Ciencia Animal

Selección de un medio de cultivo para el crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA- 27 como aditivo activador de la fermentación ruminal

Bexy González Mora^{1  2  *} 
http://orcid.org/0000-0001-6408-2859

Dailyn Sosa Cossio¹ 
http://orcid.org/0000-0003-3933-1176

Yoandra Marrero Rodríguez¹ 
http://orcid.org/0000-0001-6213-5857

Yaneisy García Hernández¹ 
http://orcid.org/0000-0002-7055-4880

Nereyda Albelo Dorta¹ 
http://orcid.org/0000-0003-4827-3991

¹Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas. Mayabeque, Cuba

²Facultad de Zootecnia y Ecología, Universidad Autónoma de Chihuahua (UACH), Perif. Francisco. R. Almada km 1, Zootecnia, Chihuahua, CP 33820. Chihuahua, México

RESUMEN

Para seleccionar un medio de cultivo no convencional para el crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27 como aditivo activador de la fermentación ruminal, se realizaron dos ensayos en los que se utilizó caldo YPG (extracto de levadura 10 g/L, peptona 10 g/L y glucosa 20 g/L) como medio control. En el primero, se evaluaron siete medios de cultivo para el crecimiento de la levadura a las 24 horas de fermentación. Mientras que en el segundo, se realizó la cinética de crecimiento en el medio seleccionado del primer ensayo. Además, en este último se determinó la velocidad específica máxima de crecimiento, el tiempo de duplicación de la biomasa y se realizó el balance estequiométrico del medio seleccionado. A las 24 horas de fermentación, no se encontraron diferencias entre los medios estudiados y el caldo YPG (p=0.073). Por tanto, este último se puede sustituir sin que se afecte el crecimiento de la cepa en 24 h. En el estudio de la cinética, se presentó mayor concentración microbiana a las 12 h (P<0.0001) en el medio que contenía melaza y urea. La velocidad específica máxima de crecimiento fue inferior (P=0.0260) y el tiempo de duplicación de la biomasa fue superior (P=0.0283) con respecto al control. El medio seleccionado constituye una opción adecuada para la producción de LEVICA-27, pues permite obtener buena concentración celular, cubrir los requerimientos nutricionales e incluye menos componentes en su preparación. Esto ofrece ventajas económicas y operacionales para la obtención del aditivo a escalas productivas.

Palabras clave: melaza; levadura; fermentación; biomasa

La utilización de aditivos con levaduras en la alimentación de rumiantes constituye una alternativa para incrementar la producción de leche y carne en el mundo (^{Elghandour et al. 2020} y ^{Suntara et al. 2021}). Para la obtención de estos aditivos mediante procesos fermentativos es importante seleccionar un medio de cultivo que sea económicamente factible y cubra los requerimientos nutricionales de la cepa de levadura que se utilice.

Se estima que, aproximadamente, 30 % del costo total de la fermentación lo constituye el costo del medio de cultivo (^{Bharti et al. 2018}). Los medios comerciales más utilizados para el crecimiento de levaduras en estudios de laboratorio son extracto de malta y caldo YPG (extracto de levadura, peptona y glucosa). Sin embargo, los altos precios que tienen en el mercado impiden su utilización a escalas productivas. Por esta razón, es necesario destinar esfuerzos en la búsqueda de fuentes económicas de nutrientes para la producción de levaduras a grandes escalas.

El uso de subproductos agroindustriales, como sustratos para el crecimiento microbiano se estudia ampliamente porque suministra fuentes de carbono y nitrógeno que resultan menos costosas. Además, permite la utilización de residuos que se deberían tratar antes de su eliminación, y así agregar valor a estos últimos. Entre los subproductos agroindustriales más empleados se encuentran la melaza de caña de azúcar (^{Álvarez-Cao et al. 2019} y ^{Bento et al. 2020}) y el suero de leche (^{Cortez et al. 2019} y ^{Santiesteban-Lopez et al. 2020}). Sin embargo, los resultados con el empleo de estos medios no convencionales varían según la cepa de levadura que se utilice (^{Marrero et al. 2016} y ^{Marrero et al. 2020a}). Por las razones anteriores, es necesario encontrar los componentes adecuados en el medio de cultivo, de modo que garanticen el mayor crecimiento posible.

El Instituto de Ciencia Animal (ICA) de la República de Cuba cuenta con una colección de levaduras aisladas del ecosistema ruminal de vacas que consumieron previamente un producto fermentado, rico en levadura (^{Sosa et al. 2018}). Entre ellas se encuentra Pichia guilliermondii LEVICA-27, que demostró en estudios anteriores potencialidades para estimular la fermentación ruminal en animales que consumen dietas fibrosas (^{Marrero et al. 2020a b}). Los resultados justifican la búsqueda de un medio de cultivo adecuado y económicamente factible para la obtención de un aditivo con Pichia guilliermondii LEVICA-27 a escalas industriales y su posterior introducción en los sistemas ganaderos. De ahí que, el objetivo de esta investigación fue seleccionar un medio de cultivo no convencional para el crecimiento de la cepa Pichia guilliermondii LEVICA-27.

Materiales y Métodos

Los estudios se realizaron en el Laboratorio de Producción de Alimentos de la Unidad Central de Laboratorios (UCELAB) perteneciente al Instituto de Ciencia Animal (ICA), ubicado en Carretera Central km 47 ½, en San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

Diseño y tratamientos experimentales. Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27 en medios de cultivo, a partir de sustratos económicos. En el primero se utilizó un diseño completamente aleatorizado para comparar el crecimiento de la levadura en cada medio a evaluar (M2, M3, M4, M5, M6 y M7) con respecto al medio control YPG (extracto de levadura 10 g/L, peptona 10 g/L y glucosa 20 g/L). Previamente, se consultó el efecto de diferentes componentes que usualmente se informan para el crecimiento de levaduras. El medio M2 fue propuesto por ^{Sánchez et al. (2007)} para una cepa de Pichia guilliermondii, destinada a la alimentación animal. Luego, a este medio de cultivo se le realizaron modificaciones que consistieron en la incorporación de algunas fuentes minerales. La tabla 1 muestra la composición de los siete medios de cultivo evaluados en el primer ensayo.

Tabla 1 Composición de los medios de cultivo (M1, M2, M3, M4, M5, M6 y M7), evaluados para el crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27 

Concentración de nutrientes (g/L)	M1 (Control)	M2	M3	M4	M5	M6	M7
Melaza de caña de azúcar	-	20	20	20	20	20	20
Extracto de levadura	10	-	-	-	-	-	-
Peptona	10	-	-	-	-	-	-
Glucosa	20	-	-	-	-	-	-
Urea	-	10	10	10	10	10	10
KH2PO4	-	-	5	5	5	5	5
MgSO4	-	-	1.5	1.5	1.5	1.5	-
FeCl3·6H2O	-	-	0.15	0.15	0.15	-	-
CuSO4	-	-	0.1	0.1	-	-	-
MnSO4·H2O	-	-	0.06	-	-	-	-

Una vez que se seleccionó el medio de cultivo más adecuado desde el punto de vista técnico y económico para el cultivo de Pichia guilliermondii LEVICA-27, se realizó el segundo ensayo. En este se utilizó un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial 2 x10, en el que se monitoreó el crecimiento de la levadura en el medio seleccionado anteriormente. Los factores fueron el medio de cultivo y el tiempo (0, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 h). Se utilizó caldo YPG como medio control y se realizaron tres repeticiones en cada horario de muestreo para los dos medios de cultivo estudiados.

Procedimiento experimental. Se utilizó la cepa Pichia guilliermondii LEVICA-27, perteneciente al Banco de Microorganismos para la Producción Animal (BAMIPA) del Instituto de Ciencia Animal (Mayabeque, Cuba). Se activó la cepa mediante dos subcultivos en caldo YPG a 110 r.p.m., 30 ºC y 24 h de incubación. A partir del cultivo activo, se obtuvo el inóculo en iguales condiciones. Se inoculó al 10 % (v/v) en erlenmeyers de 100 mL de capacidad, con 45 mL de los medios de cultivo correspondientes a los tratamientos experimentales. La concentración inicial de Pichia guilliermondii LEVICA-27 en todos los medios estudiados fue de 10⁶ ufc/mL. Los frascos se incubaron en zaranda orbital a 30 ºC y 110 r.p.m. En el primer ensayo, la toma de muestras se realizó a las 24 h. En este horario, se agitaron los frascos y se tomó 1 mL de la muestra homogénea. A todas las muestras se le realizaron diluciones seriadas con solución salina (0.85 %, p/v) como diluyente y se sembraron en placas Petri con agar Sabouraud (Biolife, Italia) para determinar, por conteo visual, las unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/mL). En el segundo ensayo, se procedió igual que en el anterior para la determinación de las ufc/mL en cada horario de muestreo. A partir de este último indicador, se determinó por regresión lineal del ln (ufc/mL) en la fase exponencial, la velocidad específica máxima de crecimiento (µ) de la cepa. Además, se calculó el tiempo de duplicación de la biomasa (t_d), según la ecuación 1.

${\mathrm{t}}_{\mathrm{d}}=\frac{\ln 2}{\mathrm{\mu }}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}$

Se realizó el balance estequiométrico del medio que se seleccionó en el primer estudio. La cantidad necesaria de fuente de carbono en el medio de cultivo se determinó mediante el rendimiento biomasa/sustrato (Y_X⁄_S), representado en la ecuación 2. Mientras, en el resto de los componentes se determinaron por balance de masa (ecuación 3), al suponer que toda la masa que se añade de cada elemento se transforma en componente celular. Se utilizó la composición elemental promedio de un microorganismo (CH_1,79O_0,50N_0,20) que informó ^{Doran (2013)}, con una desviación estándar del 3%. La concentración microbiana en g/L se determinó a partir de un modelo ajustado por regresión lineal que relaciona el peso seco de la biomasa de LEVICA-27 con las ufc/mL.

${\mathrm{Y}}_{\raisebox{1ex}{$\mathrm{X}$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$\mathrm{S}$}\right.}=\frac{{\mathrm{X}}_{\mathrm{f}}-{\mathrm{X}}_0}{{\mathrm{S}}_0-{\mathrm{S}}_{\mathrm{f}}}$

Donde:

X0 y Xf

son las concentraciones inicial y final de biomasa (g/L) y S0 y Sf las concentraciones inicial y final de sustrato respectivamente, g/L

${\mathrm{m}}_{\mathrm{i}}^0={\mathrm{w}}_{\mathrm{i}}\bullet {\mathrm{m}}_{\mathrm{x}}\mathrm{}\mathrm{}\mathrm{}$

Donde:

${\begin{array}{c}\\ m\end{array}}_{\mathrm{i}}^0$

es la masa inicial del elemento i en el medio de cultivo (g/L), la wi es la fracción másica del elemento i en la célula y mx es la masa celular, g/L.

Análisis estadístico. Los datos se procesaron con el programa estadístico Infostat (^{Di Rienzo et al. 2017}). En el primer ensayo, las medias se compararon mediante contraste ortogonal (M1 vs. M2, M3, M4, M5, M6 y M7) por la prueba de Scheffé (^{Montgomery 2004}). En el segundo, la comparación de medias entre los tratamientos se realizó mediante la prueba de ^{Duncan (1955)}.

Resultados y Discusión

En la figura 1 se muestran las concentraciones celulares (log ufc/mL) de Pichia guilliermondii LEVICA-27 a las 24 h de fermentación en los medios de cultivo evaluados. No se encontraron diferencias entre los medios estudiados, cuando se comparan cada uno con el control (M1). Se pudo comprobar que con los medios de cultivo a partir de fuentes no convencionales se obtuvieron concentraciones de Pichia guilliermondii LEVICA-27 similares a las del medio convencional usado como control. De ahí que, este último se puede sustituir por los demás, sin afectar el crecimiento de la cepa.

(EE ± 0.06, P = 0.073) ^{a, b} Letras distintas difieren a P < 0.05

Figura 1 Concentración de P. guilliermondii LEVICA-27 en los medios M1 (control), M2, M3, M4, M5, M6 y M7 cultivada a 30 ºC y 110 r.p.m., a las 24 h 

Es importante destacar que el medio M2, además de permitir el crecimiento de LEVICA-27, en concentraciones similares al control, tiene la menor cantidad de componentes. Su simplicidad le permite ser el más adecuado desde el punto de vista técnico-económico. Esta ventaja facilita la producción de la levadura a escalas superiores, en las que no sea factible la utilización de medios convencionales o con gran número de componentes. Ante la ausencia de diferencia estadística de los medios evaluados con respecto al medio convencional utilizado como control, se seleccionó el medio M2 para ser utilizado en el crecimiento de LEVICA-27. Las razones de su elección están relacionadas con su simplicidad, en cuanto a componentes y bajo costo, pues solo contiene melaza y urea, que son fuentes económicas de nutrientes para el crecimiento de levaduras.

La mayoría de los estudios consultados en la literatura científica utilizaron una cepa de Pichia guilliermondii con fines diferentes a la alimentación animal. En este estudio, se evaluaron diferentes medios de cultivo para el crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27. ^{Roepcke et al. (2011)} y ^{Wang et al. (2012)} emplearon medios de cultivo para el crecimiento de Pichia guilliermondii, similares a M3, M4, M5 y M6, y encontraron concentraciones elevadas de biomasa celular (10 g/L). De acuerdo con estos resultados, se esperaba obtener mayor concentración de biomasa en los medios M3, M4, M5 y M6. Sin embargo, no hubo diferencias entre el crecimiento obtenido con el medio control (M1) y el resto de los medios evaluados, a pesar de que contenían fuentes minerales que pueden estimular el crecimiento celular. Este resultado inesperado se pudiera relacionar con otras variables del proceso de fermentación, como la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, la velocidad de agitación, la temperatura y el pH. Es importante estudiar en investigaciones futuras estas variables que también influyen en el crecimiento de la levadura.

La melaza constituye una fuente de carbono por excelencia para el crecimiento de microorganismos. Además, posee minerales como calcio, magnesio, hierro, potasio, zinc y otros factores de crecimiento (niacina, riboflavina, ácido pantoténico) en su composición, los que también favorecen el crecimiento celular, y pudieran ser la razón por la cual LEVICA-27 no requirió de otras fuentes de minerales. ^{Do et al. (2019)} reconocen que las levaduras necesitan vitaminas y minerales para su desarrollo. Sin embargo, señalaron que los requerimientos pueden variar de una cepa a otra, de manera que no hay un comportamiento homogéneo, en cuanto a los requerimientos de minerales o factores de crecimiento en las levaduras. En el caso de LEVICA-27, la melaza de caña de azúcar además de satisfacer las necesidades de carbono, aportó los minerales necesarios para obtener un crecimiento similar al que se obtuvo con el medio comercial YPG. La posibilidad de prescindir de estos componentes permite simplificar el medio de cultivo, obteniéndose una producción de biomasa aceptable sin limitaciones de nutrientes.

En el presente ensayo se utilizó urea, por ser la fuente de nitrógeno más económica a nivel mundial y su empleo cubrió las necesidades de nitrógeno, sin afectar el crecimiento de LEVICA-27. De acuerdo con estos resultados, ^{Marrero et al. (2016)} al estudiar diferentes fuentes de nitrógeno para el crecimiento de esta cepa encontraron que los mayores valores de densidad óptica se observaron con el uso de caseína y urea, resultado que duplica el que se obtuvo con sulfato de amonio.

En la figura 2 se muestran las cinéticas de crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27 en los medios M2 y control (M1). No se observó la presencia de la fase de adaptación en ninguno de los dos medios de cultivo evaluados. En ambos casos, la duración de la fase exponencial fue de 12 h aproximadamente, cuando se obtuvo la máxima concentración microbiana, con valor de 7.1 log ufc/mL en el medio M1 y 7.62 log ufc/mL en el medio M2. La fase estacionaria se extendió desde las 12 hasta las 28 h en los dos medios de cultivo.

^{a,b,c,d,e,f,g,h,i} Letras distintas difieren a P < 0.05

Figura 2 Comparación de la cinética de crecimiento de Pichia guilliermondii LEVICA-27 en los medios M1 (caldo YPG) y M2 (melaza y urea) (EE ± 0.1, P < 0.0001) a 30 ºC, durante 28 h de fermentación 

La ausencia de la fase de adaptación presentada en este ensayo es una característica deseada, sobre todo en las fermentaciones a nivel industrial, debido a que permite disminuir los tiempos de operación. De acuerdo con este resultado, ^{Wang et al. (2012)} no observaron la presencia de dicha fase, cuando cultivaron una cepa de Pichia guilliermondi en un medio diferente al que utilizaron para el inóculo en un biorreactor de laboratorio.

A diferencia del ensayo anterior, LEVICA-27 tuvo mayor concentración en el medio con fuentes no convencionales que en el medio control. La cepa alcanzó su máximo crecimiento en el medio M2 a las 12 h (7.62 log ufc/mL), por lo que en estudios posteriores será conveniente detener el proceso fermentativo en este horario, donde se obtiene el máximo crecimiento de LEVICA-27.

La tabla 2 muestra los resultados de las características del crecimiento de la cepa LEVICA-27 en los dos últimos medios estudiados. Como se observa, la velocidad específica máxima de crecimiento fue inferior en el medio M2 con respecto al control y, consecuentemente, el tiempo de duplicación de la biomasa fue superior.

Tabla 2 Características del crecimiento de la cepa Pichia guilliermondii LEVICA-27 en los medios M1 (YPG) y M2 (miel y urea) 

Indicadores	M1	M2	± EE Sign
Duración de la fase exponencial, h	0-12	0-12	-
Velocidad específica máxima de crecimiento, h^-1	0.55 ± 0.07	0.36 ± 0.06	0.04 P = 0.0260
Tiempo de duplicación de la biomasa, h	1.28 ± 0.17	1.94 ± 0.29	0.14 P = 0.0283
log Xmáx (Xmáx x10^7 ufc/mL)	7.12 ± 0,11 (1.35)	7.62 ± 0,27 (4.80)	0.12 P = 0.0392

X_máx es la concentración máxima de biomasa

Resultados similares encontraron ^{Aguilar et al. (2015)} con Saccharomyces cerevisiae, cultivada en un medio con melaza y suero lácteo (7.81 log ufc/mL), aproximadamente a las 16 h de fermentación. Estos autores obtuvieron 3.26 h como tiempo de duplicación de la biomasa y estimaron la velocidad máxima específica de crecimiento mediante el modelo de Gompertz modificado e informaron valores inferiores (0.09 h^-1) a los de la presente investigación.

^{Sánchez et al. (2007)} informaron valores de velocidad específica máxima y tiempo de duplicación de la biomasa similares a los de este estudio, al evaluar la cinética de fermentación de la cepa Pichia guilliermondii con el mismo medio M2. Sin embargo, los autores citados observaron la presencia de la fase de adaptación con 4 h de duración y la máxima concentración de biomasa (3.97 g/L) la obtuvieron a las 24 h. Esto demuestra la especificidad de los microorganismos, pues su comportamiento no solo depende del medio de cultivo, género o especie, sino de la cepa que se utilice.

En el balance estequiométrico se determinó que el medio de cultivo M2 debe contener 2.32 g/L de azúcares reductores totales (3.87 g/L de melaza de caña) y 0.39 g/L de urea para producir 7.62 log ufc/mL (1.66 g biomasa seca/L) que corresponde con la mayor concentración de LEVICA-27 alcanzada en este estudio. También el balance demostró que el medio M2, compuesto por 20 g/L de melaza de caña con 12 g/L de azúcares reductores totales (60 %) y 10 g/L de urea tiene potencialidades para obtener 4 g biomasa seca/L (10⁹ ufc/mL) de LEVICA-27, por lo que no existe limitación de nutrientes.

En cuanto al análisis económico de estos dos medios, la melaza y la urea tienen un costo en el mercado de 2.4 y 2 USD/kg, respectivamente. En cambio, el kilogramo de caldo YPG tiene un costo de 260 USD aproximadamente. Si se consideran las concentraciones de los componentes en cada medio de cultivo se obtiene que la producción de 100 L de caldo YPG tiene un costo de 400 USD, y esta misma cantidad de medio M2 (melaza y urea) tendrá un costo de 6.82 USD, de ahí que el costo de este último representa solo 1.7 % del medio convencional. Además del aspecto económico, el empleo de medios de cultivo simples es muy importante para la producción de biomasa a niveles industriales. Esto se debe a la disminución del tiempo que se utiliza en su preparación durante el proceso tecnológico.

Al analizar todos los indicadores se puede plantear que el medio M2 constituye la opción más adecuada para la producción de Pichia guilliermondii LEVICA-27 como aditivo para la alimentación animal. En este caso, además de la obtención de mejores indicadores de crecimiento que en el medio control, incluye menos componentes en su preparación y tiene un costo menor, lo que ofrece ventajas económicas y operacionales para la obtención del aditivo a escalas productivas.

References

Aguilar, J., Espinoza, M., Cabanillas, J., Ávila, I., García, A., Julca, J., Tacanga, D., Zuta, I. & Linares, G. 2015. “Evaluación de la cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae utilizando un medio de cultivo a base de melaza de caña y suero lácteo”. Agroindustrial Science5 (1): 37-47, ISSN: 2226-2989. https://doi.org/10.17268/agroind.science.2015.01.04.

Álvarez-Cao, M.E., Cerdán, M.E., González-Siso, M.I. & Becerra, M. 2019. “Bioconversion of beet molasses to alpha-galactosidase and ethanol”. Frontiers in Microbioly, 10: 405, ISSN: 1664-302X. https://doi.org/10.1186/s12934-019-1222-x.

Bento, H.B.S., Carvalho, A.K.F., Reis, C. & De Castro, H.F. 2020. “Single cell oil production and modification for fuel and food applications: assessing the potential of sugarcane molasses as culture medium for filamentous fungus”. Industrial Crops and Products 145: 112-141, ISSN: 0926-6690. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112141.

Bharti, A.K., Kumar, A., Kumar, A. & Dutt, D. 2018. “Exploitation of Parthenium hysterophorous biomass as low-cost substrate for cellulase and xylanase production under solid-state fermentation using Talaromyces stipitatus MTCC 12687”. Journal of Radiation Research and Applied Sciences 11 (4): 271-280, ISSN: 1687-8507. https://doi.org/10.1016/j.jrras.2018.01.003.

Cortez, M., Olivo, R., Rodríguez, C., Morales, G. & Montejo, C. 2019. “Evaluación del crecimiento de Aspergillus niger en un medio de cultivo líquido”. Science, Technology and Educational Research, 7 (1): 1-8, ISSN: 2007-8102.

Di Rienzo, J. A., Balzarini, M. G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C. W. 2012. Software estadístico y biometría. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

Do, H.D.T., Theron, C.W. & Fickers, P. 2019. “Organic wastes as feedstocks for non-conventional yeast-based bioprocesses”. Microorganisms 7 (8): 229, ISSN: 2076-2607. https://doi.org/10.3390/microorganisms7080229.

Doran P. 2013. Bioprocess Engineering Principles. 2nd ed. New York (EE. UU): Academic Press. ISBN: 0-12-220855-2.

Duncan, D.E. 1955. “Multiple range and multiple F test”. Biometrics, 11: 1-42, ISSN: 1541-0420. https://doi.org/10.2307/3001478.

Elghandour, M.M.Y., Tan, Z.L., Abu, H.S.H., Adegbeye, M.J., Greiner, R., Ugbogu, E.A. & Salem, A.Z.M. 2020. “Saccharomyces cerevisiae as a probiotic feed additive to non- and pseudo‐ruminant feeding: a review”. Journal of Applied Microbiology 128 (3): 658-674, ISSN: 1365 2672. https://doi.org/10.1111/jam.14416.

Marrero, Y., Angulo, C., Ruiz, O., Elías, A. & Madera, N. 2016. “Growth of Pichia guilliermondii strain Levica 27 in different energy sources and nitrogen”Cuban Journal of Agricultural Science49 (1): 47-52, ISSN: 2079-3480.

Marrero, Y., Galindo, J., Castillo, Y. & Ruiz, O. 2020a. “Development of yeast additives for feeding ruminants in Cuba”. Cuban Journal of Agricultural Science 54 (4): 457-469, ISSN: 2079-3480.

Marrero, Y., Rodríguez, R., Torres, V., Jay, O. & Galindo, J. 2020b. “Effect of yeasts on the production of gas from Cynodon nlemfuensis in an in vitro rumen incubation”. Livestock Research for Rural Development32 (1): 1-4, ISSN: 0121-3784.

Montgomery, D.C. 2004. Diseño y análisis de experimentos. 2da ed. Universidad Estatal de Arizona. Editorial Limusa Wiley, ISBN: 968-18-6156-6.

Roepcke, C.B.S., Vandenberghe, L.P.S. & Soccol, C.R. 2011. “Optimized production of Pichia guilliermondii biomass with zinc accumulation by fermentation”. Animal Feed Science and Technology163 (1): 33-42, ISSN: 0377-8401. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2010.09.018.

Sánchez, M.I., Santos, A., Dustet, J.C., Guerra, G., León, T., Argüelles, J., Ramos-Leal, M., Manzano, A.M., Casado, G. & Gómez, B. 2007. “Estudio fisiológico de una cepa de levadura con potencialidades para el enriquecimiento proteico del bagazo de caña de azúcar”. Revista CENIC, Ciencias Biológicas 38 (1):39-43, ISSN: 0253-5688.

Santiesteban-Lopez, N.A., Ceron-Carrillo, T.G., Carmona-Silva, J.L. & Chavez-Medina, J. 2020. “Cultivation of Aspergillus oryzae and Saccharomyces cerevisiae in whey for the production of single-celled protein intended for feeding cattle”. International Journal of Food Science and Biotechnology5 (2): 12-21, ISSN: 2578-964. http://dx.doi.org/10.11648/j.ijfsb.20200502.11.

Sosa, A., González, N., García, Y., Marrero, Y., Valiño, E., Galindo, J. & Moreira, O. 2018. “Collection of microorganisms with potential as additives for animal nutrition at the Institute of Animal Science”. Cuban Journal of Agricultural Science 51 (3): 311-319, ISSN: 2079-3480.

Suntara, C., Cherdthong, A., Wanapat, M., Uriyapongson, S., Leelavatcharamas, V., Sawaengkaew, J. & Foiklang, S. 2021. “Isolation and characterization of yeasts from rumen fluids for potential use as additives in ruminant feeding”. Veterinary Sciences 8 (3): 52, ISSN: 2306-7381. http://dx.doi.org/10.3390/vetsci8030052.

Wang, G.Y., Chi, Z., Song, B., Wang, Z.P. & Chi, Z.M. 2012. “High level lipid production by a novel inulinase-producing yeast Pichia guilliermondii Pcla22”. Bioresource Technology, 124: 77-82, ISSN: 0960-8524. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2012.08.024.

Recibido: 04 de Febrero de 2022; Aprobado: 28 de Marzo de 2022

^*Email: [e-mail], [e-mail]