Ciencia Animal

Actividad antimicrobiana y antioxidante in vitro de hojas y extracto acuoso de cuatro plantas medicinales con potencial fitobiótico en la producción animal

0000-0002-3940-1026R. Aroche^{1  2}  , 0000-0002-8799-3572X. Jiang²  , 0000-0003-2641-1767R. Rodríguez³  , 0000-0003-2047-9840X. Li²  , 0000-0001-9759-1078Carolina Avellaneda⁴  , 0000-0003-2167-4904Y. Martínez^{4  *} 

¹Departamento de Zootecnia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Granma, Cuba.

²Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.

³Centro de Estudio de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Granma, Cuba.

⁴Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria, Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano, Honduras.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue evaluar las propiedades antimicrobianas y antioxidantes in vitro de hojas y extractos acuosos de cuatro plantas medicinales (Anacardium occidentale, Psidium guajava, Morinda citrifolia y Moringa oleifera). En el estudio se utilizaron seis cepas bacterianas y se determinó la concentración mínima bactericida (CMB) para las hojas, mientras que para los extractos acuosos se evaluó la concentración mínima inhibidora (CMI) y la CMB. Además, la actividad antioxidante in vitro se midió utilizando 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo y los metabolitos secundarios se identificaron y cuantificaron mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución. Los resultados mostraron que A. occidentale y P. guajava tuvieron la mayor actividad antimicrobiana contra todas las cepas bacterianas, y A. occidentale y P. guajava también demostraron la mayor actividad antioxidante. A. occidentale tenía una alta concentración de quercetina 3-O-glucósido-7-O-ramnósido, kaempeferol-7-O-glucósido, quercetina, ácido cafeico y ácido cinámico en sus hojas. En conclusión, A. occidentale y P. guajava son las plantas más efectivas en términos de actividad antimicrobiana y antioxidante in vitro en sus hojas y extractos acuosos, mientras que Moringa oleifera tiene buena actividad antioxidante pero ningún efecto bactericida, y Morinda citrifolia no tiene efecto antimicrobiano o efecto antioxidante.

Palabras-clave: actividad antimicrobiana; bactericida; polvo fino; hojas; metabolito secundario; antioxidante

Actualmente, existe un interés creciente en investigar alternativas naturales a los antibióticos subterapéuticos, particularmente plantas medicinales que posean compuestos fitoquímicos beneficiosos y exhiban propiedades antimicrobianas, antiinflamatorias y antioxidantes (^{Oanh et al., 2023}). Diversos estudios han demostrado que los compuestos fitógenicos pueden mejorar la expresión genética de los animales de granja en diferentes esquemas de producción sin el uso de antibióticos preventivos en su dieta (^{Skoufos et al. 2020}). Además, ^{Karásková et al. (2015)} informaron que los fitobióticos pueden reducir la rancidez oxidativa en alimentos/piensos, promover la productividad de forma natural y usarse como coadyuvante en el tratamiento de diversas enfermedades de los animales. En este contexto, plantas medicinales como A. occidentale, P. guajava, M. citrifolia y M. oleifera se han empleado con frecuencia en todo el mundo para aliviar o eliminar diferentes síntomas de enfermedades en humanos y animales (^{Aroche et al. 2018}).

Se ha descubierto que bajas concentraciones de A. occidentale (familia Anacardiaceae) aumentan la producción y calidad de los huevos y disminuyen el síndrome diarreico porcino (^{Martínez et al. 2013} y ^{Aroche et al. 2017}). En producción animal, P. guajava promueve la producción de huevos, el grosor de la cáscara de los huevos y reduce las heces líquidas en los cerdos después del destete (^{Ceballos-Francisco et al. 2020}). También se ha descubierto que la inclusión de M. citrifolia en las dietas animales promueve la producción de huevos y la ganancia de peso en los cerdos (^{Salazar et al. 2017} y ^{Aroche et al. 2018}). Asimismo, la M. oleifera posee actividad antiinflamatoria, antioxidante y antimicrobiana (^{Dhakad et al. 2019}) y ha sido recomendada como fuente de proteínas en dietas animales (^{Valdivié et al. 2020}).

Estas cuatro plantas han ganado un importante interés mundial en la producción animal debido a sus propiedades nutracéuticas que mejoran los indicadores productivos, la salud intestinal y la calidad del producto final (^{Ramírez et al. 2020}). A pesar de los resultados productivos de su uso nutracéutico en animales, pocas investigaciones han identificado los metabolitos secundarios responsables del posible efecto antibacteriano y antioxidante comparativo in vitro. Esta información permitiría dilucidar los beneficios medicinales reportados en animales de interés zootécnico. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad antimicrobiana y antioxidante in vitro de hojas y extractos acuosos de cuatro plantas medicinales (A. occidentale, P. guajava, M. citrifolia, y M. oleifera).

Materiales y Métodos

Material vegetal

Se recolectaron alrededor de 20 kg de hojas frescas por planta de A. occidentale, P. guajava, M. oleifera y M. citrifolia en la provincia de Granma, Cuba, durante la temporada de pocas lluvias de febrero/2019. Esta zona se caracteriza por una topografía plana y suelo pardo con carbonatos (^{Hernández et al. 2019}), autenticado por especialistas de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Granma. Las plantas tenían más de un año y sin patología alguna. Las hojas se secaron a la sombra durante cinco (A. occidentale, P. guajava y M. oleifera) y diez días (M. citrifolia), con libre circulación de aire hasta peso constante y luego se secaron en estufa (WSU 400, alemán). con recirculación de aire durante 1 hora a 60 °C. Posteriormente, las hojas se trituraron en un molino de martillos de paletas paralelas, a 1 mm de tamaño. Las muestras se almacenaron a 26 °C de temperatura ambiente, en bolsas de plástico completamente herméticas hasta su uso posterior. Se realizaron experimentos in vitro en el Feed Research Institute de la Chinese Academy of Agricultural Sciences para determinar la actividad antibacteriana y antioxidante de las hojas y sus extractos acuosos.

Preparación del polvo fino y extracto acuoso

Para obtener el polvo fino, se molieron 5 kg de hojas de planta en una máquina trituradora de granos comercial (Zhejiang Horus Industry and Trade Co., Ltd., Zhejiang, China) a través de un tamiz de malla 40 mesh (0.45 mm) (Yoston, China) y se almacenaron en bolsas completamente herméticas hasta su uso para pruebas microbiológicas. Además, se pesaron 16.67 g de las hojas de cada planta y se mezclaron con 500 mL de agua para extracción acuosa. El extracto acuoso se obtuvo por el método de sonicación, con un extractor ultrasónico (modelo SY-1000E, China) durante 50 minutos a 50 °C, se dejó reposar durante 1 hora y se filtró a través de papel filtro Whatman No. 1. Posteriormente se condensó a través de un rotavapor (modelo RE-2000, China), bajo presión reducida a 45 °C a 60 rpm para alcanzar una cantidad menor a 10 mL de extracto (^{Fieser 2004}). El extracto se congeló a -80 °C durante al menos 4 horas y finalmente se secó en una máquina liofilizadora (modelo LGJ-18, China).

Concentración mínima bactericida de polvo fino

La CMB del polvo fino de las hojas de las cuatro plantas se determinó por el método de dilución (^{Rios et al. 1988}) por triplicado. Para ello se preparó cultivo bacteriano en medio de cultivo a una concentración aproximada de 15 x 10⁷ UFC/mL frente a la densidad óptica teórica (550 nm de absorbancia) que define el nivel de 0.5 en la escala turbidimétrica de McFarland, y se inoculó e incubó durante 12 horas. Después se prepararon placas Petri de 90 mm de diámetro con Agar Mueller-Hinton (MHA) a diferentes concentraciones del polvo fino. La concentración de las suspensiones bacterianas se ajustó a 0.5 (densidad óptica) utilizando un espectrofotómetro. Se inoculó cada cultivo bacteriano de 100 µL, el cual consistió en cepas de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) K88+ y ATCC 1515, Staphylococcus aureus ATCC 43300 y ATCC 25923, Salmonella enteritidis: ATCC 3377 y Salmonella typhimurium ATCC 14028. En el primer período, se probaron concentraciones de 5, 15 y 30 mg/mL de polvo fino en el medio de cultivo para identificar la concentración mínima de cada planta en ese rango para cada bacteria analizada. Luego, se utilizaron concentraciones menores a 5.0 mg/mL (0.125, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 mg/mL) para polvo fino de hojas de A. occidentale contra las seis cepas de bacterias y las mismas concentraciones de polvo fino de hojas de P. guajava contra E. coli ATCC 1515, S. aureus ATCC 25923, S. enteritidis ATCC 3377 y S. typhimurium ATCC 14028; concentraciones de 5,0 a 15,0 mg/mL (5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0 and 15.0 mg/mL) de polvo fino en medio de cultivo para P. guajava contra E. coli K88+ y S. aureus ATCC 43300 y para M. citrifolia contra S. aureus ATCC 43300 y 25923. Finalmente, de 15 a 30 mg/mL de polvo fino de medio de cultivo con M. oleifera contra S. aureus ATCC 43300 (^{Rios et al. 1988}).

Concentración mínima inhibidora y mínima bactericida del extracto acuoso

Para este estudio, se utilizó el método de microdilución para CMI y el método de dilución para CMB del extracto acuoso (^{Rios et al. 1988}). Se preparó una solución madre de 13.0 mg/mL, que se utilizó para preparar diluciones seriadas de 13.0, 6.5, 3.25, 1.63, 0.81, 0.41, 0.2, 0.1, 0.05, 0.03 y 0.01 mg/mL. El inóculo de E. coli (ETEC) K88+, S. aureus ATCC 43300 y S. typhimurium ATCC 14028 se prepararon en medio de cultivo (Caldo Mueller Hinton) a una concentración de aproximadamente 15 x 10⁷ UFC/mL en comparación con la densidad óptica teórica (absorbancia de 550 nm) que define el nivel de 0.50 en la escala de McFarland. Luego, se colocaron 200 µL/pocillo de cada dilución en microplacas de 96 pocillos y se inocularon 2 µL de cada cultivo bacteriano por triplicado, se incubaron durante 12 horas a 37 °C para determinar su absorbancia en un lector de placas (ELISA, BIO-TEK, Synergy HT). La determinación del CMB se realizó por triplicado, 100 µL de sobrenadante de aquellos pocillos donde se inhibió el crecimiento bacteriano y se sembraron con una espátula triangular de vidrio estéril en placas de Petri de 90 mm de diámetro con Mueller-Hinton Agar (MHA), y se incubaron durante 12 horas a 37 °C.

Actividad antioxidante del extracto acuoso

Para este estudio, se evaluaron hojas de las cuatro plantas con 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH-) (^{Shen et al. 2010}), donde se preparó una solución de 0.1 mM de DPPH- en metanol. Posteriormente se tomó 1 mL de esta solución y se mezcló vigorosamente en un vortex con 3 mL de las diferentes concentraciones (10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 1,156, 0.078, 0.039, 0.020 y 0.010 mg/mL) del extracto, y 200 µL de cada concentración se colocaron en una microplaca de 96 pocillos. Las soluciones se dejaron reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min y luego se midió la absorbancia a 517 nm con el uso de un lector de placas (marca ELISA, BIO-TEK, Synergy HT). Se utilizó como referencia el hidroxitolueno butilado (BHT). Los valores bajos de absorbancia indican una alta capacidad eliminadora de radicales libres, o una alta capacidad antioxidante, que se calculó utilizando la siguiente fórmula: Efecto antioxidante del DPPH (% de inhibición) = [(A0-A1) /A0 * 100], donde A0 es la absorbancia de la reacción control, y A1 es la absorbancia en presencia de los extractos y la referencia. Luego, se ploteó el % de inhibición frente a la concentración y la curva de calibración para BHT fue: y = 139.34x + 10.42, r² = 0.8672. Todas las muestras se evaluaron por triplicado y los resultados se promediaron y se mostraron como valores de IC₅₀ (mg/mL).

Identificación y cuantificación de los principales compuestos de las hojas de las cuatro plantas. Método de pretratamiento

Las hojas de muestra (alrededor de 40 mg) de A. occidentale, P. guajava, M. citrifolia y M. oleifera se agregaron a 4 mL de extractante consistente en 0.8 mL de solución tampón EDTA + 3.2 mL de metanol y se agitaron bajo ultrasonido durante 30 min. Luego se centrifugó durante 5 min para tomar el sobrenadante y la membrana. La solución tampón EDTA estuvo compuesta por 7.10 g de fosfato monosódico anhidro, 1.95 g de EDTA disódico y 8.40 g de ácido cítrico, disueltos en 650 mL de agua.

Método cromatográfico. Condiciones de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-MS/MS.

El análisis cromatográfico se realizó en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Waters Acquity, utilizando una columna Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (3.0 x 150 mm, 1.8 μm). Fase móvil A: agua (0.1% de ácido fórmico y 0.2 mmol/L de acetato de amonio), fase móvil B: metanol (0.1% de ácido fórmico y 0.2 mmol/L de acetato de amonio). Gradiente de separación (0-1 min: 10 % B, 1-2 min: 10 % B-60 % B, 2-7.5 min: 60 % B-90 % B, 7.5-8.0 min: 90 % B-100 % B, 8.0-8.1 min: 10 % B). El volumen de inyección fue 2 μL y la velocidad de flujo fue de 0.30 mL/min (^{Fang et al. 2007}). La MS se realizó en un Sciex Triple Quad 4500 MS/MS y la ionización por electropulverización acoplada a un modelo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Los valores optimizados resultantes fueron los siguientes: temperatura de la fuente 450 °C, voltaje de pulverización de iones 4500 V, gas de colisión: 9 psi, gas de cortina 10 psi, gas de fuente de iones (GS 1) 18 psi y gas de fuente de iones (GS 2) 0 psi. El potencial de desagrupación (DP) y la energía de colisión (CE) correspondientes se presentan en la tabla 1.

Table 1 MRM conditions, retention time parameters for the analytes. 

Number	CAS#	Compound	Ret Time (min)	Precursor Ion (m/z)	Product Ion (m/z)	DP (V)	CE (V)	Polarity
1	18016-58-5	Quercetin 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside	4.66	611.0	303.0	187	30	Positive
					129.0	192	35
2	28338-59-2	Cyanidin 3-O-rutinoside	4.08	594.9	286.7	111	90	Positive
					449.3	128	30
3	520-27-4	3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavone 7-rutinoside	4.80	607.2	339.0	32	36	Negative
					299.0	153	38
4	70831-56-0	Cichoric acid	3.97	473.1	314.9	79	40	Negative
					200.9	44	53
5	16290-07-6	Kaempferol-7-O-glucoside	4.51	447.0	284.0	233	51	Negative
					151.0	240	63
6	522-12-3	Quercitrin	4.98	447.0	271.0	273	56	Negative
					300.0	273	37
7	331-39-5	Caffeic acid	4.17	181.0	89.0	72	42	Positive
					117.0	68	30
8	104-46-1	cis-Anethol	6.10	147.1	77.0	54	28	Negative
					62.1	17	42
9	140-67-0	4-Allylanisole	6.10	146.8	77.1	68	30	Negative
					116.9	54	45
10	87-66-1	Pyrogallol	2.34	127.0	81.0	53	27	Positive
					53.0	48	33
11	621-82-9	Cinnamic Acid	6.07	146.8	77.0	66	28	Negative
					103.0	71	16

Análisis estadístico

Todos los análisis se realizan por triplicado. Se realizó estadística descriptiva para la cuantificación de metabolitos secundarios. Además, para la prueba de antioxidantes, los datos se procesaron mediante ANOVA de clasificación simple en un diseño completamente al azar. Anteriormente, la normalidad de los datos se verificó mediante la prueba de ^{Kolmogorov (1941)} y ^{Smirnov (1948)}, y la prueba de ^{Bartlett (1939)} se utilizó para la uniformidad de la varianza. En los casos necesarios, se separaron las medias utilizando la prueba de ^{Duncan (1955)} al nivel de significancia de P<0.05. Todos los análisis se realizaron de acuerdo con IBM^® SPSS^® Statistics, versión 22.0 (2013) (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.).

Resultados y Discusión

Principales compuestos de las hojas de A. occidentale y P. guajava. El contenido de compuestos principales de las hojas de A. occidentale y P. guajava se muestra en la tabla 2, donde se observa la mayor concentración de quercetina 3-O-glucósido-7-O-ramnósido, kaempferol-7-O-glucósido, quercetina, ácido cafeico y ácido cinámico de hojas de A. occidentale en comparación con P. guajava.

Table 2 Quantification of majority compounds from leaves of A. occidentale and P. guajava 

Compounds	A. occidentale (µg/g)	P. guajava (µg/g)
Quercetin 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside	0.54±0.03	0.12±0.01
Chicoric acid	0.62±0.04	1.3±0.08
Kaempeferol-7-O-glucoside	1.95±0.12	<0
Quercetin	10.25±0.9	<0
Caffeic acid	0.22±0.01	<0
Cinnamic acid	0.25±0.02	0.07±0.00

Data expressed as mean (n=3) ± standard deviation.

Los polifenoles son los principales metabolitos secundarios distribuidos en todas las plantas, con mayor énfasis en los isoflavonoides, antocianinas, flavonoles y flavonas en A. occidentale y P. guajava. La cuantificación de los principales metabolitos secundarios de estas dos plantas, como la quercetina 3-O-glucósido-7-O-ramnósido, el ácido chicórico, el kaempeferol-7-O-glucósido, el ácido cafeico y el ácido cinámico, podría respaldar los efectos antibacterianos y antioxidantes que se encontraron en este estudio. Teóricamente, autores como ^{Roepke y Bozzo (2013)} mencionaron que el 3-O-glucósido-7-O-ramnósido es un metabolito secundario poco común en las plantas con propiedades antioxidantes y antimicrobianas comprobadas contra E. coli. Además, ^{Mukhtar et al. (2004)} demostraron que los ácidos cafeico y chicórico tienen potencial como agentes antidiabéticos, y encontraron una reducción en la concentración de glucosa en ratones de laboratorio cuando utilizaron extractos de A. occidentale y P. guajava, respectivamente. Además, se identificó y cuantificó el flavonoide kaempferol-7-O-glucósido en las hojas de A. occidentale, el cual es un fitoquímico ampliamente estudiado por sus propiedades antimicrobianas (^{Singh et al. 2011}).

Además, el ácido cinámico es un ácido orgánico que se encuentra naturalmente en muchas plantas medicinales y se cuantifica en A. occidentale y en P. guajava. Este ácido tiene baja toxicidad y un amplio espectro de actividades funcionales, como propiedades antibacterianas, antivirales y antifúngicas (^{Sova 2012}), lo que respalda el efecto antimicrobiano encontrado en las hojas de la planta en estudio (tablas 3 y 4). Aunque se han encontrado resultados positivos para los metabolitos secundarios cuantificados en las hojas de la planta en estudio (principalmente A. occidentale), no son concluyentes en animales de granja. Así, estos resultados podrían contribuir a comprender cómo las plantas medicinales (principalmente hojas de A. occidentale y P. guajava y sus extractos), por su función antimicrobiana y antioxidante, pueden sustituir completamente a los antibióticos promotores del crecimiento en animales de granja, como demuestran ^{Martínez et al. (2013)}, ^{Más et al. (2016)}, ^{Aroche et al. (2017)}, ^{Salazar et al. (2017)} y ^{Aroche et al. (2018)} en aves y cerdos.

Actividad antimicrobiana de polvo de hojas y extracto acuoso

La CMB del polvo de hojas de las plantas contra seis cepas de bacterias patógenas se muestra en la tabla 3. El polvo de hojas de A. occidentale mostró el mayor efecto bactericida en el estudio, principalmente contra S. aureus ATCC 25923 y 43300 y S. typhimurium ATCC 14028. Sin embargo, contra E. coli K88+ se necesitó una concentración de 4 mg/mL para inhibir el crecimiento. Asimismo, el polvo de hoja de P. guajava mostró efecto bactericida al reducir el crecimiento de bacterias Gram negativas y Gram positivas, siendo la concentración más baja (1.0 mg/mL) para S. aureus ATCC 43300 y la más alta (11 mg /mL) para E. coli K88+. Además, las hojas de M. citrifolia y M. oleifera sólo mostraron actividad bactericida frente a las cepas de S. aureus ATCC 43300 y ATCC 25923 aunque con dosis superiores (8 y 16 mg/mL, respectivamente) que los efectos inhibidores de las hojas de A. occidentale y P. guajava

Table 3 MBC of the leaf powder of four plants against six bacterial strains (mg/mL) 

Bacteria	AO ^1	PG ^2	MC ^3	MO ^4
E. coli K88+	4.0	11.0	NI ^5	NI
E. coli ATCC 1515	4.0	5.0	NI	NI
S. aureus ATCC 43300	1.0	1.0	8.0	16.0
S. aureus ATCC 25923	0.5	5.0	15.0	NI
S. enteritidis ATCC 3377	4.0	4.0	NI	NI
S. typhimurium ATCC 14028	2.0	2.0	NI	NI

¹ A. occidentale. ² P. guajava. ³ M. citrifolia. ⁴ M. oleifera. ⁵ No inhibition. Data were obtained by triplicated (n = 3).

La CMI y CMB del extracto acuoso de las hojas de las cuatro plantas esudiadas se muestran en la tabla 4. Al igual que el polvo fino de las hojas, los extractos acuosos de A. occidentale y P. guajava tuvieron la mayor actividad bactericida. Cabe señalar que la CMI y la CMB para inhibir el crecimiento de E. coli K88+ es la misma en ambas plantas medicinales (6.5 mg/mL).

Table 4 MIC and MBC of the aqueous extract of the leaves of the plants (mg/mL). 

Extracts	E. coli K88+		S. aureus 43300		S. typhimurium 14028
	MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
AO^1	6.5	6.5	0.81	0.81	3.25	3.25
PG^2	6.5	6.5	0.81	1.63	6.5	6.5
MC^3	NI^5	NI	6.5	NI	NI	NI
MO^4	NI	NI	NI	NI	NI	NI

¹ Anacardium occidentale. ² Psidium guajava. ³ Morinda citrifolia. ⁴ Moringa oleifera. ⁵ No Inhibition. Data were obtained by triplicated (n = 3).

Asimismo, es necesaria una mayor concentración del extracto acuoso de P. guajava (en comparación con el extracto acuoso de hojas de A. occidentale) para inhibir y eliminar la S. typhimurium ATCC 14028. Algo similar ocurrió para el efecto bactericida de este producto contra S. aureus ATCC 43300. El extracto acuoso de M. citrifolia solo inhibió el crecimiento de S. aureus ATCC 43300 con dosis de 6.5 mg/mL, pero no mostró actividad bactericida en las concentraciones estudiadas (concentración máxima de 13 mg/mL). Además, el extracto de M. oleifera no mostró actividad inhibidora ni bactericida.

A. occidentale es conocida por sus propiedades antibacterianas, principalmente en sus flores, corteza y hojas (^{da Silva et al. 2016}). Además, se ha utilizado en la prevención y tratamiento de enfermedades bucales (siendo el primer contacto del sistema digestivo con los alimentos) al inhibir las bacterias de esta cavidad y por tanto la formación de biopelícula (^{Anand et al. 2015}). De igual manera, ^{Melo Menezes et al. (2014)} encontraron que el extracto crudo y los taninos aislados de A. occidentale tienen actividad inhibidora contra los microorganismos que forman parte de la composición de la biopelícula oral. Por tanto, plantearon la hipótesis de que los mecanismos de acción antimicrobiana de los taninos, la inhibición enzimática, la modificación del metabolismo celular por su acción en las membranas y la unión con iones metálicos, disminuyen el acceso de los microorganismos que se encuentran fuera de la biopelícula al metabolismo. Los resultados del presente estudio mostraron una potente actividad antimicrobiana y antioxidante, la cual se relaciona con el alto contenido de polifenoles y flavonoides en sus hojas, además de otros compuestos medicinales (^{Siracusa et al. 2020}).

^{Sousa et al. (2017)} observaron la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro en extracto de hojas de A. occidentale cuando se usa en células de macrófagos RAW 264.7 debido al menor daño oxidativo de estas células y a la disminución de los indicadores inflamatorios inducidos por la estimulación de lipopolisacáridos. Además, ^{Brito et al. (2020)}, señalaron que el hexósido de pentagaloil, precursor de la formación de taninos hidrolizados como elagitaninos y galotaninos, se encontró en todos los órganos de A. occidentale. Estos compuestos químicos son responsables de varias propiedades funcionales, con mayor énfasis en la actividad antimicrobiana. Así, el presente estudio demostró que A. occidentale fue la planta con mayor capacidad antimicrobiana y antioxidante comparada con las otras tres plantas estudiadas.

Respecto al efecto de A. occidentale en la producción animal, específicamente en la producción avícola y porcina, ^{Aroche et al. (2017)} encontraron que la suplementación dietética con 1.0 % de un polvo mixto elaborado con 40 % de polvo de hojas de A. occidentale aumentó el comportamiento del crecimiento y disminuyó la incidencia de diarrea en lechones destetados. Además, ^{Más et al. (2016)} demostraron que la inclusión en la dieta de bajas concentraciones de polvo de hojas de A. occidentale y P. guajava promovió el crecimiento y redujo la deshidratación en cerdos, antes y después del destete. En este sentido, ^{Aroche et al. (2018)} mostraron resultados positivos en la eficiencia alimenticia y la producción de IgG cuando agregaron 0.5 % de una mezcla de plantas que representa el 60 % de A. occidentale en dietas para pollos de engorde.

P. guajava también ha mostrado fuerte actividad bactericida en sus hojas y extracto acuoso, ya que requiere una pequeña cantidad para eliminar bacterias como E. coli, S. aureus y Salmonella. De manera similar, ^{Salihu Abdallah et al. (2019)} comprobaron que los extractos acuoso y metanólico de hojas de P. guajava tienen actividad antimicrobiana contra S. aureus y S. typhi. El extracto acuoso fue efectivo con CMI de 12.5 mg/mL para ambas bacterias y CMB entre 25 y 50 mg/mL para S. aureus y S. typhimurium, respectivamente. En este estudio, las concentraciones de extracto acuoso fueron necesarias para obtener la CMI y CMB contra estas bacterias, y fueron inferiores a aquellas, lo que puede deberse a la variedad de planta utilizada, el origen, los métodos de extracción, entre otros factores. Además, ^{Chero-Nepo y Ruiz-Barrueto (2016)} determinaron que el extracto alcohólico de P. guajava inhibe el crecimiento de Streptococcus mutans debido a su poder bactericida.

Actividad antioxidante del extracto acuoso

En la tabla 5 se muestra la IC₅₀ del extracto acuoso de las hojas de las cuatro plantas. La A. occidentale tuvo mayor actividad atrapadora de radicales libres en comparación con las otras tres plantas, ya que refleja la menor IC₅₀, siendo incluso menor (P<0.001) que el control positivo BHT. Además, P. guajava no mostró (P>0.05) diferencias estadísticas con A. occidentale y BHT. Sin embargo, M. oleifera y M. citrifolia tuvieron los resultados más bajos en actividad antioxidante, ya que requieren la concentración más alta para inhibir la reacción DPPH-.

Table 5 IC₅₀ of the aqueous extract of the leaves of the four plants 

	AO^1	PG^2	MC^3	MO^4	BTH	SEM±	P-value
IC50 (mg/mL)	0.028^a	0.069^ab	6.269^d	0.603^c	0.093^b	0.65	<0.001

¹ A. occidentale. ² P. guajava. ³ M. citrifolia. ⁴ M. oleifera. IC₅₀: Extract concentration required to inhibit the DPPH− reaction by 50 %. Data are mean (n = 3). Values followed by different letters within a row are significantly different (P<0.05) according to the ^{Duncan (1955)}. BHT used as a positive control.

En cuanto a la actividad antioxidante, ^{Flores et al. (2015)} identificaron la composición química de siete cultivares de P. guajava y encontraron un alto contenido de flavonoides, además de antocianinas, proantocianinas, triterpenos y otros compuestos. Asimismo, ^{Feng et al. (2015)} y ^{Flores et al. (2015)} demostraron que existe una alta correlación entre el contenido de flavonoides y la capacidad antioxidante de la planta, lo que concuerda con los hallazgos del presente estudio, donde P. guajava fue la segunda planta en mostrar un alto poder antioxidante.

Por otro lado, M. oleifera es una planta multipropósito con múltiples beneficios nutricionales, pero también se ha estudiado por sus efectos antimicrobianos y antioxidantes, ya que su uso en la nutrición humana y animal es cada vez más popular (^{Wang et al. 2018}). De la misma manera, la M. citrifolia tiene innumerables beneficios para la salud, sin embargo, cuando se comparan estas dos plantas con A. occidentale y P. guajava, pueden quedar en desventaja debido al menor contenido de metabolitos secundarios responsables de la actividad antes mencionada. Esta investigación demostró la marcada diferencia en el efecto antimicrobiano y antioxidante de las hojas y del extracto acuoso de A. occidentale y P. guajava en comparación con M. citrifolia y M. oleifera.

Sin embargo, en el caso de M. oleifera, investigadores como ^{Siddhuraju y Becker (2003)}, determinaron que esta planta presenta un alto poder antioxidante en sus extractos etanólico y metanólico, lo que se relacionó con abundante contenido de flavonoides, especialmente quercetina y kaempferol. ^{Shih et al. (2011)} encontraron alta actividad antioxidante en el extracto etanólico de varias partes de esta planta, donde las hojas mostraron la mayor actividad, con un IC₅₀ de 0.287 mg/mL, menor al encontrado en este estudio (0.603 mg/mL). Esta diferencia podría deberse a la diferencia en el método de extracción (acuoso) utilizado en este estudio. En relación con la producción animal, autores como ^{Zhang et al. (2018)} encontraron efectos positivos de la M. oleifera en el rendimiento de cerdos de engorde, con un efecto marcado debido al aumento de la actividad de la enzima superóxido dismutasa y la disminución de la concreción de malondialdehído sérico.

M. citrifolia sólo inhibió el crecimiento de cepas de estafilococos, en ambas formas, como polvo fino y como extracto acuoso, sin embargo, no mostró ningún efecto antimicrobiano con las otras cepas bacterianas. Estos resultados concuerdan con ^{Almeida et al. (2019)}, quienes informaron sobre varios estudios que investigan las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de M. citrifolia a partir de sus compuestos químicos en las partes de la planta. Además, ^{Pandiselvi et al. (2019)}, encontraron actividad antibacteriana, específicamente con Staphylococcus aureus. La diferencia en términos del menor efecto antimicrobiano en este estudio podría deberse al uso de extracto metanólico. La actividad antioxidante de las hojas de M. citrifolia fue la más baja de las cuatro plantas. Se ha publicado muy poca literatura sobre la capacidad antioxidante de las hojas de esta planta. Además, existen varias investigaciones que demuestran esta calidad en sus frutos (^{Senthilkumar et al. 2016} y ^{Thorat et al. 2017}). ^{Sunder et al. (2016)} demostraron los múltiples usos de M. citrifolia en ganado y aves de corral como promotor natural del crecimiento debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antioxidantes e hipocolesterolémicas.

Conclusiones

Se concluye que A. occidentale y P. guajava son las plantas con mayor actividad antimicrobiana y antioxidante en sus hojas y extracto acuoso. M. oleifera tiene buena actividad antioxidante in vitro, aunque no tiene alto poder antimicrobiano, y M. citrifolia es la planta que menor actividad antioxidante tiene en su extracto acuoso.

Acknowledgments

We would like to thank Dr. Yan Zhao from Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products of CAAS for the assistance of analysis of major compounds from leaves.

References

Almeida, É.S., Oliveira, D. de & Hotza, D. 2019. "Properties and Applications of Morinda citrifolia (Noni): A Review". Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18(4): 883-909, ISSN: 1541-4337. http://doi.org/10.1111/1541-4337.12456.

Anand, G., Ravinanthan, M., Basaviah, R. & Shetty, V. 2015. "In vitro antimicrobial and cytotoxic effects of Anacardium occidentale and Mangifera indica in oral care". Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 7(1): 69-74, ISSN: 0976-4879. http://doi.org/10.4103/0975-7406.148780.

Aroche, R., Martínez, Y., Ayala, L., Rodríguez, R. & Rodríguez, Y. 2017. "Comportamiento productivo e incidencia de diarrea en cerdos posdestete suplementados con polvo mixto de hojas de plantas con propiedades nutracéuticas". Revista Ciencia y Agricultura, 14(2): 19-26, ISSN: 0122-8420. http://doi.org/10.19053/01228420.v14.n2.2017.7145.

Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C. M., Más, D. & Lan, S. 2018. "Dietary Inclusion of a Mixed Powder of Medicinal Plant Leaves Enhances the Feed Efficiency and Immune Function in Broiler Chickens”. Journal of Chemistry, 2018: 1-6, ISSN: 2090-9063. http://doi.org/10.1155/2018/4073068.

Bartlett, M. S. 1939. "A note of significance in multivariate analysis". Proceedings, Cambridge Philosophical Society, 35: 180-185.

Brito, E., Mendes, L., Garruti, D., Zocolo, G. & Lima, M. 2020. "Structure Astringency Relationship of Anacardic Acids from Cashew Apple (Anacardium occidentale L.)". ChemRxiv, ISSN: 2573-2293. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12336704.

Ceballos-Francisco, D., Castillo, Y., De La Rosa, F., Vásquez, W., Reyes-Santiago, R., Cuello, A., Cuesta, A. & Esteban, M. Á. 2020. "Bactericidal effect on skin mucosa of dietary guava (Psidium guajava L.) leaves in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus)". Journal of Ethnopharmacology, 259: 112838, ISSN: 0378-8741. http://doi.org/10.1016/j.jep.2020.112838.

Chero-Nepo, D.A. & Ruiz-Barrueto, M.Á. 2016. "Efecto antibacteriano in vitro del extracto alcohólico de Psidium guajava (guayaba) y Medicago sativa (alfalfa) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175". Revista de Salud & Vida Sipanense, 3(2): 6-12, ISSN: 2313-0369.

da Silva, R. A., Liberio, S. A., do Amaral, F. M. M., Fernandes do Nascimento, F. R., Brandão Torres, L. M., Monteiro Neto, V. & Meireles Guerra, R. N. 2016. "Antimicrobial and antioxidant activity of Anacardium occidentale L. flowers in comparison to bark and leaves extracts". Journal of Biosciences and Medicines, 4: 87-99, ISSN: 2327-5081. http://dx.doi.org/10.4236/jbm.2016.44012.

Dhakad, A.K., Ikram, M., Sharma, S., Khan, S., Pandey, V.V. & Singh, A. 2019. "Biological, nutritional, and therapeutic significance of Moringa oleifera Lam". Phytotherapy Research, 33(11): 2870-2903, ISSN: 1099-1573. http://doi.org/10.1002/ptr.6475.

Duncan, D. B. 1955. "Multiple range and multiple F tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 1541-0420. http://doi.org/10.2307/3001478.

Fang, F., Li, J., Pan, Q.-H. & Huang, W.-D. 2007. "Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging". Food Chemistry, 101(1): 428-433, ISSN: 0308-8146. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.12.036.

Feng, X., Wang, Z., Meng, D.-L. & Li, X. 2015. "Cytotoxic and antioxidant constituents from the leaves of Psidium guajava". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 25: 2193-2198, ISSN: 0968-0896. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.03.058.

Fieser, L. 2004. Experiments of organic chemistry. Reverté editorial, first edition, pp. 269-275.

Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A. & Kennelly, E. J. 2015. "Chemical composition and antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits". Food Chemistry, 170: 327-335, ISSN: 0308-8146.

Hernández, A., Pérez, J. M., Bosch, D. & Castro, N. 2019. "La clasificación de suelos de Cuba: énfasis en la versión de 2015". Cultivos Tropicales, 40(1): 31, ISSN: 0258-5936.

Karásková, K., Suchý, P. & Straková, E. 2015. "Current use of phytogenic feed additives in animal nutrition: a review". Czech Journal of Animal Science, 60(12): 521-530, ISSN: 1212-1819. http://doi.org/10.17221/8594-CJAS.

Kolmogorov, A. N. 1941. "On a logarithmic normal distribution law of the dimensions of particles under pulverization". Doklady Akademii Nauk Tadzhikskoi SSSR, 31(2): 99-101.

Martínez, Y., Martínez, O., Liu, G., Ren, W., Rodríguez, R., Fonseca, Y., Olmo, C., Isert, M., Aroche, R., Valdivié, M. & Nyachoti, C. M. 2013. "Effect of dietary supplementation with Anacardium occidentale on growth performance and immune and visceral organ weights in replacement laying pullets". Journal of Food, Agriculture and Environment, 11(3 & 4): 1352-1357, ISSN: 1459-0255.

Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética con polvos de hojas de guayaba (Psidium guajava) y marañón (Anacardium occidentale) en el comportamiento productivo y la incidencia de diarrea en cerdos antes y después del destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(2): 106-113, ISSN: 1026-9053.

Melo Menezes, K., Vieira Pereira, J., de Medeiros Nóbrega, D. R., Ramos de Freitas, A. F., Vieira Pereira, M. do S. & Vieira Pereira, A. 2014. "Antimicrobial and anti-adherent in vitro activity of tannins isolated from Anacardium occidentale Linn. (Cashew) on dental biofilm bacteria". Brazilian Research in Pediatric Dentistry and Integrated Clinic, 14(3): 191-198, ISSN: 1519-0501. http://dx.doi.org/10.4034/PBOCI.2014.143.03.

Mukhtar, H., Ansari, S., Ali, M., Naved, T. & Bhat, Z. 2004. "Effect of water extract of Psidium guajava leaves on alloxan-induced diabetic rats". Die Pharmazie, 59(9): 734-735, ISSN: 0031-7144.

Oanh, N. C., Thu, C. T. T., Hong, N. T., Giang, N. T. P., Hornick, J. L., & Dang, P. K. 2023. "Growth performance, meat quality, and blood characteristics of finisher crossbred pigs fed diets supplemented with different levels of green tea (Camellia sinensis) by-products". Veterinary World, 16(1), ISSN: 2231-0916. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.27-34.

Pandiselvi, P., Manohar, M., Thaila, M. & Sudha, A. 2019. Pharmacological activity of Morinda citrifolia L (Noni). In: Pharmacological benefits of natural products, First edition ed., India: JPS Scientific Publications, pp. 213-237, ISBN: 978-81-934054-2-0.

Ramírez, M. I., Dranguet, D. & Morales, J. A. 2020. "Actividad antiinflamatoria de plantas medicinales". Redel: Revista Granmense de Desarrollo Local, 16: 320-332, ISSN: 2664-3065.

Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.

Roepke, J. & Bozzo, G. 2013. "Biocatalytic Synthesis of Quercetin 3-O-Glucoside-7-O-Rhamnoside by Metabolic Engineering of Escherichia coli". Chembiochem: European journal of chemical biology, 14(18): 2418-2422, ISSN: 1439-7633. http://doi.org/10.1002/cbic.201300474.

Salazar, I., Martínez, Y., Rodríguez, R., Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920.

Salihu Abdallah, M., Nas, F. & Ali, M. 2019. "Antibacterial Activity of Psidium guajava Leaf and Stem Bark Extracts against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus and Salmonella typhi". International Journal of Research in Pharmacy and Biosciences, 6(5): 11-17, ISSN: 2394-5893.

Senthilkumar, S., Deepa, K., Suganya, T., Janakarajan, M., Muralidharan, J. & Vasanthakumar, P. 2016. "Therapeutic properties of noni (Morinda citrifolia) and its products". International Journal of Science, Environment and Technology, 5(3): 1496-1502, ISSN: 2278-3687.

Shen, Q., Zhang, B., Xu, R., Wang, Y., Ding, X. & Li, P. 2010. "Antioxidant activity in vitro of selenium-contained protein from the Se-enriched Bifodobacterium animalis 01". Anaerobe, 16: 380-386, ISSN: 1075-9964. http://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.06.006.

Shih, M.C., Chang, C.M., Kang, S.M. & Tsai, M.L. 2011. "Effect of different parts (leaf, stem and stalk) and seasons (summer and winter) on the chemical compositions and antioxidant activity of Moringa oleifera". International Journal of Molecular Sciences, 12(9): 6077-6088, ISSN: 1422-0067. http://doi.org/10.3390/ijms12096077.

Siddhuraju, P. & Becker, K. 2003. "Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agroclimatic origins of drumstick tree (Moringa oleifera Lam.) leaves". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8): 2144-2155, ISSN: 0021-8561. http://doi.org/10.1021/jf020444.

Singh, D., Sharma, S., Rani, R., Mishra, S. & Sharma, R. A. 2011. "Kaempferol-7-o-glucoside and their antimicrobial screening isolate from Cassia renigera wall". International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 3(2): 30-34, ISSN: 0975-1556.

Siracusa, R., Fusco, R., Peritore, A. F., Cordaro, M., D’Amico, R., Genovese, T., Gugliandolo, E., Crupi, R., Smeriglio, A., Mandalari, G., Cuzzocrea, S., Di Paola, R. & Impellizzeri, D. 2020. "The Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale L. Cashew Nuts in a Mouse Model of Colitis". Nutrients, 12(3): 834, ISSN: 2072-6643, http://doi.org/10.3390/nu12030834.

Skoufos, I., Bonos, E., Anastasiou, I., Tsinas, A., & Tzora, A. 2020. "Effects of phytobiotics in healthy or disease challenged animals". Feed Additives: aromatic plants and herbs in animal nutrition and health, 311-337. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814700-9.00018-2.

Smirnov, N. 1948. "Table for estimating the goodness of fit of empirical distributions". Annals of mathematical statistics, 19(2): 297-281, ISSN: 2168-8990. http://doi.10.1214/amos/1177730256.

Souza, N. C., de Oliveira, J. M., Morrone, M. da S., Albanus, R. D., Amarante, M. do S. M., Camillo, C. da S., Langassner, S. M. Z., Gelain, D. P., Moreira, J. C. F., Dalmolin, R. J. S. & Pasquali, M. A. de B. 2017. "Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale Leaf Extract". Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM, 2017: 8, ISSN: 1741-427X. http://doi.org/10.1155/2017/2787308.

Sova, M. 2012. "Antioxidant and antimicrobial activities of cinnamic acid derivatives". Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 12(8): 749-767, ISSN: 1875-5607. http://doi.org/10.2174/138955712801264792.

Sunder, J., Sujatha, T. & Kundu, A. 2016. "Effect of Morinda citrifolia in growth, production and immunomodulatory properties in livestock and poultry: a review". Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 4(3S): 249-265, ISSN: 2320-8694. http://doi.org/10.18006/2016.4(3S).249.265.

Thorat, B., Kambale, A. & Patil, K. 2017. "Noni fruit crop is a versatile medicinal plant". Journal of Medicinal Plants Studies, 5(5): 247-249, ISSN: 2320-3862.

Valdivié, M., Martínez, Y., Mesa, O., Botello, A., Betancur, C. & Velázquez, B. 2020. "Review of Moringa oleifera as forage meal (leaves plus stems) intended for the feeding of non-ruminant animals". Animal Feed Science and Technology, 260(2020): 114338, ISSN: 0377-8401. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2019.114338.

Wang, P., Chen, T., Sun, J., Xu, Q. & Zhang, Y. 2018. "Research Progress in the Application of Moringa oleifera in Animal Feed". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(7): 2488-2495, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.07.008.

Zhang, T., Zhang, B., Si, B., Zhang, N., Tu, Y., Zhou, C. & Diao, Q. 2018. "Effects of Moringa Leaf on Growth Performance, Slaughter Performance, Antioxidant Function and Meat Quality of Finishing Pigs". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(1): 255-261, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.01.031.

Recibido: 08 de Febrero de 2023; Aprobado: 29 de Mayo de 2023

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