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INTRODUCCIÓN
La proliferación de enfermedades causada por microorganismos patógenos es una preocupación generalizada, que constituye un factor de riesgo para la salud. La resistencia a los antibióticos y los antivirales es uno de los temas más importantes en salud pública a nivel mundial. La utilización de sustancias naturales en el tratamiento de diferentes enfermedades, incluidas las de etiología infecciosa, constituye en la actualidad un desafío en la medicina y se ofrece como una alternativa (Domingo, 2003).
Moringa oleifera es la especie más importante y cultivada de la familia Moringaceae y del género Moringa (Alegbeleye, 2018). Sus hojas son el principal punto de interés de esta planta, ya que las hojas secas conservan una cantidad notable de macro y micronutrientes. Es conocida mundialmente como el árbol de la vida o la planta milagrosa por sus diversos usos y aplicaciones, destacando principalmente en la medicina y nutrición. Esta planta posee innumerables propiedades nutritivas y terapéuticas de la cual se puede aprovechar todas sus partes (semillas, raíz, hojas, flores, vainas y frutos). Varios estudios demuestran las propiedades medicinales de la Moringa como antioxidante, en enfermedades respiratorias, cardiovasculares, gastrointestinales, endocrinas, en el sistema nervioso central, cáncer, en el sistema inmunológico, antiviral y como antibacteriano (Jung, 2014).
Existen reportes en la literatura de numerosas investigaciones que están encaminadas a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas a partir de fuentes naturales, mientras otras están destinadas a verificar las propiedades que se les atribuyen (Miranda y Cúellar, 2001). Teniendo en cuenta las potencialidades de Moringa oleifera, el objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la actividad antimicrobiana de diferentes extractos de hojas secas de Moringa oleifera Lam. cultivada en Cuba.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
El material vegetal correspondió a las hojas de Moringa oleifera Lam cosechadas en la finca “Futuro Lechero”, en terrenos destinados a el cultivo con fines farmacéuticos en Cuba. Posteriormente las hojas fueron lavadas con agua potable, secadas en horno solar a temperatura de 45 -50 °C y molinadas. Se almacenaron en bolsas de nylon de polietileno a temperatura ambiente, en un lugar fresco, protegido de la luz hasta su análisis.
Preparación de los extractos
A partir de las hojas secas de Moringa oleifera se prepararon extractos acuosos y etanólicos al 70% (V/V), según la metodología descrita por Miranda y Cúellar (2001). La extracción hidroalcohólica (etanol/agua) se realizó por el método de maceración a una proporción de 1/10, durante 6 días, con cambio del solvente al 3er día, a temperatura entre 25 y 28 ºC. La extracción acuosa fue preparada por maceración a una temperatura menor de 50 oC.
Cultivos celulares
Se utilizó como sustrato celular la línea celular Vero (riñón de mono verde africano) procedente de la American Type Culture Collection (ATCC), crecida en medio 199 (ICN, FLOW), suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal Inactivado (SFBI, HYCLONE) y 1 mg/ml de sulfato de neomicina (SIGMA).
Virus
Los virus empleados fueron: cepa de referencia 8 WC del virus Herpes simple tipo 1 (HSV-1), proveniente del Instituto Carlos III de Madrid y la cepa MS del virus Herpes simple tipo 2 (HSV-2), procedente del Instituto Pasteur. Los virus se inocularon en frascos de 25 cm3 con monocapa confluente de células Vero, a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 0.1, y se incubaron durante una hora para permitir la adsorción; pasado el tiempo de incubación, se añadió medio 199, con SFBI al 2% y fueron incubados a 37 ºC nuevamente. Las cosechas fueron realizadas cuando el 70% de la monocapa mostró Efecto Citopático (ECP) característico. Se empleó Aciclovir como control positivo, como control celular (células sin tratar) y el control de los virus.
Titulación de los virus
Las cepas virus se titularon mediante el ensayo de punto final 50 %, el resultado se expresó como dosis infectiva media en cultivo celular por mililitro (DICT50.mL-1). El cálculo del título infectivo se realizó según el procedimiento planteado por Reed y Muench (1938).
Ensayo de citotoxicidad
La determinación de citotoxicidad se realizó mediante el ensayo de reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT). Se emplearon placas de 96 pozos de fondo plano con monocapa confluente de células Vero, sembradas 48 horas antes. El rango de concentraciones evaluadas fue de 62.5 a 1000 µg/ml (siete réplicas por concentración), las placas se incubaron a 37 ºC, en atmósfera con 5% de CO2. Se realizó la observación diaria al microscopio invertido, con el objetivo de apreciar cambios morfológicos que indicaran toxicidad. A las 72 horas se añadió a cada pocillo 10 µl de MTT 5 000 µg/ml, disuelto en solución salina tamponada con fosfato (SSTF) (0.01 mol/l; pH 7). Se agitó levemente y se incubó durante 4 horas a la temperatura de crecimiento de la línea celular, protegido de la exposición a la luz. Posteriormente se eliminó cuidadosamente todo el contenido de la placa y se disolvieron los cristales de formazán con 100 µl de DMSO por pocillo. La absorbancia se midió a 540 nm en un lector de ELISA (Organon Teknika Reader 530).
El porcentaje de viabilidad celular asociado a cada concentración del extracto se calculó dividiendo el valor medio de la absorbancia de los cultivos tratados con dicha concentración, entre el valor medio de absorbancia de los controles de células (sin tratar), los cuales se consideraron el 100% de viabilidad celular. Se determinó el valor de la Concentración Citotóxica media (CC50) mediante regresión lineal, a partir de la ecuación de la línea de tendencia de la curva dosis-respuesta, obtenida al graficar (concentración del extracto-porcentaje de viabilidad celular).
Método del MTT (Mosmann, 1983; Freshney, 1994)
Se añadieron 20 µl de MTT por pozo, diluido en solución salina tamponada de fosfato (SSTF) 0.1 M pH 7, a una concentración de 5 mg/ml y se incubaron durante tres horas a 37 ºC, en atmósfera de CO2 al 5%. Transcurrido el tiempo de incubación se eliminó el medio de los pozos y se añadieron 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) (BDH); las placas se agitaron en un agitador KS 500 a 300 r.p.m., durante 10 minutos. Se leyó a 540 nm en lector de ELISA (Organon Teknika Reader 530).
Estudio de la actividad antiviral
Determinación de la concentración efectiva media antiviral (CE50).
El ensayo de CE50 se realizó en placas de 96 pozos de fondo plano sembradas con monocapa confluente de células Vero, a razón de 2x105 células/ml, a las que se le añadieron 50 µl por pozo de las diferentes concentraciones de cada una de las fracciones (cuatro réplicas por concentración). Se incubaron durante 1 h a 37 ºC, en atmósfera de CO2 al 5%. Concluido el tiempo de incubación, se infectaron los pozos con 50 µl de 100 Dosis Infecciosa en Cultivo de Células (DICC50) de los virus. Las placas se incubaron nuevamente a 37 ºC, en atmósfera de CO2 al 5%, hasta la aparición del ECP en todos los pozos controles de virus sin tratar. Como control positivo se utilizó el Aciclovir. Se aplicó el método colorimétrico del MTT para determinar la viabilidad celular. El experimento se realizó por triplicado.
Evaluación de la actividad antimicrobiana
Cepas bacterianas
Se utilizaron cepas de referencia: Escherichia coli (ATCC10536), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Candida albicans (ATCC 10231) Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027), Salmonella thyphi (ATCC9992), recomendadas por el Comité Nacional de Laboratorio Clínico Estándar (NCCLS por sus siglas en inglés) para estudio de sensibilidad antimicrobiana (NCCLS, 2000) y microorganismos aislados a partir de muestras clínicas: Staphylococcus aureus (3cepas), Acinetobacter iwoffii (2 cepas), Enterobacter agglomerons (1 cepa), Pseudomonas aeruginosa (1 cepa), Escherichia coli (2 cepas) procedentes del Hospital Pediátrico ¨Juan Márquez¨ en La Habana.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
La actividad antimicrobiana se determinó por el método de microdilución según el NCCLS (NCCLS, 2000) para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Se prepararon inóculos de las cepas microbianas ajustadas a 0.5 de la escala de Mc. Farland, a partir de crecimiento bacteriano en placas con Agar Triptona Soja y de levaduras en medio Sabouraud e incubadas a 37 ºC, durante 18-24 horas. Se realizaron diluciones dobles de los extractos, desde 100 mg/ml hasta 0.78 mg/ml. Se determinó la CMI como la concentración más baja del extracto capaz de inhibir el crecimiento bacteriano y levaduriforme, Se empleó como control negativo la incubación con solución de etanol al 70%(v/v).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ensayo de citotoxicidad y actividad antiviral
La exposición de las células Vero a los extractos mostró que el extracto acuoso a la concentración de 500 μg/ml no evidenció efecto tóxico sobre las células, mientras que el extracto hidroalcohólico no expresó toxicidad a partir de la concentración de 125 μg/ml, presentando una viabilidad celular de 80%, en ambos extractos. A partir de estos valores la viabilidad celular disminuyó en la medida que aumentó la concentración de los extractos. La observación microscópica de los cultivos evidenció un daño característico provocado por los extractos, como la producción de gránulos en el citoplasma y la alteración en la morfología de las células, que aumentó en la medida que aumentaba la concentración. Por lo que los extractos, a bajas concentraciones no produjeron toxicidad.
Conocido el comportamiento tóxico de las fracciones sobre las células, se procedió a determinar la posible actividad antiviral frente a HSV-1 y HSV-2. Las concentraciones de los extractos utilizadas fueron aquellas que no mostraron actividad citotóxica y que se correspondieron con una viabilidad celular superior al 50%.
Los resultados de los ensayos primarios de actividad antiviral “in vitro” avalaron que ninguno de los extractos inhibió la multiplicación de las cepas de los virus del Herpes simple ensayadas.
Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana de los extractos frente a los patógenos probados se observa en la tabla 1. El extracto hidroalcohólico al 70 % obtuvo mayor actividad en comparación al extracto acuoso, tanto frente a las cepas bacterianas como levadura en las diferentes concentraciones, inhibiendo el 100 % de las cepas evaluadas, alcanzando los mejores valores de CML (3,13 mg/g) frente a las cepas de Vibrio cholerae (ATTC7258), Salmonella typhi (ATCC9992), Acinetobacter iwoffii (1 cepa de aislamiento clínico), Staphylococcus aureus de Referencia (ATCC6538) y las 3 cepas de aislamientos clínicos, mientras que el extracto acuoso inhibió el 46,66 % de las cepas estudiadas: Salmonella typhi (ATCC9992), Candida albicans (ATCC 10231), Staphylococcus aureus (ATCC6538) y 3 las cepas de aislamientos clínico. La actividad disminuyó con el decrecimiento de las concentraciones.
Tabla 1 Actividad antimicrobiana de los extractos de Moringa oleifera Lam.
| Microrganismos | Extractos (CMI) | |
|---|---|---|
| Acuoso | Hidroalcohólico | |
| Escherichia coli (ATCC 10536) | N | 12.55 |
| Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027) | N | 12.55 |
| Vibrio cholerae (ATCC 7258) | N | 3.13 |
| Candida albicans (ATCC 10231) | 11,1 | 3.13 |
| Salmonella tiphi (ATCC9992) | 11,1 | 3,13 |
| Staphylococcus aureus (ATCC6538) | 11,1 | 3,13 |
| Staphylococcus aureus (ac) | 11,1 | 3.13 |
| Staphylococcus aureus (ac) | 11,1 | 3.13 |
| Staphylococcus aureus (ac) | 11,1 | 3.13 |
| Acinetobacter iwoffii (ac) | N | 3.13 |
| Acinetobacter iwoffii (ac) | N | 12.55 |
| Enterobacter agglomerons (ac) | N | 12.55 |
| Pseudomonas aeruginosa (ac) | N | 12 55 |
| Escherichia coli (ac) | N | 12.55 |
| Escherichia coli (ac) | N | 12.55 |
Leyenda: N negativo.
Actividad citotóxica y antiviral
Para el desarrollo de este ensayo se utilizó el método colorimétrico del MTT, cuya utilidad en la evaluación de la citotoxicidad y la proliferación celular ha sido ampliamente reconocida. En ambos extractos se demostró que altas concentraciones producen toxicidad sobre los cultivos celulares, lo que pudiera deberse a la presencia de los fitoconstituyentes citotóxicos en estos. Los resultados están en concordancia con otros estudios de citotoxicidad de extractos de hojas de Moringa oleifera que reflejaron variabilidad en los resultados, coincidiendo que a bajas concentraciones no se detecta toxicidad en las células. En Tailandia en un estudio con extractos etanólicos y acuosos de Moringa oleifera mostraron citotoxicidad a concentraciones por encima de100 µg/ml en células de cáncer. (Saetung et al., 2005). La citotoxicidad de extractos acuosos de hojas de Moringa oleifera sobre células Hela causaron una alta mortalidad de las células a partir de100 µg/ml (Nair y Varalakshmi, 2011).
Ensayos a extractos metanólicos de A. indica y M. oleifera indicaron que inhibieron el 50% de la viabilidad celular (CC50), a una concentración de 70 µg /ml, igualmente no mostraron ninguna citotoxicidad contra la línea celular de MDCK, en concentraciones bajas (Arévalo-Híjar et al., 2018). Jumba et al. (2015), evaluaron la citotoxicidad del extracto metanólico M. oleifera frente a la línea celular Vero-E6 y determinaron una CC50 de 149 µg/ml.
Estudios de Moringa oleifera empleando un cultivo primario de leucocitos de S. aurata HK, tanto los extractos acuosos como etanólicos mantuvieron la viabilidad durante 24 h de incubación, excepto cuando se utilizó una alta concentración del extracto acuoso (Othmen et al., 2020). Rahaman et al. (2015) ensayó el efecto de extractos acuosos de hojas y semillas de Moringa oleifera sobre células MCF-7 y comprobó que la viabilidad celular disminuyó de la misma forma que el fármaco utilizado para este propósito.
Actividad antiviral
Las concentraciones de los extractos utilizadas fueron aquellas que no mostraron actividad citotóxica significativa y que se correspondieron con una viabilidad celular superior al 50%.
Los resultados de los ensayos primarios de actividad antiviral “in vitro” avalaron que ninguno de los extractos inhibió la multiplicación de los virus del Herpes simple en las células Vero. En este sentido es posible que la ausencia de actividad esté relacionada a las características de los receptores celulares que median en el proceso infeccioso en las células Vero, así, hay una susceptibilidad diferencial en los distintos tipos de líneas celulares. Aunque la actividad contra estos virus se ha reportado principalmente en ensayos in vivo, retrasando el desarrollo de lesiones herpéticas cutáneas, prolongando los tiempos medios de supervivencia y reduciendo la mortalidad de ratones infectados con Herpes simple.
Diversos trabajos refieren actividad de diferentes partes de la planta Moringa con actividad contra el Herpes, en ensayos “in vivo”, donde demuestran que retardan la progresión de las lesiones producidas por estos virus. Lipipuna et al. (2003), evaluando extractos provenientes de diferentes plantas, entre estas, Moringa, encontró que la administración a ratones de extractos de hojas de Moringa por peso, retardó la progresión de las lesiones, prolongaron el tiempo de supervivencia y redujeron la mortalidad después de haber sido infectados los ratones con HSV-1 y que el efecto protector de Moringa oleifera en lo ratones no se relacionó con un efecto antiviral directo, sino que pudo resultar en parte de una actividad inmunomoduladora o una mayor biodisponibilidad de Moringa oleifera y que por tanto, este extracto podría contener los compuestos activos que serían eficaces en el tratamiento de la infección cutánea por HSV-1.
Kurokawa et al. (2016) utilizando como modelo de infección el HSV-1 en ratones, suministrando dosis de 300 mg/kg de extractos acuosos de hojas de Moringa oleifera Lam. limitó el desarrollo de lesiones herpéticas y redujo el título del virus en el cerebro, indujo la producción de interferón por lo que los extractos tuvieron un efecto inductor en la inmunidad celular. En el ensayo “in vitro” en células Vero con extractos alcohólicos y acuosos encontró actividad contra el HSV-1, a una CE50 de 100 μg/ml, mientras que el extracto acuoso no tuvo actividad “in vitro”, refiriendo que posiblemente los componentes con actividad en este extracto hayan sido eliminados durante el proceso de extracción.
En este estudio los extractos de Moringa oleifera no neutralizaron las cepas de virus Herpes estudiadas. Sin embargo, se necesitan más investigaciones en esta área para indagar su potencial contra los virus del Herpes simple, ensayando en diferentes líneas celulares, así como con otros virus donde se ha reportado que extractos de las hojas de M. oleifera tienen buen efecto inhibitorio como: Herpes zoster, Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV), Hepatitis B entre otros (Abd rani, 2018; Mattar, 2019).
Actividad antibacteriana
Diversas investigaciones señalan las propiedades de la planta Moringa oleifera a través de estudios experimentales utilizando diversos tipos de extractos (Franco-Ospina et al., 2013). En el presente trabajo se evaluó la actividad de extractos hidroalcohólico y acuoso provenientes de Moringa oleifera Lam frente a patógenos causantes de bacteriemias.
Ambos extractos resultaron activos contra el género Staphylococcus, evidenciándose una mejor respuesta con el extracto hidroalcohólico respecto al acuoso. El extracto hidroalcohólico presentó actividad contra todas las cepas ensayadas mientras que el acuoso solo inhibió seis de las cepas. Esta actividad antimicrobiana confirma que los fitoquímicos presentes en las hojas de Moringa oleifera le atribuyen estas propiedades. Estos resultados corroboran lo reportado por Vivian et al. (2021) que encontraron presencia de altas concentraciones de polifenoles y flavoniodes en las hojas de diferentes ecotipos de Moringa oleifera cultivada en Cuba, demostrando que estos compuestos contribuyen a la inhibición del crecimiento microbiano por diversos mecanismos. Akinpelu (2001) planteó que dentro de los compuestos secundarios están comprendidos los principios activos, los que poseen propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antitumorales, analgésicas, antiinflamatorias, hipotensoras e inmunoestimulantes.
La variación de la actividad antibacteriana de los extractos frente a las diferentes cepas pudiera deberse al grado de polaridad y solubilidad relacionada con los solventes en la captación de los metabolitos activos con acción directa sobre la pared celular de los patógenos (Seleshe y Kang, 2019). El etanol tiende a arrastrar mayor cantidad de compuestos polares como fenoles, taninos, flavonoides y otros metabolitos. Se ha reportado que estos compuestos poseen actividad antimicrobiana, debido a que inhiben la formación de la pared celular y la síntesis de ADN o ARN e impiden el crecimiento bacteriano ya que actúan en la inhibición de enzimas por los compuestos oxidados posiblemente mediante reacciones del grupo sulfihidrilo o por interacciones no especificas con proteínas (Domingo, 2003). Además, las mezclas hidroalcohólicas favorecen una mejor solubilidad de los componentes activos responsables de la actividad bactericida y aumentan la permeabilidad de la pared celular (Sahin y Samli, 2013). Así el extracto hidroalcohólico presentó mayor actividad antimicrobiana, que alcanzó los mejores valores de CMI (3,13 mg/g) comparado con el acuoso lo cual pudiera deberse a la elevada concentración de metabolitos presentes en los extractos hidroalcohólicos
La menor actividad del extracto acuoso puede atribuirse a que el agua extrae otros metabolitos que pueden interactuar antagónicamente en esta actividad y probablemente necesite altas concentraciones para tener mejor efecto antibacteriano. Martini (1998) reportó que los extractos acuosos presentan poca actividad antimicrobiana y que los principios activos de las plantas no son fácilmente extraídos con agua.
Rahman (2009) estudió la actividad antibacteriana de extractos acuosos y etanólicos de las hojas de Moringa oleifera "in vitro", en el que ambos extractos mostraron actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram [-] y Gram [+], presentando el extracto etanólico mayor actividad que el acuoso.
La especie S. aureus es una especie patógena capaz de provocar la aparición de numerosas infecciones en la piel, que pueden incluso tornarse muy complicadas de eliminar. La actividad biológica de los extractos etanólicos y acuosos de Moringa inhibió el crecimiento de las distintas cepas de S. aureus. Los valores de CMI frente a las cepas de S. aureus concuerdan con el estudio de Benavides (2019) que demostró la actividad antibacteriana contra S. aureus en extractos de hojas de Moringa.
La actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico fue mayor contra especies de S. aureus que contra E. coli., siendo los organismos Gram [+] ligeramente más sensibles que los Gram []. Estudios similares realizados por Bukar et al. (2010), reportaron que extractos etanólicos de las hojas de Moringa oleifera fueron sensibles a S. aureus y a E. coli a concentraciones de 200 mg/ml. El hecho de encontrar una mayor efectividad frente a bacterias Gram [+] que en las Gram [-] puede estar relacionada con la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram [+] poseen una pared celular interna y una pared de peptidoglucano mientras que las bacterias Gram [-] poseen una pared celular de mayor complejidad con una pared celular interna, la pared de peptidoglucano y una bicapa lipídica externa o membrana externa que forma un saco rígido alrededor de la bacteria, lo que constituye una barrera impermeable a macromoléculas y le ofrece protección en condiciones adversas, actúan como una barrera a un gran número de sustancias incluyendo los antibióticos (Ali et al., 2001). Esto podría también explicar por qué las plantas medicinales tienden a ser más efectivas contra cultivos de bacterias Gram [+] que Gram [-].
El estudio además reveló actividad antibacteriana de los extractos frente a las cepas de bacterias de Salmonella tiphi y Candida albicans.Doughari y Pukuma (2007) reportaron similares resultados empleando la técnica de difusión en placa, con un halo de inhibición de 8 mm. (Manikandan, 2016) en un estudio con extractos de Moringa en varios solventes orgánicos a diferentes concentraciones frente a bacterias Gram [+] y Gram [-] observó que la mayoría de los extractos inhibieron ambos organismos.
La eficiencia de extractos de Moringa oleifera como agente antibacteriano parece ser debido a algunos componentes activos que contienen, los cuales podrían trabajar juntos en sinergismo como antagonistas del crecimiento y viabilidad celular. Estos compuestos responsables de la actividad pueden fácilmente pasar a través de la membrana celular debido a la presencia de los grupos etílicos los cuales inhiben las enzimas esenciales de la membrana celular y la síntesis de peptidoglucano, también pueden generar radicales libres cargados negativamente que pueden desorganizar o romper la membrana celular. Asimismo, algunos compuestos solubles presentes en Moringa oleifera pueden dañar la membrana celular afectando la permeabilidad celular, el crecimiento y supervivencia bacteriana (Wang et al., 2016).
CONCLUSIONES
La búsqueda constante de nuevas sustancias antimicrobianas que permitan ofrecer alternativas fitoterapéuticas contra cepas multiresistentes de microorganismos basados en las actividades biológicas de la base científica proporciona el sistema para su uso en los servicios de salud. Los resultados del estudio sugirieron que los extractos acuosos y etanólicos de hojas secas de M. oleifera de forma general presentan un potencial de compuestos que le atribuyen propiedades antimicrobianas prometedoras con efectos inhibidores frente a especies patógenas tanto Gram [+] como Gram [-], lo cual podría contribuir al tratamiento de enfermedades infecciosas provocadas por estos microorganismos. Estos resultados avalan la continuidad de otras investigaciones en la búsqueda de compuestos en las hojas secas de M. oleifera que presentan actividad antimicrobiana, que puede tener relevancia, ya que se trata de agentes antimicrobianos naturales que constituyen un método barato y sostenible para el control de enfermedades y para mejorar la calidad de vida.
