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INTRODUCCIÓN
La contaminación de ecosistemas acuáticos y terrestres por la presencia de petróleo y sus derivados, metales pesados y otros compuestos orgánicos persistentes (COP) es un serio problema ambiental que se agudiza por la dependencia económica de este combustible y de la industria metalúrgica.1 Frente a esta situación, el uso de tecnologías convencionales es insuficiente, en términos de recursos, consumo de energía y el empleo de productos químicos, especialmente cuando el contaminante se encuentra a bajas concentraciones.2 Por tal motivo, se requiere de tecnologías sostenibles, seguras y ecocompatibles que estimulen los procesos naturales de remoción. En este sentido, el empleo de microorganismos desempeña un papel significativo.
En Cuba, la protección del medio ambiente es un derecho constitucional. El plan de Estado para el Enfrentamiento al Cambio Climático (Tarea Vida), tiene entre sus objetivos la conservación de los ecosistemas y para dar respuesta al cumplimiento de las tareas asociadas al logro de este objetivo, el empleo de métodos biotecnológicos de tratamiento constituyen alternativas de solución amigable con el medio ambiente para tratar la contaminación con compuestos orgánicos persistentes (COP) y metales pesados en diferentes ecosistemas cubanos, en situaciones donde el objetivo principal es retornar la zona afectada a un estado saludable y productivo. Tomando en consideración estos antecedentes, el objetivo del trabajo es evaluar el empleo de microorganismos en la remoción de COP y metales pesados de suelos y aguas impactados.
MÉTODOS
Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos
Aislamiento
El aislamiento de cepas bacterianas autóctonas con capacidad de remoción de COP y productoras de ramnolípidos se realizó mediante la técnica de enriquecimiento secuencial utilizando compuestos oleosos como única fuente de carbono (figura. 1). En el caso de las rizobacterias, se realizó a partir de una suspensión, en agua estéril, de la tierra que rodeaba las raíces de plantas colectadas en suelos contaminados por hidrocarburos. Las cepas se identificaron utilizando pruebas bioquímicas clásicas para determinar el género y la especie según el Manual Bergey’s. 3
Selección
Para la selección de las bacterias productoras de ramnolípidos se utilizaron los métodos Agar azul, 4 Gota colapsada 5 y Aceite difundido 6 y se determinaron parámetros físico-químicos y estructurales de la mezcla de ramnolípidos obtenida.
La selección de las cepas degradadoras de petróleo, se realizó evaluando su crecimiento en placas con hidrocarburos como única fuente de carbono. La capacidad biodegradadora se estudió mediante un ensayo de biodegradación en medio líquido mineral con hidrocarburos y crecimiento de los aislados en placas con medio salino y naftaleno. La actividad se evaluó midiendo el halo de degradación (cm). 7
Los aislados rizosféricos con características de promotoras de crecimiento vegetal se seleccionaron atendiendo a la capacidad de producción de ácidos orgánicos, acetoína, solubilización de fosfatos, ácido indolacético y fijación de nitrógeno atmosférico.
Evaluación de remoción de hidrocarburos y metales pesados
Hidrocarburos
La remoción de hidrocarburos de suelos contaminados se realizó mediante la técnica descrita por Urum et al (2006) 8 y mediante la técnica de bioaumentación en microcosmos (Nápoles 2005). 9 En el caso de aguas contaminadas se evaluó la aplicación de un consorcio bacteriano (Xanthomonas sp., Acinetobacter bouvetii; Shewanella sp.; Defluvibacter lusatiensis) obtenido en México y actualmente depositado en la Colección de Cultivos del CEBI. Los ensayos se realizaron en botellas que contenían 50 mL de agua de mar estéril (ME) y sin esterilizar (MSE), suplementados con 10 % de diésel e incubados en zaranda por 21 d. Este consorcio se utilizó en el biorreactor Airlift diseñado en el laboratorio para estos fines.
Clorofenoles
Para los ensayos de biodegradación de clorofenoles (ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2,4-D) se evaluaron las rizobacterias con características de promotoras del crecimiento vegetal. Se añadió 1 mL de inóculo a una concentración de 3 x 108 UFC mL-1 a frascos con 100 mL de medio mineral salino con 2,4-D como única fuente de carbono. El cultivo se desarrolló en zaranda a 30 °C.
Metales pesados
La remoción de metales pesados de aguas contaminadas se evaluó aplicando ramnolípidos y bioadsorción con biomasa microbiana seca. Se utilizó una solución de ramnolípidos de 280 mg/L siguiendo la metodología descrita por Elouzi et al (2014). (10
Los experimentos de adsorción se realizaron con 0,25 gL-1 de biomasa seca (Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011), bajo agitación en zaranda a 175 rpm, pH 6,2 unidades y tiempo de contacto de 60 min.
Proceso combinado
Otra opción evaluada para remediar aguas contaminadas con metales pesados que a su vez contienen hidrocarburos fue la integración de los procesos de precipitación de metales pesados y biodegradación de petróleo por las bacterias Desulfovibrio sp. y Pseudomonas aeruginosa AT18 respectivamente, el cual fue realizado según el sistema experimental descrito en la figura 2, con el empleo de un sistema de reactores combinado aerobio/anaerobio/bioprecipitación. El reactor anaerobio (bioprecipitación) operó con un cultivo de Desulfovibrio sp. En fase de crecimiento exponencial, cuyo efluente se hace pasar por el reactor aerobio (biodegradación) conteniendo el medio mineral y los metales pesados Cr(III), Cu(II), Mn(II) y Zn a concentraciones de 60 mgL-1, 50 mgL-1, 50 mgL-1 y 80 mgL-1 respectivamente, y 2 % (v/v) de una suspensión celular de Pseudomonas aeruginosa AT18 (DO600nm = 2), obtenida del pellet centrifugado (10 min, 5000 g) en fase exponencial. El seguimiento del cultivo se realizó durante los primeros 4 días cada 12 h y a partir de ahí cada 24 h, mediante la determinación de la concentración celular, pH, concentración de sulfato y concentración de sulfuro. 11
Métodos analíticos
Cuantificación del ramnolípido (RL)
El biosurfactante se cuantificó por el método colorimétrico de la Antrona previamente validado. 12 Se tomaron 1,25 mL de medio libre de células y se mezclaron con 2,5 mL de reactivo (0,2 g de 9,10-dihidro-9-oxoantraceno por cada 100mL de ácido sulfúrico) en tubos de ensayos inmersos en agua fría (10-15 ºC). Se agitaron en vórtex, se colocaron durante 15 min en baño de agua a 100 ºC y se enfriaron a temperatura ambiente por 1 h. La determinación se realizó mediante curva de calibración (y = 0,0096x - 0,007, r2 = 0,9975) utilizando soluciones patrones de ramnosa entre 10 y 70 μg mL-1 preparados a partir de una solución de concentración 1 g/L-1, los cuales recibieron el mismo tratamiento que las muestras. Se midió la absorbancia (Spectroquant Pharo 300 Merck) a 625 nm contra blanco de reactivo. La concentración de RL se calculó multiplicando los valores de ramnosa por el factor de corrección 3,4 para compensar la masa extra que representa la porción lipídica del RL.
Cuantificación de hidrocarburos
Se realiza mediante la determinación de los TPH (Total Hydrocarbon Petroleum) por gravimetría, previa extracción líquido/líquido con n-hexano (1). 13 En todos los casos se corrigen las muestras respecto a un control y así se determina el porcentaje de biodegradación.
(1)
Posteriormente, la fracción alifática fue analizada en un cromatógrafo de gases Termoquest Trace 2000 con detector de ionización a la llama (FID) y columna capilar OBS de 30 m de longitud x φi = 0,25 mm de diámetro interno. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura inicial 50 ºC (1 min); gradiente de temperatura: 5 ºC min-1 hasta 320 ºC y a esta temperatura durante 10 min; temperatura detectora: 320 ºC; temperatura inyector: 290 ºC; flujo de Helio: 1,1 mL/min-1; volumen de inyección: 1 μl. La integración de los picos se realizó con el software Chemcard y la representación gráfica de los cromatogramas se obtuvo con el software Sigmaplot 2,0. En la cuantificación de los picos se incluyó la UCM (unresolved complex mixture). Todas las muestras se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), con un cromatógrafo de gases HP5890 serie II y un espectrómetro de masas modelo HP5989A.
Cuantificación de metales pesados
Las concentraciones de los metales se determinaron por espectroscopia óptica de emisión atómica mediante plasma de acoplamiento inductivo (ICP-AES) en un espectrómetro Ametek, Alemania. Para esto, las muestras se centrifugaron a 4500 rpm en centrifuga (Neofuge 5 Heal Force, China) durante 10 min; la solución sobrenadante se filtró por medio de jeringuillas con filtros Milipore acoplado (White GSWP, 0,22 ± 0,2 µm) de 20 mm de diámetro para eliminar los sólidos que pueden interferir en el análisis, los filtrados obtenidos se conservaron a 4 ºC hasta su posterior lectura.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la investigación se profundiza en el empleo de microorganismos (tabla 1) con capacidad para remover COP y metales pesados presentes en ecosistemas acuáticos y terrestres, ya sea por la producción de biosurfactantes (ramnolípidos) que aumentan la biodisponibilidad, y por ende, la extracción del contaminante, como por sus capacidades metabólicas para la biodegradación.
Se aislaron, de ambientes contaminados con hidrocarburos, 9 cepas bacterianas autóctonas. Todas se encuentran depositadas en la Colección de Cultivos del CEBI.
Tabla 1 Microorganismos utilizados en la remoción de compuestos orgánicos persistentes y metales pesados
| Microorganismo | Contaminante que remueve | Procedimiento de remoción empleado |
|---|---|---|
| * P. aeruginosa ORA9 (ramnolípidos) | Hidrocarburos (petróleo) Metales pesados | Lavado de suelo Quelación con ramnolípidos |
| * Bacilos grampositivos | Hidrocarburos (petróleo) | Biorremediación por bioaumentación (microcosmos) |
| * Rizobacterias | **(2,4-D) | Biodegradación |
| * Pseudomonas aeruginosa AT 18 Desulfovibrio sp. | Hidrocarburos (petróleo) Metales pesados | Sistema de reactores aerobio/anaerobio/precipitación |
| Consorcio bacteriano | Hidrocarburos (petróleo, diésel) | Biorreactor Airlift |
| * Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011 | Metales pesados | Bioadsorción |
* Microorganismo autóctono, **ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Pseudomonas aeruginosa ORA9 produce un biosurfactanteramnolipídico (RL), compuesto biodegradable y poco tóxico (14 que removió el 75 % de los hidrocarburos presentes en los suelos estudiados (figura 3A), 15 efectividad superior a otras reportadas en la literatura 8) en condiciones similares, lo cual avala la aplicabilidad del RL en tareas de remediación.
En Cuba no se tienen reportes de la producción de RL, compuestos con probadas aplicaciones no solo en actividades de biorremediación sino también en la agricultura como plaguicidas y en la industria farmacéutica y cosmética. Por primera vez, se presenta una propuesta viable para la producción de este biosurfactante a escala piloto, utilizando el aceite residual de la fritura de alimentos como materia prima barata y renovable, 16 lo que permitirá disponer de cantidades suficientes del RL para su aplicación en procesos de remediación a una escala mayor.
Por otra parte, el empleo de 4 cepas de bacilos grampositivos aisladas de suelos contaminados con hidrocarburos de la empresa portuaria permitió un 84 % de remoción de hidrocarburos presentes en suelos (figura 3A) aplicando biorremediación por bioaumentación, técnica con indudables ventajas por su menor coste económico, la no afectación de otros compartimentos ambientales y la optimización de los recursos.
Por otro lado, rizobacteriasde plantas herbáceas (Scleria, Cyperusrotundus y Cynodon dactylon) de suelos contaminados con hidrocarburos degradaron hasta el 72 % del herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 17 siendo el primer informe de rizobacterias aisladas de estas malezas con capacidad para degradar compuestos fenólicos y que además tienen características de promotoras del crecimiento vegetal, lo que sugiere el potencial de estas herbáceas para aislar bacterias con la capacidad de degradar los clorofenoles y la posibilidad de asociarlas a sistemas de fitorremediación.
Fig. 3 Remoción de COP (A) y metales pesados (B) obtenidos con la aplicación de técnicas biotecnológicas.
En el tratamiento de aguas contaminadas con hidrocarburos (figura 1A) se utilizó un consorcio bacteriano (tabla 1), que en los primeros 10 d del estudio, removió el 62 % de hidrocarburos (diésel) en agua de mar,18) demostrándose la efectividad y ventajas del consorcio sobre cultivos puros, atribuidas a los efectos sinérgicos que se establecen entre sus miembros. Este mismo consorcio removió el 69 % de hidrocarburos de aguas contaminadas por el proceso productivo de la Refinería de Petróleo Hermanos Díaz de Santiago de Cuba, utilizando un biorreactorairlift diseñado en condiciones de laboratorio, constituyendo novedad el empleo de este sistema biológico para la remoción de hidrocarburos de aguas contaminadas.
La remediación de la contaminación por metales pesados constituye un desafío, debido a que no pueden ser degradados. En la investigación se presentan los resultados de la remoción de Cu, Zn y Mn de aguas contaminadas de la laguna formada en la antigua mina de cobre de Santiago de Cuba (figura 3B), con el objetivo de reducir la contaminación por estos metales en este ecosistema acuático. Con la aplicación de una solución de RL (280 mg L-1) se obtuvo, en 10 h de contacto, un 50 % de remoción de Cu. El tiempo de contacto y la relación RL/agua fueron los factores de mayor influencia en la remoción.
Como alternativa al empleo de biosurfactantes, se utilizó la biomasa seca de Kluyveromycesmarxianus CCEBI 2011 alcanzándose 52 %, 23 % y 14 % de remoción de Cu, Zn y Mn, respectivamente, y se determinó además la influencia del pH en el proceso de adsorción. 19) Se observa en todos los casos aumento de la adsorción con el transcurso del tiempo hasta los 60 min, tiempo a partir del cual no se aprecia aumento considerable del proceso. Los resultados infieren que la bioadsorción del cobre, manganeso y zinc es dependiente del tiempo, lo cual sugiere que la retención del ión, puede ser por la interacción con grupos funcionales localizados en la superficie de la biomasa utilizada. A partir de los 60 min de contacto del bioadsorbente con las soluciones estudiadas, se adsorbe el 46,2 % del cobre (II), el 65,0 % del zinc y el 42,3 % del manganeso (II) existente en el medio, alcanzando rápidamente el equilibrio. De acuerdo a los resultados, el metal mejor adsorbido fue el zinc, seguido por el cobre (II) y luego el manganeso (II), aunque se debe destacar que el zinc fue el de menor concentración de partida (4,0 mg/L-1) y cobre (II) la mayor concentración (45,0 mg/L-1).
Este trabajo constituye el primer reporte de acciones de tratamiento directo de las aguas de la Laguna azul del Cobre, 20 sitio que por su ubicación geográfica en las proximidades del santuario de Nuestra Señora de la Caridad del Cobre, puede convertirse en un espacio con fines recreativos, turísticos, de conservación de la biodiversidad, la acuicultura, la irrigación y como abasto de agua para otras actividades mineras que se desarrollan en la zona, en un marco donde a nivel mundial se realizan ingentes esfuerzos para la recuperación y protección del vital líquido.
También se evaluó el empleo de un sistema de reactores aerobios/anaerobios/precipitación para el tratamiento de aguas residuales contaminadas con hidrocarburos y metales pesados, utilizando Pseudomonas aeruginosa AT18 y Desulfovibrio sp, donde se obtuvo la total remoción de los metales y un 84 % de degradación hidrocarburos en 20 d (figura 3B). Los resultados del análisis por cromatografía gaseosa (figura 4) evidencian la degradación total de las fracciones correspondientes a n-alcanos, isoprenoides y naftenos, quedando solo sin degradar parte de los hidrocarburos aromáticos, degradación que es atribuida fundamentalmente a Pseudomonas aeruginosa AT18, aunque existe la posibilidad de que parte de los hidrocarburos presentes en la mezcla compleja del petróleo Mesa 30/Puerto Escondido sea debido a la acción de Desulfovibrio sp. Este constituye el primer reporte de la utilización de una combinación de reactores aerobio/anaerobio/precipitación para el tratamiento de aguas residuales contaminadas con hidrocarburos y metales pesados, en un mismo sistema. (11
Fig. 4 Perfil cromatográfico del crudo Mesa 30/Puerto Escondido: (a) antes y (b) después del tratamiento con Pseudomonas aeruginosa AT18 a las 480 h de cultivo en sistema de tratamiento integrado precipitación-biodegradación.
Conclusiones
Los ensayos realizados demostraron las potencialidades de la microbiota autóctona, para la remediación de aguas y suelos contaminados con COP y metales pesados. Los resultados promisorios a escala de laboratorio, son escalables y constituyen herramientas nuevas y útiles para implementar un paquete tecnológico para la remoción de estos contaminantes.
