ABSTRACT

Nineteen rhizobium strains were isolated from the nodules of the legumes Canavalia ensiformis, Stylosanthes guianensis, Centrosema molle, Pueraria phaseoloides and Macroptilium atropurpureum, with the objective of obtaining effective inoculants for such crops in acid soils. For the characterization of the bacterial isolates, their micromorphological, staining and cultural characteristics were studied, as well as some physiologicalbiochemical responses, such as the excretion of acid or base to the culture medium and the cetolactase assay. An in vitro nodulation essay was performed with each legume to determine the effectiveness of the isolates. According to the cultural characteristics, the growth rate in YMA method and the production of acid or base, the isolates obtained could belong to the genera Bradyrhizobium and Rhizobium and/or Sinorhizobium. The cetolactase test allowed to learn that none of the studied isolates belongs to the Agrobacterium genus. The trial with inoculated plants showed that all the isolated strains were effective in nodulation, because they nodulated in the tested legumes. It is concluded that from the isolated strains, 11 could belong to the genus Bradyrhizobium, while the other eight share similar characteristics with the genera Rhizobium and/or Sinorhizobium; all the isolates were effective in nodulation and they can be considered promising strains for obtaining inoculants for the studied forage legumes.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad el uso indiscriminado de productos químicos en la agricultura constituye un problema global. Aunque estos promovieron un incremento considerable de los rendimientos agrícolas durante varios años, ahora son la principal causa de la pérdida de la fertilidad de los suelos, la contaminación de las aguas subterráneas y, en muchos casos, de daños a la salud humana. Esta situación se agudiza con la creciente demanda de alimentos y el agotamiento progresivo de los recursos no renovables de la Tierra. Por ello se hace evidente la necesidad de buscar alternativas que permitan la sostenibilidad agrícola. Es conocida, desde hace más de ciento veinte años, la capacidad de las leguminosas para utilizar el N2 del aire, a través de la eficiente relación simbiótica que se establece entre estas plantas y las bacterias fijadoras de nitrógeno (diazotrofas), según Olivares (2004). El proceso de colonización de estas bacterias, si bien ocurre de forma natural, en ocasiones no resulta del todo eficiente, lo cual se debe, entre otras causas, a que la carga microbiana en los suelos es muy baja, como producto de la erosión. En los últimos años se ha incrementado el uso de rizobios como biofertilizantes, ya que los beneficios para las plantas y el suelo son apreciables. Es por ello que la obtención de cepas de estos microorganismos para diferentes cultivos de leguminosas y que se encuentren adaptadas a diversas condiciones edafoclimáticas, constituye una alternativa económica y ecológicamente sustentable para la agricultura cubana en el mejoramiento de los cultivos, los suelos y los ecosistemas en general. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue el aislamiento y la caracterización de cepas promisorias de rizobio para la producción de inoculantes.

MATERIALES Y MÉTODOS ]]>

Zona de muestreo. La prospección de los nódulos se realizó en las áreas de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes de Cascajal, ubicada en la provincia de Villa Clara, en un suelo Gley nodular ferruginoso (Hernández et al., 1999) de pH 5,1. Prospección de nódulos. Se muestrearon las leguminosas: Canavalia ensiformis (canavalia), Stylosanthes guianensis (stylo), Centrosemamolle (centrosema), Pueraria phaseoloides (kudzú) y Macroptilium atropurpureum (siratro), según la metodologia descrita por Beck, Materon y Afandi (1993). Se tomaron los nódulos de tamaño grande o mediano ubicados en la parte superior de la raíz principal. En todos los casos se escogieron plantas vigorosas en la etapa de la floración, sin indicios de ataque de plagas o enfermedades. Los nódulos fueron conservados adecuadamente para su posterior traslado hasta el laboratorio (Halliday y Date, 1976).

Aislamiento y purificación de los rizobios. La metodología utilizada para el aislamiento de las cepas a partir de los nódulos se ajustó a la descrita por Vincent (1970). Los cultivos se realizaron en medio levadura manitol agar (LMA) y fueron incubados a 28ºC durante 10 días. Se seleccionaron aquellas colonias con características culturales semejantes a los rizobios, que no absorbieran el colorante rojo congo, y se realizaron pases sucesivos de ellas en LMA hasta obtener un cultivo puro. Posteriormente se conservaron en cuñas de este mismo medio a 4ºC. La pureza de los cultivos, así como sus características tintoriales y la morfología de las células, se determinaron mediante la tinción de Gram (Sosa, Elías, García y Sarmiento, 2004). El estudio de las características culturales de las cepas (forma y tamaño de las colonias, color y textura) y de la tasa de crecimiento, se realizó mediante la siembra de cada uno de los aislados en medio LMA a pH 6,8 y se incubaron 10 días a 28ºC. Después se observó mediante un microscopio estereoscópico.

Producción de ácido o base. Se cultivó cada uno de los aislados en medio LMA (pH 6,8) con indicador azul de bromotimol (0,5% en NaOH 0,016N) y en LMA (pH 5,5) con púrpura de bromocresol a igual concentración, incubados a 28ºC, durante diez días, según la tasa de crecimiento de cada una de las cepas. Una vez concluido el crecimiento se observó cambio de coloración en el medio (Sosa et al., 2004).

Ensayo de la cetolactasa. Todos los aislados fueron cultivados en medio levadura-lactosaagar (LLA) y se incubaron a 28ºC, durante tres y siete días de acuerdo con la cepa. Transcurrido este tiempo se añadieron 10 mL del reactivo de Benedict sobre el crecimiento y al cabo de 10 minutos se observó el cambio de coloración del medio.

Ensayo de nodulación. Las semillas se desinfectaron con etanol al 70% y posteriormente con hipoclorito de sodio al 25% (v/v), durante cinco minutos en cada caso; las de siratro se trataron durante 10 min con ácido sulfúrico concentrado. Después de la desinfección, se enjuagaron varias veces con agua destilada estéril y se incubaron en la oscuridad durante 24 horas a 30ºC para su germinación. Las semillas con raíces emergentes (de aproximadamente 1-2 cm) se colocaron en tubos de ensayo que contenían 30 mL del medio Norris y Date (Norris y Date, 1976) semisólido, a razón de una semilla por tubo.

Las semillas de canavalia se sembraron en cubitos que contenían suelo estéril. Las raíces de las plantas se inocularon cinco días después, descargando con micropipeta 1 mL de inóculo a una concentración de 108UFC.mL-1, preparado en medio LMA líquido y en condiciones de agitación, durante 24 horas para las cepas de crecimiento rápido y tres días para las de crecimiento lento.

Cada cultivo se inoculó en la leguminosa de origen y en siratro, utilizada como control de la nodulación. En todos los casos las plantas se mantuvieron en condiciones controladas de luz/ oscuridad de 16/8 horas, a una temperatura de 25ºC y humedad relativa del 70%. Cuatro semanas después se determinó el número de nódulos en las raíces de las plantas y su coloración, como un método visual para conocer su efectividad (FAO, 1985).

]]> RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y purificación. Para la selección de las colonias típicas de este grupo de bacterias, un elemento esencial fue la falta de absorción del colorante rojo congo. Por lo general, las colonias de rizobios se observan blancas o ligeramente rosadas, debido a que no absorben este colorante (Sosa et al., 2004). Como resultado de la selección, se aislaron 19 colonias en total: seis procedentes de canavalia, cuatro de stylosantes y tres de centrosema, kudzú y siratro, respectivamente.

Ensayo de la cetolactasa. Este ensayo resultó negativo en todos los casos, lo que indicó que ninguno de los aislados en estudio pertenecía al género Agrobacterium, muy similar fenotípicamente a las especies del género Rhizobium (Sosa et al., 2004).

Caracterización micromorfológica y cultural. Dentro del grupo de los rizobios se agrupan bacterias que difieren en cuanto a sus características morfológicas, culturales y fisiológicobioquímicas; de ahí que existan nueve géneros. Los más conocidos son: Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium, y los cuatro últimos son los de mayor número de especies descritas (Lloret y Martínez-Romero, 2005).

Para realizar el estudio fenotípico de las bacterias pertenecientes al grupo de los rizobios es necesario tener en cuenta las características de morfología celular y colonial, así como las bioquímicas y fisiológicas, entre otras. El cúmulo de estos datos se evalúa mediante un análisis de agrupamiento (taxonomía numérica) que permite ubicar estos microorganismos en los distintos géneros y especies reportados hasta ahora en la literatura (Wang, Martínez-Romero y López Lara, 2001).

En este trabajo se observó, mediante la tinción de Gram, que la morfología de las células y sus características tintoriales se correspondían con las descritas para este grupo de bacterias: las células eran bacilos Gram negativos, de pequeño tamaño, finos y no formaban esporas. De forma general, estas aparecen en los diferentes géneros de rizobios (Garrity y Holt, 2001). Sin embargo, el estudio de las características culturales y las fisiológicas, así como la producción y excreción de compuestos al medio de cultivo, no es común entre todos los géneros de rizobios.

El estudio de estas características mostró que entre los aislados en estudio existían diferencias morfológicas y fisiológicas que permitían formar dos grupos (fig. 1).

El primer grupo de aislados se caracterizó por ser bacterias de crecimiento rápido, que formaban colonias grandes y mucosas en medio LMA, y excretaban sustancias ácidas. Estas particularidades son comunes en las especies de los géneros de crecimiento rápido Rhizobium y Sinorhizobium, que forman la familia Rhizobiaceae y se caracterizan por presentar colonias grandes de 2-5 mm, circulares, blancas o de color beige, convexas, semitraslúcidas y mucilaginosas (Anon 1994; Wang et al., 2001). Mediante las características estudiadas en este trabajo no fue posible diferenciar estos dos géneros, ya que no existían diferencias fenotípicas entre ellos debido a su cercanía filogenética (Lloret y Martínez-Romero, 2005). Para identificar cada uno de ellos es necesario un estudio más profundo que incluya técnicas genéticas y moleculares. Un segundo grupo de aislados se caracterizópor crecer muy lentamente a partir de los 5-7 días, formar colonias de muy pequeño tamaño, sin producción de mucus y con la excreción de sustancias básicas al medio. Este comportamiento coincide con el descrito para el género de crecimiento lento Bradyrhizobium, el cual forma colonias pequeñas que miden menos de 1 mm, son circulares, secas, rara vez traslúcidas, blancas, convexas y tienden a ser granulosas (Sosa et al., 2004). ]]> Aunque los géneros de rizobios se definen sobre la base de la filogenia de los genes 16S rRNA, algunos tienen características fenotípicas que los distinguen de los demás. El estudio morfológico y fisiológico que comúnmente se lleva a cabo para la caracterización de estos microorganismos, si bien no es definitorio para la clasificación taxonómica de las cepas de rizobios, permite al menos diferenciar géneros muy diferentes fenotípicamente entre sí; tal es el caso de Bradyrhizobium, Mesorhizobium y la familia Rhizobiaceae (Wang et al., 2001).

Es por ello que en este trabajo se proponen, como posibles miembros de la familia Rhizobiaceae (géneros Rhizobium y/o Sinorhizobium), ocho de las 19 cepas de rizobios en estudio; mientras que los 11 restantes posiblemente pertenecen al género Bradyrhizobium.

De las ocho cepas de crecimiento rápido seis se lograron a partir de los nódulos de canavalia y las dos restantes de centrosema y kudzú, respectivamente. Sin embargo, los aislados de crecimiento lento se obtuvieron en todas las leguminosas muestreadas, excepto en canavalia, distribuidos de la siguiente manera: cuatro en stylo, tres en siratro y dos en kudzú y centrosema, respectivamente. Resulta interesante que en centrosema y kudzú se aislaran cepas de diferentes géneros de rizobios, lo cual evidencia la promiscuidad descrita para cierto tipo de leguminosa (Lloret y Martínez-Romero, 2005). Por otra parte, es de destacar que de los nódulos de stylo se aislaron cepas que, por sus características, pudieran pertenecer al género Bradyrhizobium; sin embargo, en la literatura se describe que esta leguminosa es comúnmente nodulada por el género de crecimiento rápido Rhizobium. Debe señalarse que el presente estudio carece de una profundización a nivel molecular, por lo que estos resultados no son definitorios.

Ensayo de inoculación in vitro. Uno de los pasos fundamentales en el aislamiento de células de rizobios es el bioensayo de inoculación invitro. Este permite verificar si realmente el aislamiento corresponde con una cepa de rizobio y, además, si ésta es efectiva en la nodulación.

Todas las cepas evaluadas fueron positivas a la nodulación, ya que nodularon en siratro y en la leguminosa de origen en cada caso; se obtuvieron varios nódulos por planta, de tamaño relativamente grande y de coloración rojiza en su interior. La presencia de la leghemoglobina, enzima que provoca el color rojo, indica la eficiencia de la fijación biológica del nitrógeno (Briones, 2001).

Las cepas aisladas de canavalia fueron efectivas en siratro; sin embargo, no fueron capaces de nodular en condiciones de laboratorio a la leguminosa de origen. Este resultado pudiera deberse a factores abióticos, como la intensidad de la luz, la humedad relativa y otros que influyen en el proceso de fijación biológica. Para asegurar la inefectividad de estas cepas en la nodulación tendrían que realizarse otros ensayos de inoculación in vitro, en condiciones ambientales diferentes.