Ciencia de los Patos y otros Cultivos

Evaluación del efecto de la desinfección de explantes del pasto Cuba CT-115 con hipoclorito de sodio. Nota técnica

0000-0002-5549-5237Andrés Raúl Hernández Montesinos^{1  *}  , 0000-0002-3383-893XJosé Jorge Palma Pérez²  , 0000-0002-5560-2020Amanda Abreu Cruz¹  , 0000-0002-2641-1815Magaly Herrera Villafranca¹  , 0000-0003-1424-6311Rafael Segundo Herrera García¹ 

¹Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

²Universidad Agraria de La Habana, Autopista Nacional, km 23 ½, C.P 32700. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

RESUMEN

Con el propósito de evaluar el efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (3 y 5 %) en la desinfección de explantes, cono apical de Cenchrus purpureus vc. Cuba CT-115, para su establecimiento in vitro, se desarrolló un experimento en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Agraria de La Habana. Se realizaron dos observaciones, a los cuatro y ocho días después de la siembra. Los datos se analizaron mediante comparación de proporciones Chi-cuadrado, para p < 0.05 y se aplicó el paquete estadístico ComparPro 1.0. El análisis de comparación de proporciones de las variables estudiadas a los cuatro y ocho días no dejó ver diferencias significativas entre los tratamientos con hipoclorito de sodio al 3 y 5 %. No se encontró contaminación por hongos o bacterias en los dos tratamientos estudiados a los cuatro días. La contaminación por bacterias ocurrió a los ocho días, pero no hubo diferencia entre tratamientos. La desinfección de explantes de Cuba CT-115 se puede realizar con ambas concentraciones de hipoclorito de sodio, pero se recomienda la desinfección de conos apicales de Cuba CT-115 con hipoclorito de sodio al 3 %, lo que permite el ahorro de esta sustancia durante el procedimiento. Se sugiere estudiar otras concentraciones de hipoclorito de sodio y diferentes tiempos de inmersión.

Palabras-clave: ápices; contaminación; Cenchrus purpureus; in vitro

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica biotecnológica que comprende el mantenimiento de plantas o de sus componentes en condiciones ambientales controladas, con ausencia de microorganismos asociados, nutrición heterotrófica y recipientes de plástico o vidrio (^{Suárez Padrón 2020}). Uno de los problemas principales que se presentan cuando se trata de establecer los cultivos in vitro es la contaminación microbiana compuesta por diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus), que puede provocar la muerte de los tejidos vegetales, ya que compiten por los nutrientes y modifican el medio de cultivo (^{Mroginski et al. 2010} y ^{Nikoloff 2015}).

Entre las sustancias utilizadas para la desinfección de explantes se encuentran el hipoclorito de sodio (NaClO), hipoclorito de calcio Ca(ClO)2, peróxido de hidrógeno (H2O2), cloro comercial y bicloruro de mercurio (HgCl2), entre otros (^{Alvarado Capó 1998}). De ellos, el que más se emplea es el hipoclorito de sodio en la micropropagación vegetal, debido a su bajo costo, fácil adquisición y menor efecto fitotóxico en los tejidos (^{Ramírez Correa et al. 2014}).

El Cenchrus purpureus Schum vc. Cuba CT-115 se utiliza ampliamente en Cuba por sus características favorables de crecimiento y producción de biomasa, menor resistencia al corte, mayor cantidad de hojas, tolerancia a la sequía, bajo contenido de lignina, alto consumo y aprovechamiento por parte del animal y menor distancia entrenudos en la medida que avanza la edad. Por estos motivos, ofrece mejores posibilidades para su cosecha como banco de biomasa, incluyendo el pastoreo (^{Herrera y Martínez 2015} y ^{Crespo y Martínez 2016} y ^{Fortes et al.2019}).

La desinfección de conos apicales de C. purpureus vc. Cuba CT-115 con hipoclorito de sodio pudiera disminuir la contaminación por microrganismos endógenos en la fase de establecimiento in vitro de este cultivo. El objetivo de este ensayo fue evaluar el efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio en la desinfección de explantes de Cenchrus purpureus vc. Cuba CT-115 para su establecimiento in vitro.

Como material vegetal se utilizaron plantas de Cenchrus purpureus (Schumach) Morrone vc. Cuba CT-115 de la familia Poaceae, con la misma edad de rebrote, colectadas en el banco de germoplasma del Instituto de Ciencia Animal. Se tomaron 24 porciones de ápices caulinares.

Los ápices caulinares se desinfectaron con hipoclorito de sodio comercial al 5 % durante tres minutos y se enjuagaron dos veces con agua destilada en el momento de la recolección. Luego se trasladaron hacia el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Agraria de La Habana en frascos debidamente lavados con detergente comercial, enjuagados dos veces con agua destilada. En el laboratorio, los ápices se lavaron con detergente comercial en agitación durante cinco minutos y se enjuagaron tres veces con agua destilada.

La siembra de los explantes, cono apical, se realizó en el flujo laminar debidamente desinfectado con etanol al 70 % y se colocó una lámpara de luz ultravioleta encendida por 30 min antes de comenzar la siembra. Los conos apicales se extrajeron en el flujo laminar y se desinfectaron con etanol al 70 % durante un minuto. Posteriormente, se lavaron con suficiente agua destilada estéril. A continuación, se probaron dos variantes de desinfección con hipoclorito de sodio al 3 y 5 % durante 10 min. Para ello se utilizaron 12 conos apicales por tratamiento. Por último, se lavaron con suficiente agua destilada estéril antes de realizar la siembra.

Posterior a la desinfección, los explantes se colocaron en medio de cultivo basal ^{Murashige y Skoog (1962)}, con 30 g L^-1sacarosa,1 mg L^-1 de 6-BAP, 8 g L^-1de agar. El pH se ajustó a 5.7 con hidróxido de sodio al 0.1N y ácido clorhídrico al 0.1N antes de la esterilización, que se realizó en autoclave a 121 ºC y 1.5 kg cm^-2 de presión durante 20 min. Los explantes se establecieron en tubos de ensayo con 15 mL de medio de cultivo. La investigación se desarrolló en condiciones controladas en cámara de crecimiento con fotoperiodo de 16 h de iluminación y 8 h de oscuridad, humedad relativa de 70 ± 5 %, intensidad lumínica de 45 µmol m^-2 s^-1y temperatura de 25 ± 2 °C por un período de ocho días.

Las evaluaciones se realizaron de forma visual a los cuatro y ocho días posteriores a la siembra. Se observaron las variables número de explantes brotados, número de explantes no brotados, número de explantes necrosados, número de explantes contaminados, número de explantes contaminados con hongos y número de explantes contaminados con bacterias.

Se empleó un diseño completamente aleatorizado, con 12 repeticiones por tratamiento. Para el procesamiento de los datos se realizó análisis de comparación de proporciones (Chi-cuadrado) mediante el paquete estadístico ComparPro 1.0 (^{Font et al. 2007}).

A los cuatro días de sembrados los explantes, no hubo diferencias (p > 0.05) entre los tratamientos con hipoclorito de sodio al 3 y 5 % (tabla 1), para las variables número de explantes necrosados (figura 1a y 1b), número de explantes brotados y número de explantes no brotados. A los cuatro días no se observó contaminación por hongos ni bacterias en los dos tratamientos estudiados (figura 1c).

Tabla 1 Análisis de variables a los cuatro días 

Tratos Variables	Hipoclorito de sodio 3 %		Hipoclorito de sodio 5 %		Total		SE (±) Signif.
	No.	%	No.	%	No.	%
Número de brotados explantes	5	35.71	9	64.29	14	100	13.36 p = 0.2850
Número de explantes no germinados	7	70.00	3	30.00	10	100	15.81 p = 0.2059
Número de necróticos explantes	2	40.00	3	60.00	5	100	15.81 p = 0.6547

Figura 1a Explante necrótico con dosis de hipoclorito de sodio al 5 % a los cuatro días. Figura 1b. Explante necrótico con dosis de hipoclorito de sodio al 3 % a los cuatro días. Figura 1c. Vista de los explantes brotados a los cuatro días, en ambas concentraciones de hipoclorito de sodio y sin contaminación en el medio de cultivo. 

A los ocho días tampoco hubo diferencias (p > 0,05) entre los tratamientos con hipoclorito de sodio al 3 y 5 % (tabla 2), para las variables número de explantes brotados, número de explantes no brotados, número de explantes necrosados, número de explantes contaminados y número de explantes contaminados por bacterias (figuras 2a, 2b y 2c). En esta observación no se halló presencia de contaminación por hongos.

Tabla 2 Análisis de variables a los ocho días 

Tratos Variables	Hipoclorito de sodio 3 %		Hipoclorito de sodio al 5 %		Total		SE (±) Signif.
	No.	%	No.	%	No.	%
Número de explantes germinados	6	40.00	9	60.00	15	100	12.91 p = 0.4386
Número de explantes no germinados	6	66.67	3	33.33	9	100	16.67 p = 0.3127
Número de explantes necróticos	3	50.00	3	50.00	6	100	15.81 p = 0.9999
Número de explantes contaminados	7	58.33	5	41.67	12	100	14.43 p = 0.5637
Número de explantes contaminado por bacterias	5	50.00	5	50.00	10	100	15.81 p = 0.9999

Figura 2a Explante desinfectado con hipoclorito de sodio al 5 %, brotado y contaminado por bacterias a los ocho días. Figura 2b. Explante desinfectado con hipoclorito de sodio al 3 %, necrótico y contaminado por bacterias a los ocho días. Figura 2c. Vista de los explantes brotados a los ocho días en ambas concentraciones de hipoclorito de sodio. 

La desinfección superficial de los explantes vegetales es mediante compuestos químicos. No es posible recomendar un procedimiento general que garantice eliminar los microorganismos con el menor daño posible al explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo único de etanol o de hipoclorito de sodio. El método más popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70 %) durante 20-60 segundos, seguido de hipoclorito de sodio 1-3 %. A continuación, se debe lavar con suficiente agua y detergente de tres a 30 min, en dependencia de la naturaleza del explante. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estéril (^{Mroginski et al. 2010}).

En trabajos de mejora genética por técnicas de cultivo de tejidos in vitro, ^{Herrera et al. (2003)} utilizaron hipoclorito de sodio al 10 % durante 10 min para la desinfección de conos apicales de Cuba CT-115. En la bibliografía consultada, es escasa la evidencia de estudios referidos a la desinfección de explantes de C. purpureus vc. Cuba CT-115 para su establecimiento in vitro. Sin embargo, en caña de azúcar (Saccharum officinarum) se informan diversos trabajos sobre este aspecto.

Se refieren resultados similares a los del presente estudio con tratamiento de NaClO al 5 % durante 15 min en meristemos apicales de S. officinarum, variedad CCSP 89-43, que mostró escaso porcentaje de contaminación (^{Betancourt Guerrero 2017}). Este efecto se pudo deber a la acción del hipoclorito de sodio en los microorganismos, ya que actúa en la inhibición de las reacciones enzimáticas y desnaturalización de las proteínas (^{Sánchez y Sáenz 2005}).

Los resultados de este trabajo difieren de los valores elevados de necrosis que se informaron al desinfectar explantes de la sección foliar apical y yemas axilares de cuatro variedades de S. officinarum, con NaClO al 5 y 7 % (^{Araya Contreras 2006}). De igual forma, en la desinfección de explantes foliares de S. officinarum, variedad CP 72-2086, se obtuvo alto porcentaje de necrosis en los tejidos vegetales con concentraciones de 10 % de hipoclorito de sodio durante 25 min (^{Martínez Vega 2005}).

Resultados similares a los anteriores, al utilizar concentraciones altas de hipoclorito de sodio 20 y 30 % y dos tiempos de inmersión (15 y 20 min), para desinfectar conos apicales de las variedades de caña de azúcar ITV 92-1424, Laica 82-2220 y Q28-2. En este estudio se reportan buenos resultados de supervivencia y asepsia al aplicar 20 % de cloro comercial por 20 min, mientras que la dosis de 30 % de NaClO fue efectiva para controlar la contaminación, aunque ennegreció los explantes (^{Rangel-Estrada et al. 2016}).

Según plantea ^{Nikoloff (2015)}, el oscurecimiento, la inhibición del crecimiento, la necrosis y la muerte del explante, pueden estar asociadas al estrés oxidativo derivado del uso de agentes desinfectantes. Los niveles de oxidación del explante se relacionan con el aumento en la concentración y el tiempo de exposición del explante al desinfectante (^{Lapiz-Culqui et al. 2021}), lo que evidencia el efecto tóxico de NaClO en los tejidos vegetales (^{Causil et al. 2017}). Se podría indicar que las diferentes respuestas de los explantes al uso del hipoclorito de sodio corresponden con el nivel de tolerancia propia de cada especie de planta.

La diferencia entre los resultados de estudios anteriores y los que se obtuvieron en la desinfección de explantes de C. purpureus vc. Cuba CT-115 se pueden relacionar con la manipulación del material vegetal, ya que es una de las fuentes más comunes de contaminación. Además, se confirma que la desinfección superficial del explante está condicionada por factores como el tipo, concentración y tiempo de exposición a los agentes desinfectantes, pero también por la procedencia del explante (^{Ticona y Triguero 2020}).

Se concluye que los indicadores estudiados para la desinfección de conos apicales de Cuba CT-115 con concentraciones de 3 y 5 % de hipoclorito de sodio no presentaron diferencias. Por tanto, se recomienda realizar la desinfección con hipoclorito de sodio al 3 %, lo que permite un ahorro de esta sustancia durante el procedimiento. Se recomienda realizar estudios con otras concentraciones de hipoclorito de sodio y diferentes tiempos de inmersión en la etapa de establecimiento in vitro de este cultivo.

Agradecimientos

Se agradece a los investigadores del Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Agraria de La Habana por su apoyo en la realización del presente estudio.

REFERENCIAS

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Recibido: 20 de Diciembre de 2022; Aprobado: 15 de Febrero de 2023

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