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INTRODUCCIÓN
El síndrome metabólico (SM) se ha convertido en uno de los principales problemas de salud pública del siglo XXI. Está formado por un conjunto de factores de riesgo para padecer diabetes tipo 2, enfermedad coronaria y enfermedades cerebrovasculares, las que presentan un incremento de su prevalencia y su incidencia, con morbilidad y mortalidad prematuras.1
Es un estado de inflamación crónica de bajo grado con efectos sistémicos profundos en el que coexisten un conjunto de alteraciones metabólicas causadas por la combinación de factores genéticos y ambientales. Entre los principales componentes que caracterizan este síndrome se encuentran la resistencia a la insulina (RI), el exceso de grasa abdominal, la dislipidemia aterogénica, la disfunción endotelial, la hipertensión arterial y el estrés crónico. A este se le suman otros factores de riesgo modificables como la inactividad física y los malos hábitos alimentarios que, junto a la obesidad, favorecen al desarrollo de RI.2-7
Un mayor consumo de alimentos con niveles de calorías elevados, grasas saturadas y azucares refinados, más el hecho de no tener una dieta diaria con consumo de verduras, frutas y fibra, han sido los responsables del incremento del SM.8 Las alteraciones del balance energético positivo determinan un almacenamiento incrementado de energía en el adipocito, que se acumula en el tejido adiposo subcutáneo y aumenta por hiperplasia, es decir, a partir de la proliferación y de la diferenciación de los pre-adipocitos. Cuando el tejido adiposo subcutáneo es incapaz de almacenar apropiadamente el exceso de energía o se ha rebasado el umbral de almacenamiento aumentan los depósitos de grasa visceral, que al tener menor capacidad adipogénica, crecen por hipertrofia.9 El tejido adiposo, además, participa en la formación de adipoquinas que favorecen estados proinflamatorios y protrombóticos que contribuyen al desarrollo de hiperinsulinemia y RI.3
A nivel de los tejidos que liberan citoquinas inflamatorias se activan los leucocitos y se libera la enzima mieloperoxidasa (MPO) al foco inflamatorio; se forman radicales reactivos que provocan daño oxidativo en los lugares de la inflamación. Posteriormente, la MPO sale al fluido extracelular y a la circulación general aumentando su concentración en sangre.
La MPO es una enzima oxidorreductasa que se encuentra almacenada, principalmente, en los gránulos azurófilos de los neutrófilos polimorfonucleares humanos, los monocitos y los macrófagos; cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno y cloruro a ácido hipocloroso. Debido al amplio espectro de reactividad el ácido hipocloroso es un mediador de daños hísticos en numerosos procesos inflamatorios que provocan estrés oxidativo (EO). La MPO es capaz de dañar lípidos y lipoproteínas y favorece la termogénesis y los daños vasculares. También se relaciona la disminución de vasodilatadores como el óxido nítrico.10
La MPO es una enzima lisosomal que se libera en vacuolas fagocíticas durante la activación celular y su grado de actividad está directamente relacionado con la concentración de neutrófilos en el tejido inflamado; se forman radicales reactivos que provocan daño oxidativo en los lugares de la inflamación. Posteriormente, la MPO sale al fluido extracelular y a la circulación general,11 por lo que la medición de esta actividad enzimática ha sido considerada un sensible marcador cuantitativo de la quimiotaxis y de la infiltración de neutrófilos en el proceso inflamatorio, también es considerada como un indicativo de estrés oxidativo.12
Muchos son los esfuerzos dispuestos para investigar la etiología del SM por las consecuencias que trae para la salud de los que lo padecen. La implementación de biomarcadores oxidativos como la MPO ayudaría a detectar al SM en etapas asintomáticas y a poder prevenir su progreso.
Los estudios en modelos animales han sido muy utilizados en el mundo y en Cuba. Numerosos trabajos se han desarrollado en roedores teniendo en cuenta su similitud biológica con el hombre y el conocimiento acumulado que se tiene de esta especie desde el punto de vista genético y molecular, lo que facilita la interpretación de los resultados y la extrapolación al hombre.13
El modelo utilizado en esta investigación es susceptible a desarrollar desbalances metabólicos por inducción nutricional, pero sería de gran utilidad corroborar los aspectos teóricos que apoyan el hecho de que el SM tiene un componente inflamatorio importante desde el punto de vista que puede servir de guía tanto para el diagnóstico como para la evolución y el tratamiento al correlacionar el incremento de la actividad de la enzima MPO como un marcador que indica la presencia de procesos inflamatorios en modelos experimentales en animales. Esto constituyó el punto de partida para el diseño de la presente investigación, la que se realizó con el objetivo de determinar la actividad de la enzima mieloperoxidasa en el suero de ratas Wistar con síndrome metabólico inducido por la ingesta de sacarosa al 35%.
MÉTODOS
Se realizó un estudio experimental en el Departamento de investigaciones experimentales biomédicas (UNIB) y en la Unidad de toxicología experimental (UTEX) de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara (UCM-VC) de la Ciudad de Santa Clara, Provincia de Villa Clara, entre septiembre de 2018 y mayo de 2019. Estuvo enmarcado en la determinación de la actividad de la enzima MPO en el suero de animales de experimentación sometidos a una dieta hiperglucídica (sacarosa) desde el destete hasta la edad adulta. Se utilizaron ratas Wistar como modelo biológico por los estudios previos con estas especies y su conocida susceptibilidad a desarrollar desbalances metabólicos por inducción nutricional.
El universo estuvo constituido por ratas Wistar de 180 a 200g procedentes del Centro Nacional de producción de animales de laboratorio (CENPALAB) que fueron sometidos a condiciones de alimentación convencional y agua ad libitum, así como a un ciclo de luz/oscuridad de 12/12, temperatura ambiente de 23°C±2 y humedad relativa de 50 a 70%. Las hembras Wistar comenzaron a consumir solución de sacarosa al 35% una vez constado el día cero de la preñez mediante frotis vaginal. El consumo de sacarosa se extendió durante los 21 días de gestación y 21 días de lactancia. Una vez destetados los animales se conformaron grupos experimentales de 10 animales machos cada uno. Estos animales fueron sometidos a una dieta hiperglucídica (sacarosa) al 35% desde el destete hasta la edad adulta a las 20 semanas. Como muestra para el estudio se tomaron dos grupos experimentales de 10 animales machos cada uno, uno sometido a dieta hiperglucídica que desarrolló el SM y otro con alimentación convencional sano, todos formados aleatoriamente.
Métodos teóricos empleados
Determinación de los niveles de actividad de la enzima mieloperoxidasa: la actividad de la MPO se determinó mediante el método descrito por Graff14 y Carbajal,15 solo se le hicieron algunas modificaciones. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 10 minutos a 4 000g y a 4ºC, inmediatamente después se decantó el suero, se tomó 1ml y se recolectó en microtubos de 1,5ml. Los niveles de actividad de MPO se determinaron en el sobrenadante obtenido tras la centrifugación, se usó el peróxido de hidrógeno (H202) como sustrato para la reacción enzimática. La actividad de la MPO se ensayó en el suero a 25ºC y se midió el aumento de la absorbancia a 460nm debido a la oxidación de la ortodianisidina. A 2,85ml de buffer fosfato (0,05M; pH=6,0), que contiene 0,65mM de cloruro de dianisidina, se le añadieron 100μL de suero que contenía la MPO. La reacción se inició al añadir el peróxido de hidrógeno a una concentración final de 0,14mM, la que se ajustó al medir su densidad óptica a 240nm. La absorbancia de la muestra fue monitoreada a 460nm durante tres minutos a intervalos de un minuto. Se utilizó como blanco al buffer fosfato de potasio. El estudio se realizó en triplicado. La actividad enzimática se expresó en μmoles de peróxido (min-1 ml-1 de suero). Se realizó curva patrón de peroxidasa de rábano (HRP) liofilizada, con duplicado para aumentar su confiabilidad. Se determinó el rango de concentración para el que el método es aplicable entre 0,125 y 2U. Se utilizaron, para calcular la actividad en unidades internacionales (UI) de la MPO, las que se expresaron en U/ml. El estudio del metabolismo lipídico y la glicemia basal, tras 12 horas de ayuno nocturno, se efectuó empleando un autoanalizador Hitachi 902 (Roche Diagnostic, Tokio, Japón) para la cuantificación de colesterol total y triacilglicéridos (TGA); en todos los casos se emplearán métodos colorimétricos, se utilizaron equipos diagnósticos Helfa (EPB “Carlos J. Finlay”, Habana, Cuba). Para la determinación de glicemia en ayunas se utilizó el Rapigluco Test (Quimefa HELFA, Cuba).
Métodos matemáticos empleados
Se aplicaron técnicas o procedimientos de la Estadística Inferencial como:
Estimación de la media y del por ciento poblacional fijando un nivel de confiabilidad del 95%.
-Pruebas de hipótesis
Dentro de las pruebas estadísticas utilizadas se encuentran:
Prueba de bondad de ajuste de Shapiro-Wilk: verifica si una variable cuantitativa se distribuye normalmente.
Prueba t de Student para dos muestras independientes: es una prueba paramétrica y compara los valores promedios de una variable en dos grupos independientes partiendo de que se distribuye normalmente en ellos.
Como resultado de la aplicación de estas pruebas se muestra el valor de su estadígrafo, así como de la significación asociada al mismo (p).
Prueba de hipótesis para el coeficiente de correlación lineal de Pearson: permite comprobar si existe relación lineal significativa entre dos variables cuantitativas a nivel poblacional a través del coeficiente de correlación de Pearson como medida de asociación.
RESULTADOS
La Tabla 1 muestra los valores de la media, la desviación estándar y la significación de los parámetros antropométricos estudiados como el peso, la circunferencia abdominal (CA) y el índice de masa corporal (IMC) del grupo con SM y del grupo sano, los que permitieron verificar la instauración del SM.
El peso de los animales con SM, el IMC y la CA superaron significativamente a los valores que se encontraron en el grupo sano.
La evaluación de la glicemia basal, el colesterol y los triglicéridos fueron herramientas que también permitieron verificar la instauración del SM. La Tabla 2 muestra los parámetros bioquímicos del grupo con SM y del grupo sano, los valores de la media, la desviación estándar y su significación estadística.
El análisis corrobora que la glicemia en ayuna constituye un parámetro predictor de la instauración del SM: el valor de glicemia del grupo con SM supera al grupo sano, mientras que el colesterol total no se modificó significativamente entre el grupo sano y el enfermo. Se observó un incremento 1,47 veces de los TGA en el grupo de SM con respecto al sano, lo que mostró una diferencia significativa entre ambos grupos.
La cuantificación de la MPO evidenció un aumento estadísticamente significativo de la actividad en el grupo con SM inducido (2,57±0,33U/ml) respecto del grupo control (0,78±0,13) (p<0,000); el incremento de la actividad indicaría el estado proin flamatorio en los animales con SM, como se muestra en la Figura 1.
Una de las contribuciones de este estudio es exponer la correlación entre la actividad de la enzima MPO con los parámetros estudiados. La Tabla 3 muestra la relación directa entre la MPO y los parámetros antropométricos y bioquímicos, así como su significación estadística. Los parámetros antropométricos mostraron correlación moderada positiva con la actividad de la MPO; los bioquímicos presentaron una correlación positiva a excepción del colesterol, en el que no existe correlación.
DISCUSIÓN
En el modelo experimental de SM se ha podido observar que las ratas que reciben sacarosa en el agua de bebida en forma crónica constituyen un modelo útil para el diagnóstico de los factores que conforman el SM. En la Tabla 1 se observa que el peso de los animales con SM supera 1,23 veces al peso del grupo sano. El IMC en los animales con SM superó en 1,14 veces al grupo sano y la circunferencia abdominal presentó una diferencia de 1,1 de los animales con SM con respecto a los sanos; todos los parámetros antropométricos presentaron diferencias significativas.
Estudios realizados en los últimos años muestran resultados similares en los que se relaciona el SM con el aumento del peso, el IMC y la cintura abdominal. Castillo Hernández y colaboradores16 plantean que existen diversos estudios que demuestran la elevada asociación entre el SM y alteraciones como la obesidad.
Similares resultados informan Urina-Jassir17 en un estudio sobre la prevalencia del SM en mujeres postmenopáusicas que mostró un incremento de peso y un aumento en la adiposidad abdominal. Otro estudio realizado por Soto Rodríguez18 reveló mayor cantidad de grasa visceral en las mujeres menopáusicas con una asociación entre la grasa visceral y los parámetros que definen el SM como índice de masa corporal y perímetro abdominal.
Otros investigadores también han demostrado la fuerte asociación que existe entre el SM y la obesidad de tipo central.17,19,20 Loureiro y colaboradores,20 en su estudio para correlacionar los componentes del SM con marcadores de inflamación y RI en una población pediátrica, mostraron que el SM en edades tempranas guarda relación con la obesidad y el sobrepeso; en su trabajo predominó la obesidad abdominal. Similares resultados fueron encontrados por Rodríguez-López y colaboradores21 que evidenciaron la importancia del tejido adiposo visceral como factor principal para desencadenar el proceso inflamatorio crónico en el SM, así como la alta relación entre obesidad y SM.
Aunque el IMC no es un marcador tan sensible para determinar el SM, pues se considera que la obesidad central guarda una relación más estrecha con esta enfermedad, hay informes de estudios como el de Cabrera-Rode y colaboradores22 que indican que la prevalencia del SM es mucho más dramática cuando incrementa el IMC.
En cuanto a los parámetros bioquímicos mostrados en la Tabla 2 se pudo constatar que el valor de glicemia del grupo con SM supera 1,11 veces al grupo sano. Este es un valor significativo a pesar de que constituyen valores moderados de hiperglicemia, lo que está justificado metabólicamente por la hiperinsulinemia compensatoria que se produce en el SM.3
Sin embargo, una prolongada sobre-estimulación causada por la dieta hiperglucídica que aumenta la liberación de insulina conllevaría al agotamiento y el fallo de las células ß. Muchas anormalidades en estas células se han descritos acompañadas de disminución en la oxidación de la glucosa y bajo potencial energético y de disminución de la funcionabilidad de los transportadores de membrana para glucosa como la Glut 4, dependiente de insulina, que se encuentra en vesículas membranosas en el citoplasma del tejido adiposo y muscular, por lo que la glucosa no puede ser utilizada en el interior celular y se mantienen elevados niveles de glucosa en sangre. Además, la ausencia de insulina impide la inducción de la síntesis de la enzima glucoquinasa que fosforila la glucosa a nivel hepático. El proceso del daño de la célula β tiene relación con la producción de estrés oxidativo, derivado de la oxidación de la glucosa (glucolisis) y de la oxidación de los ácidos grasos libres (AGL) (beta oxidación), que causa un proceso inflamatorio de bajo grado, en el que se considera que la lipotoxicidad sea provocada al inicio del proceso y la glucotoxicidad sea el mayor responsable del daño que conlleva a la instauración de la diabetes mellitus.23 Estos daños metabólicos descritos no se observan en el modelo de SM utilizado en el que el desbalance observado corresponde, posiblemente, al efecto de una hiperinsulinemia compensatoria que se observa en una primera etapa de suministro crónica de una dieta hiperglucídica.
En estudios previos para la instauración del modelo de SM en ratas Wistar con la inducción por dietas ricas en sacarosa realizados por González Madariaga13 se informa una hiperglucemia moderada observada en ambos sexos. En otra investigación en la que se indujo el SM con la administración de fructosa al 10% diluida en agua de bebida durante seis semanas en ratas macho Wistar se encontraron niveles de glicemia incrementados en el grupo con SM con respecto al grupo sano.24
En un estudio realizado por Castellanos y colaboradores25 en animales de experimentación a los que se les suministró una dieta al 30% de sacarosa durante 24 semanas los animales fueron normoglicémicos, aunque presentaron una tendencia a la RI.
La biosíntesis del colesterol cuenta con un control amplio y variado, como el intracelular hepático, con la participación de la HMG-CoA reductasa, enzima que presenta variados mecanismos de regulación, y una regulación extrahepática vinculada a receptores de la lipoproteína LDL, principal transportadora de este esterol hacia los tejidos periféricos.26 Por tal motivo se conoce que el aumento del colesterol en roedores solo se logra con dietas ricas en lípidos o por modelos modificados genéticamente.13
En esta investigación el colesterol total no se modificó significativamente, resultado que coincide con otros estudios que evaluaron el impacto del SM en humanos y animales de experimentación;13,25 sin embargo, la administración de fructosa al 10% en animales de laboratorio aumentó los niveles de colesterol en el grupo con SM con respecto al grupo sano.24
El ambiente hiperglucídico en la etapa prenatal de estos animales condicionó la respuesta y la predisposición a desarrollar el SM y, por consiguiente, a la elevación de los TAG.
Se observó un incremento 1,47 veces de los TAG en el grupo de SM con respecto al sano. Este resultado concuerda con la teoría que plantea que la obesidad favorece el desarrollo de dislipidemias debido a TAG séricos y AGL aumentados.20
La RI se asocia fuertemente con este perfil dislipídico porque esta condición causa lipólisis aumentada a nivel de adipocito y origina concentraciones elevadas de AGL. A su vez este aumento de los AGL causa una acumulación ectópica de grasa en el hígado, el corazón, el páncreas y el músculo esquelético, entre otros. A nivel del hígado el influjo aumentado de AGL origina una producción y una secreción aumentada de partículas de VLDL y origina, de este modo, un incremento de TAG séricos. Además, la RI ocasiona una menor actividad de la enzima lipoproteín-lipasa, disminuye el aclaramiento tanto de VLDL como de quilomicrones y contribuye, de forma adicional, con la hipertrigliceridemia que interfiere en la acción de la insulina.3
Diversos estudios concuerdan que el SM cursa con hipertrigliceridemia, además lo relacionan con la obesidad.7,11,14,15,20,23
La Figura 1 muestra un incremento en la actividad de la enzima MPO en el grupo con SM con respecto al grupo sano. La enzima MPO es un importante factor de riesgo cardiovascular al generar un aumento en la respuesta inflamatoria capaz de potenciar los efectos oxidativos de su cosustrato peróxido de hidrógeno H2O2, con un rol principal en el daño y la inflamación endotelial. Se libera en vacuolas fagocíticas durante la activación celular y su grado de actividad está directamente relacionado con la concentración de neutrófilos en el tejido inflamado, por lo que la medición de esta actividad enzimática ha sido considerada un sensible marcador cuantitativo de la quimiotaxis y de la infiltración de neutrófilos en el proceso inflamatorio, también es considerada como un indicativo de estrés oxidativo.24
Resultados similares mostró Garagiola24 en su estudio Mieloperoxidasa como indicador de estrés oxidativo en el síndrome metabólico: la actividad de la enzima MPO aumentó en el grupo de SM comparado con un grupo control sano.
En la Tabla 3 se muestra la correlación entre la actividad de la enzima MPO con los parámetros estudiados. Se puede observar que los mayores valores de correlación con la MPO lo presentan el peso corporal y la circunferencia abdominal, lo que evidencia que existe una relación directa entre la obesidad y la actividad de esta enzima.
De los parámetros bioquímicos se destaca la correlación entre la actividad de la MPO y la elevación de TAG, seguida de la elevación de la glicemia, con muy poca diferencia entre ellos.
La relación directa y significativa entre el nivel de MPO con el peso corporal, la circunferencia abdominal, los TAG y la glicemia en ayunas confirman lo hallado por otros autores. Es decir, que el nivel sérico de MPO está incrementado en casos de obesidad y de diabetes o estado de RI y se ha encontrado también que niveles altos de glucosa pueden promover una reacción inflamatoria, lo que lleva a un aumento de los niveles de MPO en plasma, según lo planteado por Carreño y colaboradores.10
Unubol y colaboradores27 relacionaron el incremento de la actividad de la enzima MPO en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. La enzima aumentó en los pacientes con pobre control glicémico, lo que coincide con estos resultados en los que se muestra una correlación positiva entre la MPO y los valores de glicemia en ayuna.
Los neutrófilos desempeñan papeles normales o de defensa en los procesos inflamatorios o anormales en alergias o enfermedades autoinmunes. En los procesos patológicos antes mencionados el arsenal enzimático rico en colagenasas y proteasas produce destrucción de los tejidos. Se ha propuesto que la excesiva actividad MPO, así como las especies de oxígeno reactivas, están implicadas directamente en el daño tisular.28
Varias investigaciones describen la asociación de estados de inflamación crónica y RI con aumento en la actividad de la MPO, así como su relación con el incremento del estrés oxidativo y la disfunción endotelial;29 otros autores informan su repercusión sobre el riesgo cardiovascular.30 Este trabajo muestra la relación positiva entre los valores de TAG y la glicemia en ayunas, así como el peso corporal y la circunferencia abdominal con la actividad de la MPO. Este resultado corrobora que existe una alteración de la homeostasis del metabolismo redox en animales con SM.
CONCLUSIONES
El incremento en la actividad enzimática de la MPO en el grupo con SM con respecto al sano, así como la correlación moderada positiva entre esta y los parámetros antropométricos y bioquímicos estudiados, demostrarían el aumento del EO y justificarían la utilidad de la enzima MPO como marcador para la evaluación del riesgo cardiovascular en estadios tempranos del SM.
