Ciencia Animal

Diversidad genética del caprino Landim mozambicano

0000-0003-3569-253XA. Cavele¹  , 0000-0001-5040-5493E. Pérez Pineda^{2  *}  , 0000-0001-6635-3165N. Fonseca²  , 0000-0002-0956-0245J.L. Ramírez²  , 0000-0002-4505-4438D. Verdecia²  , 0000-0002-6944-0501María A. Martínez³  , 0000-0003-1657-8838J.V. Delgado³  , 0000-0001-8363-1673C.J. Barba³  , 0000-0001-5963-3409J. Grizelj⁴ 

¹ Estación Zootécnica de Angónia. Instituto de Investigaciones Agrarias de Mozambique. Distrito de Angonia, Tete, Mozambique

² Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Granma. Carretera a Manzanillo, km 17 ½, CP 85100, Bayamo, Granma, Cuba.

³ Departamento de Genética. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba, España. Campus Rabanales, Córdoba, España.

⁴ Facultad de Veterinaria. Universidad de Zagreb. Vjekoslav Heinzel Street 55, 10 000, Zagreb, Croacia.

RESUMEN

Con el propósito de determinar la diversidad genética del caprino Landim Mozambicano, se analizó el panel de 33 marcadores moleculares de tipo microsatélites, seleccionados y recomendados por el Comité de Expertos de la FAO y la Sociedad Internacional de Genética Animal para estudios de diversidad en las especies ovina y caprina. Se tomaron muestras de pelo de 60 individuos de seis provincias de Mozambique (Manica, Tete, Sofala, Nampula, Gaza e Inhambane) que concentra la mayor cantidad de animales de la raza. En el laboratorio de Biología Molecular del Animal Breeding Consulting, S.L, de la Universidad de Córdoba, España, se procedió a extraer el ADN del bulbo capilar y posterior amplificación mediante PCR. Para separar los fragmentos obtenidos se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida en un Secuenciador automático ABI Prism^® 377 XL (Applied Biosystems). El análisis de los fragmentos y el genotipado se realizó mediante los programas informáticos Genescan y Genotyper 3.7 NT. Se determinó: total de alelos por marcador, Heterocigocidades esperada y observada y Contenido de Información Polimórfica. Todos los microsatélites resultaron polimórficos, se encontraron 214 alelos, con promedio de 6.4 por marcador. Del panel analizado 29 marcadores resultaron informativos, 11 altamente informativos y 3 excepcionalmente informativos para la raza. Como hallazgo fundamental las Heterocigosidades alcanzaron valores superiores al 60%. Se concluye que la batería de microsatélites resultó adecuada para estudiar la raza, 4 de ellos se pueden excluir en futuros estudios y el caprino Landim constituye una raza con adecuada diversidad genética.

Palabras-clave: caprinos; marcadores; ADN; Mozambique

Miles de años de producción animal y reproducción controlada, combinados con los efectos de la selección natural, han dado lugar a la gran diversidad genética entre las poblaciones de animales del mundo. Los caprinos, por su parte, se encuentran entre los animales más antiguos en ser domesticados, es una de las especies más utilizadas para producir carne y leche, y se estima que en el planeta existen más de 500 razas caprinas, de las cuales el 89 % habitan en el continente africano (^{FAO 2015}). ^{Skapetas y Bampidis (2016)} informaron que cerca del 95 % del total mundial de los caprinos se encuentran en los países tropicales en vías de desarrollo, fundamentalmente en Asia y África, mientas que ^{Arellano et al. (2020)} refirieron que, por la habilidad de adaptarse a diferentes ambientes, los caprinos tienen gran diversidad como resultado de la selección natural.

En la República de Mozambique la producción animal y agrícola constituye la principal fuente de ingresos y empleo para el 85 % de la población rural. Los caprinos se utilizan para la producción de carne, proporcionando ganancias para los pequeños criadores, los que poseen más del 95 % del censo nacional. En el país la capricultura desempeña un importante papel socio-económico y cultural porque además de satisfacer las necesidades alimentarias del sector rural, los excedentes se venden o intercambian con otros productos, lo cual le permite financiar la salud, la escuela, las fiestas y las ceremonias tradicionales (^{Nhamcumbe et al. 2017}).

El caprino Landim es patrimonio genético de Mozambique, y a pesar de su alta contribución a la alimentación del pueblo, este recurso genético ha sido poco estudiado. No existe suficiente información relacionada con las regularidades de sus sistemas tradicionales de producción, de su estructura morfológica y tampoco de su diversidad genética, aspectos que limitan el diseño de una estrategia nacional eficaz para su conservación y mejora. Estas insuficiencias condicionan que el objetivo de la presente investigación fue determinar la diversidad genética de la raza utilizando marcadores moleculares de tipo microsatélites, como contribución a la conservación y mejora genética de la raza.

Materiales y Métodos

Material animal. Para el análisis molecular se tomaron muestras de pelos de 60 cabras Landim de seis provincias de Mozambique (Manica, Tete, Sofala, Nampula, Gaza e Inhambane) donde se concentran la mayor cantidad de animales de la raza. Los pelos se tomaron de la parte posterior de la nuca y se depositaron de manera individual en bolsas de plástico. Se identificaron para cada animal, su procedencia, sexo y color del pelaje. Las muestras se trasladaron al Laboratorio de Biología Molecular del Animal Breeding Consulting, S.L, en la Universidad de Córdoba, España. El ADN se extrajo del bulbo capilar, de acuerdo con las condiciones que se recogen en el siguiente protocolo.

Materiales utilizados. TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH=8; Tampón K de extracción: 40 mL de Tris-HCI 1M (pH=8.5), 20 mL de NaCl, 2.5M, 10 mL de EDTA 0.5M, 10 mL de SDS al 10 % y H2O hasta 200 mL; Acetato Sódico 3M pH=5.2 , Isopropanol; Etanol al 70 % y Muestra de pelo con raíz

Método. Lavar 10 pelos con raíz de cada animal con agua bidestilada y después con etanol 100 %. Dejar secar. Cortar las raíces de los pelos con unas tijeras esterilizadas con alcohol e introducirlos en microtubos. Añadir 300 µL de tampón de extracción. Triturar las raíces con un émbolo. Añadir 150 µL de acetato sódico 3M pH=5.2. Colocar los microtubos en el congelador (-20 ºC) al menos durante 20 minutos. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 rpm. Recoger el sobrenadante y ponerlo en otro microtubo de 1.5 mL limpio. Desechar el precipitado. Añadir igual volumen al extraído de isopropanol. Colocar en el congelador (-20 ºC) durante al menos 20 minutos. Centrifugar durante 30 minutos a 13.000 rpm. Eliminar el sobrenadante. Lavar el precipitado con 150 µLde etanol al 70 %. Centrifugar durante 5 minutos a 13.000 rpm. Eliminar el sobrenadante y dejar secar el precipitado al aire o con una bomba de vacío. Resuspender el precipitado en 100 µL de TE pH=8 y Conservar a -20 ºC.

Microsatélites analizados. Se utilizaron 33 marcadores moleculares de tipo microsatélites seleccionados y recomendados por el comité de expertos de la FAO/ISAG para estudios de diversidad genética en las especies ovina y caprina (^{FAO 2011}). Los marcadores fueron: BM1329, BM1818, BM6506, BM6526, BM8125, CRSM60, CSRD247, CSSM66, ETH10, ETH225, HAUT27, HSC, ILSTS8, ILSTS011, ILSTS19, INRA5, INRA6, INRA172, INRA63, MAF65, MAF209, MM12, OarFCB11, OarFCB20, OarFCB48, OarFCB304, SPS115, SRCRSP5, SRCRSP8, SRCRSP23, SRCRSP24, TGLA53, y TGLA122.

Amplificación y electroforesis de las secuencias microsatélites. Los microsatélites se amplificaron mediante PCR, según la metodología de ^{Martínez (2001)} en 25 µL de volumen final de una reacción: 5 µL de ADN (3 ng/µL), 2.5 Mm de cloruro de magnesio, 1 unidad de Taq Polimerasa, 200 mM de dNTPs y 0.25 mM de primers. El ciclo de reacción fue de 10 minutos a 94 °C, seguidos de 35 ciclos a 94 °C por 30'', 55 - 60 °C por 45'' y 72 °C por 30'', finalmente, después de los 35 ciclos, se mantuvo 10' a 72 °C.

Para realizar la separación por tamaños de los fragmentos obtenidos mediante PCR, se sometieron estos a la electroforesis en gel de poliacrilamida en un secuenciador automático ABI Prism^® 377 XL (Applied Biosystems), marcando los cebadores de ADN con fluorocromos de tres colores diferentes (azul, verde y amarillo), aplicando otro fluorocromo de un cuarto color (rojo) para marcar un estándar de tamaños. De esta forma se optimizó el rendimiento del gel ya que se pueden cargar en un mismo pocillo varios microsatélites de igual tamaño y marcados con tres fluorocromos distintos. Los fluorocromos utilizados se describen en la tabla 1.

Table 1 Fluorochrome used to mark the primers and emission color with the set of filters D in the sequencer ABI 377 XL. 

Fluorochrome	Nomemclature	Emission color
TET	4,7,2’,7’-tetrachlorine-6-carboxyfluoresceine	Green
6-FAM	6-carboxyfluoresceine	Blue
HEX	4,7,2’,4’,5’7’-hexachloro-6carboxyfluoresceine	Yellow
TAMRA	N,N,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrodamine	Red

Para la preparación del gel se utilizó el kit Reprogel 377 (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El análisis de los fragmentos y el genotipado se realizó con los programas informáticos GENESCAN ANALYSIS (Genescan 672v.2.0.2 y GENOTYPER® versión 2.5.2).

Análisis estadísticos. Cálculo de las frecuencias alélicas. El cálculo de las frecuencias alélicas se basó en el conteo directo de los alelos encontrados en cada locus. Las observaciones con apenas un alelo se consideraron homocigotos. Al asumir que existe un estado ideal de equilibrio Hardy-Weinberg (EHW), la varianza de una frecuencia alélica se puede describir mediante la expresión binomial:

${\sigma }_x^2=\frac{x(1-x)}{2n}$

donde x es la frecuencia alélica y n el número de individuos muestreados.

Las frecuencias alélicas para cada locus resultan de dividir el número de alelos iguales por el número total de alelos. Para su determinación se empleó el programa informático GENEPOP, versión 3.1c (^{Raymond y Rousset 1996}).

Cálculo de la heterocigosidad. Se calcularon la heterocigosidad observada (Ho) y la heterocigosidad esperada (He). La H se obtuvo por recuento directo de los individuos heterocigotos y la He se calculó a partir de las frecuencias génicas, supuesto equilibrio Hardy-Weinberg, empleando la fórmula de ^{Nei (1973)}:

$He=1-\sum _{i=1}^k{x}_i^2$

donde: xi es la frecuencia del alelo i; k es el número de alelos

Para el conjunto de los marcadores y para cada uno de ellos en el total de las muestras analizadas, las heterocigosidades se calcularon con el programa informático GENEPOP, versión 4.2.

Cálculo del Contenido de Información Polimórfica (PIC). Para su determinación, se introdujeron los datos básicos de las frecuencias de cada alelo, en una hoja cálculo EXCEL^® (Microsoft), y se utilizó la fórmula propuesta por (^{Botstein et al. 1980}):

$PIC=1-\left(\sum _{i=1}^k{x}_i^2\right)-\sum _{i=1}^{k-1}\sum _{j=i+1}^{k}2x_i^2{x}_j^2$

donde k es el número de alelos, xi, xj : frecuencia de los alelos i y j respectivamente.

Resultados y Discusión

Alelos detectados. El primer hallazgo que se observa en la tabla 2 fue que todos los microsatélites analizados mostraron polimorfismo, y que la población Landim posee un total de 214 alelos, con una dotación alélica que varía entre 2 alelos en el locus ETH225 y 13 en el locus HSC, mientras que la mayoría presentan entre 4 y 8 alelos, con un valor promedio de 6.4 para la raza; aspectos que constituyen la primera evidencia de que la raza posee variabilidad genética. El total de alelos encontrado resulta inferior al valor de 243 que reportaron ^{Silva et al. (2019)} en la cabra criolla Negra de México, pero supera la cantidad encontrada por ^{Bustamante (2019)} en cabras peruanas de las razas Lima y Piura que presentaron 172 y 165, respectivamente. Resultaron inferiores también los valores de la cabra criolla venezolana (182) y criolla cubana (164) según divulgaron (^{Aranguren et al. 2013} y ^{Chacón et al. 2018}).

Table 2 Number of alleles per marker, heterozigosities and PIC in the population of Landim goats. 

Locus	No. of alleles	He	Ho	PIC
BM1329	5.00	0.568	0.644	0.511
BM1818	8.00	0.717	0.744	0.677
BM6506	7.00	0.743	0.577	0.694
BM6526	8.00	0.716	0.704	0.665
BM8125	8.00	0.724	0.822	0.671
CRSM60	6.00	0.803	0.813	0.762
CSRD247	9.00	0.716	0.511	0.670
CSSM66	12.00	0.853	0.439	0.825
ETH10	4.00	0.686	0.644	0.613
ETH225	2.00	0.315	0.113	0.263
HAUT27	8.00	0.775	0.622	0.730
HSC	13.00	0.837	0.681	0.808
ILSTS8	4.00	0.536	0.555	0.421
ILSTS11	5.00	0.590	0.488	0.498
ILSTS19	4.00	0.611	0.704	0.548
INRA5	6.00	0.700	0.777	0.636
INRA6	9.00	0.749	0.777	0.703
INRA172	5.00	0.598	0.636	0.508
INRA63	3.00	0.643	0.644	0.560
MAF65	8.00	0.598	0.522	0.567
MAF209	3.00	0.455	0.444	0.405
MM12	11.00	0.854	0.844	0.828
OarFCB11	7.00	0.795	0.697	0.753
OarFCB20	6.00	0.717	0.704	0.658
OarFCB304	8.00	0.510	0.511	0.485
OarFCB48	6.00	0.688	0.533	0.624
SPS115	3.00	0.343	0.355	0.314
SRCRSP5	6.00	0.761	0.755	0.715
SRCRSP8	8.00	0.638	0.568	0.588
SRCRSP23	8.00	0.696	0.688	0.640
SRCRSP24	5.00	0.533	0.525	0.495
TGLA053	5.00	0.515	0.395	0.476
TGLA122	4.00	0.682	0.733	0.609
Total	214.00
Average SD	6.40 2.61	0.657 0.023	0.6117 0.0128

He= heterozygosity expected, Ho= heterozygosity observed.

PIC=polymorphic information content, SD= standard deviation.

En un estudio previo de esta raza ^{Garrine (2010)} obtuvo un promedio de 5.5 alelos, cifra que no coincide con los 6.4 alelos promedio encontrados en este estudio, lo que puede obedecer a que el muestreo realizado por aquel autor no incorporó animales de todas las regiones del país, y se analizaron menor cantidad de microsatélites (17), aunque se utilizaron 11 de los incluidos en este análisis. El valor promedio de 6.4 alelos encontrado en esta investigación es similar a lo que reportaron varios autores en diferentes razas caprinas de varias latitudes. ^{De Sousa et al. (2011)} informaron 6.9 alelos para seis cabras autóctonas de Portugal, ^{Chacón et al. (2018)} indicaron 6.38 en la cabra Criolla cubana y en ese mismo entorno se encuentran las cabras iraníes, saudíes y de Cachemira en China, según ^{Vahidi et al. (2014)}, ^{Al-Atiyat et al. (2015)} y ^{Du et al. (2017)}, respectivamente.

En este indicador, la raza Landim supera a la cabra Santanderena estudiada por ^{Jiménez et al. (2014)} que presentó un promedio de 4.23 alelos. Por el contrario, la raza Landim es superada por las razas nigerianas Maradi, West African Dwarf y Sahel que promediaron 7.9, 8.7 y 8.2 alelos, respectivamente según ^{Murital et al. (2015)} y por la raza Apureña que muestra promedio alélico de 8.6 tal como apunta ^{Gómez (2013)}. También se comportan mejor (8.1 alelos) la cabra criolla Negra mexicana estudiada por ^{Silva et al. (2019)} y las cabras lecheras de Sudáfrica según reportaron ^{Bosman et al. (2015)}.

Se encontraron cuatro microsatélites (ETH225, INRA63, MAF209 y SPS115) que mostraron menos de 4 alelos. Un hallazgo similar informó ^{Chacón et al. (2017)} en la cabra Criolla Cubana, donde los locus ETH225 y MAF209 presentaron 2 y 3 alelos, respectivamente. Para este último marcador, ^{Murital et al. (2015)} en cabras nigerianas encontraron 3 alelos y ^{Gómez (2013)} detectaron sólo 2 alelos en la cabra Apurimeña del Perú. Se coincide además con ^{Aranguren-Mendez (2013)} que señalaron poco polimorfismo para el marcador INRA63 en cabras brasileñas y venezolanas; también por la escasa dotación alélica que presenta este locus en cabras de la raza Mahabubnagar de la India, ^{Raghavendra (2016)} propone eliminarlo de estudios de diversidad caprina. Estos resultados sugieren que dichos marcadores se pueden excluir en futuros estudios de diversidad en el caprino Landim, a la vez que los 29 restantes utilizarlos para nuevos estudios de la raza, incluidos los de distancias genéticas entre poblaciones.

Los microsatélites MM12, CCSM66 y HSC fueron los que presentaron mayor número de alelos con 11, 12 y 13, respectivamente. En estos mismos locus en el estudio con las cabras Criollas cubanas se encontraron valores respectivos de 11, 9 y 9 alelos. Cifras superiores fueron reportados por ^{Gómez (2013)} en el caprino Apurimeño que encontró 10, 18 y 13 para cada uno de ellos, respectivamente y valores más elevados (19, 35 y 20) reportaron ^{Murital et al. (2015)} en cabras de Nigeria.

Heterocigosidades y Contenido de Información Polimórfica (PIC). En la tabla 2 se presentan los valores de las He y Ho obtenidas por cada marcador y se puede apreciar que ambas sobrepasan el 60%, con cifras de 0.657 y 0.611, respectivamente, lo que denota que la raza posee buen grado de diversidad, ya que cumple la condición de que más del 50% de los individuos resultan heterocigotos. Estos valores de diversidad obtenidos son superiores a los promedios indicados para esta misma raza por ^{Garrine et al. (2010)} que fueron de 0.60 y 0.54 para la He y Ho, respectivamente y para la raza Pafuri, otra raza caprina mozambicana, la He alcanzó 0.67 pero la Ho resultó ser 0.58.

En un trabajo realizado en el mismo laboratorio donde se realizó este estudio, y con el empleo del mismo panel de marcadores, donde se investigaron tres razas caprinas nigerianas, ^{Murital et al. (2015)} obtuvieron He de 0.67 en la raza Maradi, 0.70 en la raza West African Dwarf y 0.68 en la raza Sahel, por lo que todas superaron al caprino Landim pero, no ocurrió así en el caso de la Ho ya que se obtuvieron 0.61, 0.59 y 0.60, respectivamente. En el caso de la raza Saanen también encontraron valores superiores tanto para la He como la Ho (0.66 y 0.64, respectivamente) y más cercanos en la raza Kalahari (0.67 y 0.63).

En razas americanas como las autóctonas de la región apurina del Perú, ^{Gómez (2013)} reportó valores superiores de He (69 %) y Ho (66 %), respectivamente. ^{Ginja et al. (2017)} informaron para las cabras criollas del Perú un valor de He de 0.64 similar al encontrado en este trabajo. En ese entorno también se encuentra la cabra colombiana Santandereana para la cual ^{Jiménez et al. (2014)} informaron 60 % de individuos heterocigotos. Sin embargo, ^{Chacón et al. (2018)} encontraron el 58 % de individuos heterocigotos en la cabra criolla cubana, ligeramente inferior al por ciento de heterocigotos del caprino Landin.

La evaluación de las heterocigosidades por marcador arrojó que la He y la Ho experimentaron variación entre valores mínimos de 0.315 y 0.113, respectivamente en el microsatélite ETH225 y valores máximos de 0.854 y 0.844, respectivamente en el MM12, lo que evidencia la correspondencia de estos valores con los microsatélites que poseen el menor y el mayor número de alelos. Estos rangos que toman las valores de heterocigosidad en el caprino Landim tienen similitud con el rango 0.31 a 0.81 que muestran las cabras asiáticas, según ^{Sulabda et al. (2012)} y ^{Hussain et al. (2013)}, pero son inferiores a los rangos de He (0.20 y 0.90) y de Ho (0.18 y 0.93) que se obtuvieron en la raza criolla Negra mexicana según reportaron ^{Silva et al. (2019)}.

Con excepción de los marcadores ETH225, MAF209 y SPS115 que poseen menor cantidad de alelos, los restantes cuentan con un buen polimorfismo, sobrepasando todos, la cifra de 50 % en ambas heterocigosidades; lo que constituye otra evidencia de que esta raza presenta una diversidad genética adecuada.

De los 33 microsatélites analizados 11 obtuvieron valores de Ho superiores al 70 %, por lo que se pueden calificar como altamente polimórficos para la raza, si se tiene cuenta lo postulado por ^{Ott (1992)}, que un marcador posee esta categoría cuando sobrepasa el valor antes mencionado. Estos marcadores son: BM1818, BM6526, BM8125, CRSM60, ILSTS019, OarFCB11, MM12, OarFCB20, SRCRSP05, INRA005 e INRA006. Se coincide con ^{Gómez (2013)} en cuatro microsatélites (BM1818, BM6526, CRSM60 y MM12) que alcanzaron más del 70 % de Ho en la raza Apureña; y con ^{Chacón et al. (2017)} en tres (BM1818, el MM12 y el BM6526) en la raza Criolla cubana.

Otro indicador de interés que aparece en la tabla 2 es el contenido de información polimórfica, que se utiliza para determinar la calidad informativa del marcador. Se aprecia que, de los 33 marcadores utilizados en este estudio, 25 resultaron muy informativos, y solo 8 (ETH225, ILSTS008, ILSTS011, MAF209, OarFCB304, SPS115, SRCRSP24 y TGLA053) no alcanzaron tal designación por no alcanzar el valor de PIC superior al 50 %, como exige la comunidad científica internacional para identificar los marcadores con mayor calidad informativa. Los marcadores CSSM66, HSC y MM12 por presentar el PIC por encima del 80 % se pueden considerar como excepcionalmente informativos para la raza Landim.

Un aspecto a señalar es que los valores de PIC y de las heterocigosidades tienen similitud, o sea tienen relación directa, de manera que el aumento de uno provoca el aumento del otro. Respecto a esa relación, ^{Vaiman et al. (1994)} plantearon que la proximidad entre los valores de ambos parámetros indica la calidad del marcador para estudios de diversidad en razas determinadas y se permite inferir también que es el resultado de realizar el muestreo correcto en la población objeto de estudio.

Conclusiones

Todos los microsatélites resultaron polimórficos por lo que la batería utilizada es adecuada para estudiar la diversidad genética de la raza Landim. La misma posee adecuada diversidad genética por presentar más del 60 % de los individuos heterocigotos. La mayoría de los marcadores resultaron altamente informativos con PIC superior a 50 %, 11 de ellos alcanzaron más de 70 % de heterocigocidad y PIC, y 3 superaron el 80 %, que los convierten en excepcionalmente informativos para esta raza. Estos hallazgos se deben tener presente para perfeccionar la estrategia nacional de conservación y mejora de la raza, así como para futuros estudios moleculares con esta.

Agradecimientos

Se agradece a los criadores del caprino Landim que permitieron obtener muestras de sus animales y aportaron información valiosa para realizar el muestreo adecuado; a la dirección del Instituto de Investigaciones Agrarias de Mozambique que facilitó el tiempo y el financiamiento para realizar el trabajo y al personal del Laboratorio de Biología Molecular del Animal Breeding Consulting, S.L, de la Universidad de Córdoba, España, por realizar los análisis de laboratorio.

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Recibido: 16 de Junio de 2022; Aprobado: 15 de Septiembre de 2022

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