N	117.4±5.01	134.7±1.00	107.8	133.2±6.81	171.1±2.55	90.88±1.77	197.9
TT	4.09 ±1.94	13.57 ±1.02	11.17	3.05 ±2.41	21.49 ±0.75	3.08 ±1.02	2.33
FT	11.44 ±4.35	33.25 ±2.10	21.05	8.75 ±3.23	43.59 ±0.06	6.64 ±0.65	17.7
TCT	61.56 ±4.93	49.77 ±1.13	115.72	14.19 ±0.46	129.07 ±1.61	109.42 ±4.16	126.9
TCLT	60.64 ±4.80	49.15 ±1.10	113.2	10.58 ±0.95	119.5 ±0.35	108.25 ±4.08	118.00
TCL	0.95 ±0.34	0.62 ±0.03	2.50	3.62 ±0.62	9.59 ±1.26	1.17 ±0.18	8.88
Verb	0.0007 ±0.0001	0.0014 ±0.001	0.007	0.001 ±0.0001	0.004 ±0.01	0.0008 ±0.001	0.002
Estq	0.0008 ±0.002	0.0011 ±0.002	0.0003	0.0004 ±0.0002	0.0045 ±0.01	0.0005 ±0.0003	0.0018
Raf	0.0011 ±0.0003	0.0013 ±0.000	0.0009	0.0014 ±0.0003	0.0019 ±0.001	0.0003 ±0.0001	0.0022
Glu	0.004 ±0.0001	0.0057 ±0.01	0.0009	0.0008 ±0.0001	0.024 ±0.01	0.0012 ±0.0002	0.013
Frut	0.0005 ±0.001	0.0005 ±0.000	0.0007	0.0008 ±0.01	0.003 ±0.001	0.00012 ±0.002	0.0019
Sac	0.004 ±0.0004	0.0062 ±0.01	0.0015	0.0016 ±0.004	0.0027 ±0.01	0.0013 ±0.001	0.014
Flv	2.58 ±1.09	11.67 ±3.96	7.35	24.77 ±13.60	68.44 ±12.88	2.21 ±0.59	30.30
Alc	1.09 ±1.11	0.34 ±0.07	5.09	0.92 ±0.14	2.97 ±0.11	0.30 ±0.001	2.73
Sap	1.13 ±1.39	11.63 ±2.96	1.30	1.61 ±0.55	9.73 ±1.38	0.43 ±0.10	5.48
Trit	8.01 ±0.66	8.41 ±0.38	11.13	7.43 ±1.08	9.18 ±1.53	7.75 ±0.41	8.83
ET	0.52 ±0.17	0.80 ±0.13	1.39	10.71 ±3.16	7.07 ±1.75	0.57 ±0.12	5.26

Los bajos contenidos de Verb en el grupo uno (figura 1 y tabla 1) coinciden con los resultados reportados por ⁵⁷ en Erythrina y también encontraron a la Verb en menor concentración que la Raf y la Estq.

Mientras que, ⁶⁰ señalaron que en E. variegata se incrementan las concentraciones de metabolitos secundarios con la edad y menores valores a los 60 días de rebrote. ⁵y⁴⁴ informaron valores inferiores a 0,62 g/kg de ET en S. humboldtiana, S. alba y P. alba, los que concuerdan con los reportados en el presente estudio, por lo que es poco probable que la proporción de ET (0,52 g/kg) encontradas en las especies del primer grupo sea de importancia para su empleo en dietas de animales, aunque la literatura señala que los efectos tóxicos de este metabolito son limitados (^{Paumier et al. 2020}y^{Verdecia et al. 2020b}). No obstante, en T. diversifolia se deben realizar estudios sobre la respuesta biológica y comportamiento animal, ya que su valor es superior al resto de las especies evaluadas. No obstante, ²³ al evaluar los efectos del cambio climático en los compuestos secundarios (polifenoles, alcaloides y terpenos) de árboles, encontraron que los niveles de CO2 de 4-6.7 favorecen los valores de polifenoles en el follaje y decrecen los terpenoides, mientras que con los valores normales (1.5-3) de CO2 se obtiene altos contenidos de terpenos con disminución de los polifenoles.

Por otra parte, ²³y¹³ señalaron que la presencia de los compuestos secundarios está relacionada con la edad del material, los mecanismos de defensa de la planta, el contenido de nutrientes primarios y la influencia del suelo y clima. En la complejidad del ecosistema donde se desarrollan las plantas, esencialmente el clima y el suelo ejercen gran influencia en lo que respecta a los principios activos y compuestos secundarios. La humedad, el contenido de sales, nutrimentos de suelo, la luz, temperatura y precipitaciones, fundamentalmente, tienen marcado efecto en su presencia en las plantas, ya que sus carencias y excesos provocan situaciones de estrés que provocan la síntesis de estas sustancias; por ejemplo, la velocidad del viento, factor poco estudiado experimentalmente, es determinante en muchos casos ya que se conoce que por su acción se incrementa la evaporación de aceite esenciales y en el caso de los alcaloides tropánicos el aumento de la transpiración en las plantas hace que sea mayor el contenido de líquido que asciende desde las raíces.

En el segundo grupo G. sepium (120 y 180 días, en el período lluvioso) mostró las menores concentraciones de TCL y los mayores de Sap. ⁸ indicaron valores de 2.71 g/kg de TCL, ⁴⁹ notificaron 13.8 g/kg de Sap, por lo que la G. sepium se pudiera considerar, según ⁴⁶y⁴³, como la leguminosa tropical con menor contenido de taninos condensados, en comparación con Eucalyptus grandis, Arabidopsis thaliana, Acacia mangium y Callyandra sp. (^{Pinard et al. 2019}y^{Huang et al. 2020}).

Los contenidos de Sap, aunque fueron los mayores en el período lluvioso (tabla 1) son inferiores a los reportados por ⁵⁵ en Acacia concinna (34 g/kg). Por su parte, ¹⁵ en varias especies de los géneros Albizia, Cassia y Pithecellobium, encontraron entre 12.8 y 38.5 g/kg de Sap con los mayores valores para el género Pithecellobium. Por lo anterior, el contenido de Sap (11.63 g/kg) hallado en el presente estudio se puede clasificar de ligero.

E. variegata a los 180 días formó parte del tercer grupo con los mayores tenores en Verb, Alc y Trit, y los menores de Estq. Comportamiento similar a los obtenidos por ⁶⁰ los que notificaron valores de Verb, Alc, Trit y Estq de 0.007, 5.09, 11.13 y 0.0029 g/kg, respectivamente en el follaje de Erythrina variegata, y plantearon que los contenidos de Verb, Est y Trit en las diferentes partes de las plantas son variables dependiendo de las características de cada especie y de la fase fenológica de la planta, ya que estos compuestos presentan movilidad entre los diferentes órganos.

Por otra parte, ³⁵y¹⁸ identificaron en semilla de Erythrina poeppigiana alcaloides, hipaforina, erisodina, esteroles, estigmasterol e isoflavonoides, mientras que ³⁷ en E. suberosa notificaron que las semillas contienen gran cantidad de ácidos orgánicos, esteroides y alcaloides, y también aislaron eritralina, erisodina, erisotrina e hipaforina por lo que concluyeron que, por las propiedades farmacológicas de estos compuestos presentes en diferentes extractos, pueden tener actividad anticancerígena. Por ello, sería apropiado realizar investigaciones futuras sobre este tema en las semillas de Erythrina variegata.

Con los mejores resultados, de forma integral durante el período lluvioso, se presentó la T. diversifolia en el cuarto grupo, con las menores concentraciones de TCT, TCLT, Glu, Trit y mayores de ET. ^{Santacoloma-Varón y Granados (2012)} encontraron en esta planta entre 0,43 y 2,6 g/kg de FT y desde 3,1 hasta 4,9 g/kg de TC mientras que, ³⁰y⁵⁸ informaron de 6,4 a 8,7 g/kg de FT, aunque los Trit y ET fueron superiores con 10,2 a 13.9 y de 25.4 a 29.2 g/kg, respectivamente. Aspectos que denotan que el contenido de metabolitos está controlado por aspectos genéticos de cada especie, fundamentalmente, y en segundo lugar por el ambiente. Aunque es de destacar que los contenidos en esta especie son inferiores a los reportados en L. leucocephala, G. sepium y N. wightii.

El quinto grupo compuesto por la L. leucocephala, desde el punto de vista de la concentración de metabolitos secundarios, fue la de los peores resultados integrales con las mayores cantidades de TT, FT, TCT, TCLT, TCL, Estq y Flv, aunque mostró los mayores valores de Glu, Frut y Sac. Estos resultados coinciden con los reportados por ⁵⁹ en L. leucocephala, los que al evaluar el efecto de los metabolitos secundarios en la digestibilidad encontraron relaciones superiores a R2= 0.80 para los TT, TCT y Sap. No obstante, aunque la concentración de TT (21,49 g/kg) encontrada en este grupo pudiera ser un elemento positivo al evaluar, íntegramente, las características antinutricionales de la fracción polifenólica de esta especie, ya que se encuentran en el rango donde, posiblemente, no se afecta el ecosistema ruminal y aumenta la probabilidad de formación de proteína sobrepasante y facilitaría la digestibilidad posruminal del nitrógeno (^{Albores-Moreno et al. 2019}).

El contenido de carbohidratos solubles está ligado al desarrollo morfo-estructural de las plantas. Las reservas de estos compuestos, en menor cantidad, en los puntos de crecimiento (yemas) favorecen las concentraciones foliares de sacáridos después de la emisión del rebrote. No obstante, aunque de forma general estos aspectos están descritos desde el punto de vista fisiológico, el comportamiento de los metabolitos energéticos en función de las variaciones morfo-estructurales depende de la especie, estado nutricional y condiciones edafoclimáticas en la cual se cultiva (^{Cao et al. 2011}).

T. labialis a los 60, 75 y 90 días en el sexto grupo (tabla 1) presentó las menores concentraciones de FT, Raf, Frut, Sac, Flv, Alc y Sap. Resultados similares obtuvieron ^{Scull y Savón (2003)} al reportar de 3.32-6.9 g/kg de FT en Vigna unguiculata y ⁴¹ encontraron valores de FT de 3-6 g/kg en Ipomoea triloba, Stizolobium deeringianum y Stizolobium pruri, por lo que se pudiera considerar que las variedades de estas leguminosas tienen bajo contenido total de polifenoles y de taninos condensados, y en general, de metabolitos secundarios si se comparan con las otras especies de leguminosas informadas en la presente investigación. Sin embargo, lo anterior precisa de futuras investigaciones que contemplen mayor número de leguminosas.

⁵² encontraron en Lablab purpureus que las concentraciones de Sac y Frut (0,041 y 0,083 mg, respectivamente) fueron bajas si se comparan con las reportadas en T. labialis en el sexto grupo durante el período lluvioso, mientras que ³⁹ mostraron resultados similares a los de la presente investigación en G. sepium. El contenido de monosacáridos en las leguminosas suele ser bajo, porque estos azúcares se utilizan en la biosíntesis de disacáridos y oligosacáridos durante el desarrollo de las plantas para la formación de tejidos, flores y semillas (⁵⁹.

En el séptimo grupo la L. leucocephala a los 60 días tuvo bajos contenidos en TT y altos de Raf. ⁴⁶y³² también encontraron en Albizia lebbekoides y Acacia cornigera bajos tenores de TT (3.01 g/kg). Este comportamiento a edades tempranas de las arbóreas describe que las especies con mayor proporción de fibra presentan elevada concentración de metabolitos hidroxilados, aspectos que coinciden con lo planteado por numerosos autores sobre el efecto negativo de los compuestos de la pared celular y los taninos en la nutrición animal (^{Barragán-Hernández et al. 2019}).

En el período poco lluvioso se obtuvieron ocho grupos según la similitud de los metabolitos primarios y secundarios (figura 2). T. labialis (30, 45, 60, 75 y 90 días) y N. wightii (90 días) formaron el primer grupo y se caracterizaron por bajos tenores de Raf, Frut y ET. En el segundo E. variegata (180 días) mostró los mayores valores de TT, Alc y Trit. La N. wightii (30, 45, 60 y 75 días) en el tercer grupo presentó las menores cantidades de Verb, Flv, Alc, Sap y Trit. En el cuarto estuvo E. variegata (60 y 120 días) con los resultados más bajos de Estq y los mayores de Frut. La G. sepium (60, 120 y 180 días) con la menor concentración de TCL ocupó el quinto grupo. La T. diversifolia (60, 120 y 180 días) en el sexto grupo tuvo los tenores más bajos de TT, FT, TCT, TCLT, Glu y Sac, y los mayores de ET. En el séptimo grupo la L. leucocephala (60 y 120 días) reveló las cantidades más elevadas de Verb, Estq, Raf, Glu y Sac. La L. leucocephala a los 180 días ocupó el octavo grupo y presentó las mayores concentraciones de FT, TCT, TCLT, TCL, Flv y Sap (tabla 2).

Figura 2 Dendrograma del contenido de metabolitos primarios y secundarios de árboles, arbustos y leguminosas volubles durante el período poco lluvioso 

T. labialis (30, 45, 60, 75 y 90 días) y N. wightii (90 días) en el primer grupo (tabla 2) se caracterizaron por bajos contenidos de Raf, Frut y ET. Estos resultados pudieran estar relacionados con lo planteado por ⁴⁷y³¹ quienes en Phaseolus vulgaris y Moringa oleifera encontraron que los valores de carbohidratos estaban estrechamente correlacionados con la sucesión de los eventos fenológicos, desde el crecimiento temprano hasta la formación de las flores y floración. A partir de este último comenzó el decrecimiento general de los carbohidratos, mientras que los oligosacáridos presentaron un comportamiento muy variable durante el estudio, donde fueron mayoritarios la Estq y la Verb.

Tabla 2 Concentración de metabolitos primarios y secundarios según los grupos obtenidos por análisis de conglomerado en el período poco lluvioso 

Metabolitos Primarios y secundarios,g/kg	Grupos
	1-T, labialis (30, 45, 60, 75, 90 d) N, wightii (90 d)	2-E, variegate (180 d)	3-N, wightii (30, 45, 60, 75 d)	4-E, variegate (60, 120 d)	5-G, sepium (60, 120, 180 d)	6-T, diversifolia (60, 120, 180 d)	7-L, leucocephala (60, 120 d)	8-L, leucocephala (180 d)
N	82.19±3.59	121.1	98.30±0.47	154.4±4.30	148.1±5.80	151.3±6.09	198.97±3.51	161.9
TT	4.40 ± 1.23	35.29	2.24 ± 0.45	27.30 ± 3.58	13.28 ± 2.85	2.22 ± 0.88	26.89 ± 5.18	34.10
FT	8.85 ± 0.9	48.09	7.24 ± 0.48	43.79 ± 5.18	31.88 ± 3.94	5.87 ± 0.56	46.15 ± 2.91	50.53
TCT	103.19 ± 8.56	97.52	68.08 ± 7.49	65.07 ± 0.2	38.88 ± 4.49	11.56 ± 1.40	133.42 ± 8.59	142.04
TCLT	101.79 ± 8.7	94.73	67.24 ± 7.30	63.28 ± 0.01	38.19 ± 4.50	9.42 ± 0.68	123.77 ± 9.61	130.48
TCL	1.39 ± 0.43	2.79	0.85 ± 0.21	1.79 ± 0.21	0.69 ± 0.1	2.13 ± 0.76	9.65 ± 1.01	11.56
Verb	0.0006 ± 0.0002	0.0007	0.0004 ± 0.0001	0.0006 ± 0.0001	0.0008 ± 0.0002	0.0005 ± 0.0002	0.0025 ± 0.0002	0.0012
Estq	0.0006 ± 0.0002	0.0002	0.0007 ± 0.0001	0.0002 ± 0.000	0.0007 ± 0.0001	0.0002 ± 0.000	0.0032 ± 0.0006	0.0002
Raf	0.0004 ± 0.0005	0.0009	0.001 ± 0.0003	0.001 ± 0.0001	0.0007 ± 0.0003	0.0014 ± 0.0002	0.0018 ± 0.0005	0.0012
Glu	0.0017 ± 0.0007	0.0009	0.0031 ± 0.0005	0.0021 ± 0.0013	0.0039 ± 0.0007	0.0006 ± 0.0001	0.02 ± 0.0049	0.010
Frut	0.0001 ± 0.0001	0.0009	0.0003 ± 0.0001	0.0011 ± 0.0001	0.0004 ± 0.0003	0.0005 ± 0.0002	0.0005 ± 0.0003	0.0004
Sac	0.0018 ± 0.0007	0.0017	0.0034 ± 0.0005	0.0032 ± 0.0012	0.0043 ± 0.0009	0.0011 ± 0.0002	0.02 ± 0.0042	0.010
Flv	2.30 ± 1.11	10.05	1.99 ± 0.67	5.38 ± 2.66	11.25 ± 4.83	29.75 ± 14.61	54.13 ± 10.37	86.95
Alc	0.28 ± 0.07	5.22	0.25 ± 0.06	4.65 ± 0.42	0.33 ± 0.06	0.99 ± 0.2	2.87 ± 0.15	3.25
Sap	0.42 ± 0.15	1.38	0.35 ± 0.11	0.79 ± 0.14	10.30 ± 3.13	1.97 ± 0.37	9.82 ±3.68	15.17
Trit	7.79 ± 0.57	10.11	7.68 ± 0.30	9.29 ± 0.07	8.05 ± 0.11	7.69 ± 1.34	7.76 ± 0.96	8.43
ET	0.50 ± 0.12	1.43	0.54 ± 0.08	1.01 ± 0.31	0.77 ± 0.23	11.59 ± 3.39	5.00 ± 1.18	8.65

En el segundo grupo en el período lluvioso solo estuvo la E. variegata a los 180 días con los mayores valores de TT, Alc y Trit. El contenido de TT obtenido en la presente investigación son comparables con los informados por ^{Herlina y Supratman (2016)}y^{Herlina et al. (2018)} en Erythrina poeppigiana quienes encontraron 4.6-35.9 g/kg de TT, y este último valor fue superior al del resto de las arbóreas estudiadas, aunque no sobrepasó la concentración a partir de la cual se comienza a afectar la fermentación ruminal (^{Makkar 2003}). Es de destacar que estos autores también identificaron isoflavonoides, flavonoides y cuersentina.

Los Alc en Erythrina se encuentran distribuidos en toda la planta, en mayor cuantía en las semillas, corteza del tallo y flores, aunque también existen reportes de su presencia, en menores proporciones, en las raíces y las hojas (¹⁷. Los resultados de la presente investigación están dentro del rango informado por ^{Verdecia et al. (2019},^2020a) en E. variegata y J. curcas de 3.4 a 10.4 g/kg.

N. wightii a los 30, 45, 60 y 75 días, en el período poco lluvioso, en el tercer grupo mostró los menores valores de Verb, Flv, Alc, Sap y Trit. Los tenores de Verb son bajos al estar influenciados por la edad de planta y diferentes autores (^{Salas et al. 2015}y^{Espejo y Morales 2019}) señalaron que el contenido individual de cada α-galactósido depende no sólo del tipo de leguminosa y de los genotipos, sino también de las condiciones de cultivo.

Las concentraciones de Flv encontrados (1,5 g/kg) coinciden con lo informado por ⁵⁶, pero son inferiores a los obtenidos por ³³ en los tallos (7.5-17.2 g/kg) y las hojas (15-17.6 g/kg) de Leucaena leucocephala y Mucuna gigantea. La mayor concentración en las hojas se debe a su función en los vegetales, por su importancia para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas al protegerlas contra agentes externos, como la radiación UV, microorganismos, animales herbívoros y del medio ambiente. Pueden actuar también como señalizadores químicos, indicando a los insectos la planta apropiada para su alimentación.

Las fluctuaciones de los carbohidratos no estructurales de la E. variegata a las edades de 60 y 120 días en el cuarto grupo durante el período poco lluvioso, se pudieran deber a factores genéticos, condiciones climatológicas, el terreno donde se desarrollan y las técnicas de cultivo utilizadas. La maduración de la planta, es importante a la hora de evaluar el contenido en carbohidratos, si se tiene en cuenta que la Frut se sintetiza durante las primeras etapas del crecimiento y las mayores cantidades de los α-galactósidos, como es el caso de la Estq, se encuentran durante la floración y fructificación (^{Sánchez-Mendoza et al. 2016},^{Kannan et al. 2018}y^{Shibata et al. 2018}).

Con los mejores resultados integralmente en el quinto grupo la G. sepium a las edades de 60, 120 y 180 días en el período poco lluvioso, presentó los menores valores de TCL y esto concuerdan con lo reportado por ²⁷y⁹, quienes recomiendan a esta especie para su uso como forraje de excelente calidad.

^{Santacoloma-Varón y Granados (2012)} en esta especie encontraron baja cantidad de taninos, lo que pudo estar relacionado con la toma de las muestras, las cuales se realizaron durante el período poco lluvioso, donde las condiciones ambientales pueden afectar la tasa fotosintética y en consecuencia la síntesis de metabolitos secundarios. Además, se debe tener en cuenta que estas sustancias se sintetizan en la planta y cumplen funciones como la defensa contra hongos, bacterias y virus, protección contra la radiación ultravioleta y sirven como mecanismo para evitar la deshidratación de los tejidos, aspecto que pudieron afectar su concentración (^{Silva et al. 2017}).

T. diversifolia (60, 120 y 180 días) presentó al igual que G. sepium los mejores resultados integrales. Las menores concentraciones de TT, FT, TCT, TCLT, Glu y Sac, y la mayor de ET se deben, fundamentalmente, a que durante el período poco lluvioso las hojas interceptan menor proporción de luz y en consecuencia menor producción de metabolitos primarios y secundarios, debido a la menor velocidad de las reacciones bioquímicas en la planta (^{González-Sierra et al. 2019}y^{Rodríguez et al. 2019}), mientras que ^{Santacoloma-Varón y Granados (2012)} al estudiar el contenido de FT, TT y TC en esta especie en varios pisos térmicos no encontraron diferencias significativas. Por otra parte, ²⁸ reportaron bajos contenidos de FT, TT, Trit y ET. Esta poca variabilidad encontrada se pudiera deber a que el volumen y velocidad de las reacciones bioquímicas puede aumentar con la temperatura y la mayoría de reacciones en las plantas tienen un óptimo térmico característico, que disminuye tanto a temperaturas superiores como inferiores. Esto se debe, en primera instancia, a que la actividad enzimática y la integridad de las membranas celulares se afectan por las temperaturas extremas.

^{Estrada-Jiménez et al. (2019)} en T. diversifolia notificaron 12 g/kg de ET, resultados similares a los obtenidos en el presente estudio, respuesta que puede estar dada por la similitud en las condiciones climáticas y de suelo, aspectos que influyen directamente en la producción de compuestos secundarios. Por su parte, corroborando esta afirmación ^{Herrera (2020)} reportaron relación estrecha entre este metabolito y la temperatura máxima y las lluvias.

La L. leucocephala a los 60 y 120 días, durante el período poco lluvioso se situó en el séptimo grupo y presentó los mayores valores de oligosacáridos (Verb, Estq y Raf) y de Glu y Sac. Aunque, es de señalar que las concentraciones de Glu y Sac en los vegetales son superiores a la de los oligosacáridos. Este comportamiento fue señalado por ^{Almeida (2003)}y⁶² quienes reportaron mayores concentraciones de estos durante la etapa de crecimiento vegetativo, lo que pudo estar determinado por la velocidad de la actividad fotosintética y el estado fenológico de las plantas donde los carbohidratos son muy utilizados en el crecimiento y desarrollo de la planta.

¹ al evaluar el efecto del estrés hídrico en gramíneas pratenses encontraron que la Raf, Estq y Verb se incrementaron, mientras que la Glu y Sac se mantenían estables y la Frut disminuía en más de 50%. Es probable que esta respuesta también ocurra en las leguminosas, aunque sería necesario diseñar investigaciones específicas para validar esta hipótesis.

En el octavo grupo estuvo solo la L. leucocephala a los 180 días, en el período poco lluvioso, y se caracterizó por presentar las mayores concentraciones de FT, TCT, TCLT, TCL y Flv. Estos resultados son similares a los reportados por ⁵⁹ los que encontraron en esta especie en el Valle del Cauto valores de 43, 130, 119, 10 y 77 g/kg para FT, TCT, TCLT, TCL y Flv, respectivamente. En Jatropha curcas^{Verdecia et al. (2019)} informaron tenores de TC en el rango de 65-98 g/kg, de estos el 90% son TCLT y cerca del 70% están ligados a la proteína, fundamentalmente porque a mayor concentración de TCT, mayor será la cantidad de estos acoplados a las proteínas por la afinidad que tienen por este nutriente.

¹¹ obtuvieron valores de 22.2 a 33.6 y de 105 hasta 238 g/kg de FT y TCLT, respectivamente y lo relacionaron con las altas proporciones de taninos ligados con la reducción de la digestibilidad de la pared celular. Aspectos destacados por ²² al reportar correlaciones superiores a R2 = -0.71 entre los polifenoles y la DMO, DIVMS y DFND.

Conclusiones

La edad presentó marcado efecto en el contenido de metabolitos primarios y secundarios al disminuir los primeros e incrementarse los segundos en la medida que la madurez avanzaba. Este comportamiento se evidenció al constatar, mediante el análisis de conglomerados, que los grupos donde se encontraron los mayores contenidos de los compuestos secundarios estaban integrados por las edades más avanzadas de las especies Neonotonia wightii, Teramnus labialis, Erythrina variegata y Leucaena leucocephala, en ambos periodos estacionales. Aspectos de vital importancia para trabajos futuros donde se analice los efectos asociativos de especies con menor contenido de estos compuestos (Tithonia diversifolia y Gliricidia sepium) tanto en el ecosistema como en la respuesta animal.

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Recibido: 05 de Septiembre de 2010; Aprobado: 23 de Diciembre de 2020

^*Email: [e-mail]

Conflicto de intereses: Los autores declaran que no existen conflict de intereses

Contribucion de los autores: D.M. Verdecia: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo R. del Carmen Herrera-Herrera: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo. R.S. Herrera: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo. J.L. Ramírez: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo. S. López: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo. L.G. Hernández-Montiel: Idea original, diseño de la investigación, análisis, escritura del artículo. A.R. Sánchez: análisis de la información, escritura del artículo. R. Bodas: análisis de la información, escritura del artículo. F.J. Giráldez: análisis de la información, escritura del artículo. J. Guillaume: análisis de la información, escritura del artículo. H. Uvidia: análisis de la información, escritura del artículo.