Composición química, producción de gas in vitro y astringencia en el follaje de Samanea saman (Jacq.) Merrill

Chemical composition, in vitro gas production and astringency in the foliage of Samanea saman (Jacq.) Merrill

1Instituto de Producción Animal, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Maracay 2101, Venezuela.
E-mail: ajojeda99@yahoo.com
2Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Maracay, Aragua. Venezuela
3 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Táchira. Venezuela

RESUMEN ]]> Con el objetivo de determinar la composición química, la astringencia, la producción de gas y la degradabilidad ruminal in vitro de la fracción comestible de Samanea saman, durante el año 2009 se realizaron cinco muestreos (febrero, abril, mayo, junio y octubre) en plantas localizadas en un bosque semicaducifolio tropical en Venezuela. En cada muestreo se consideraron 10 plantas diferentes, cada una como una réplica evaluada en un diseño completamente aleatorizado. No hubo variación (P>0,05) en la MO (94,1 ± 1,5%), la PC (20,1 ± 1,5%), la hemicelulosa (17,5 ± 3,7%), la celulosa (10,5 ± 2,5%), la lignina (11,1 ± 1,8%) y los fenoles totales (2,8 ± 1,1%). De mayo a octubre se observaron los mayores valores (P<0,05) para la EE (5,3 ± 0,8%), la FND (44,8 ± 3,3%), la FAD (16,7 ± 1,9%) y el Ca (1,3 ± 0,2%); mientras que los taninos totales (P<0,05) y condensados (P<0,01) se elevaron en octubre (3,75% y 0,99%, respectivamente). La astringencia no se detectó de febrero a mayo y fue baja de junio a octubre (0,4 ± 0,2 g Eat/100 g de MS). No hubo diferencias en los parámetros b (0,04 ± 0,01 mL/h), To (1,2 ± 0,2 h) y T½ (21,3 ± 3,3 h), con la mayor producción potencial de gas en febrero (63,3 mL/g MS). La degradabilidad de la MO y de la FND se redujeron (P<0,05) en abril (44,7% y 24,7%, respectivamente), sin diferencias para los meses restantes (51,2 ± 3,4% y 37,7 ± 3,3%, respectivamente). La biomasa comestible de S. saman puede ser empleada como una fuente de nutrientes en sistemas silvopastoriles, con una reducida participación de taninos condensados de baja actividad biológica, lo que supone un impacto positivo sobre el flujo de nitrógeno no amoniacal a partir del rumen.

Palabras clave: digestibilidad, Samanea saman, taninos.

ABSTRACT

In order to determine the chemical composition, astringency, in vitro gas production and ruminal degradability of the edible fraction of Samanea saman, during 2009, five samplings (February, April, May, June and October) were conducted on plants located in a semideciduous tropical forest in Venezuela. In each sampling 10 different plants were considered, each as a replicate evaluated in a completely randomized design. OM (94,1 ± 1,5%), CP (20,1 ± 1,5%), hemicellulose (17,5 ± 3,7%), cellulose (10,5 ± 2,5%), lignin (11,1 ± 1,8%), and total phenols (2,8 ± 1,1%) did not show variations (P<0,05). From May to October, the highest values (P<0,05) of EE (5,3 ± 0,8%), NDF (44,8 ± 3,3%), ADF (16,7 ± 1,9%), and Ca (1,3 ± 0,2%) were observed; while total (P<0,05) and condensed tannins (P<0,01) increased in October (3,75% and 0,99%, respectively). Astringency was not detected from February to May, and had limited values from June to October (0,4 ± 0,2 g Eta/100 g DM). No differences were observed in b (0,04 ± 0,01 mL/h), To (1,2 ± 0,2 h) and T½ (21,3 ± 3,3 h) with the highest gas potential production in February (63,3 mL/g DM). The OM and NDF degradability was reduced (P<0,05) in April (44,7% and 24,7%, respectively), without differences during the remaining months (51,2 ± 3,4% and 37,7 ± 3,3%, respectively). The edible biomass of S. saman could be used as a nutrient source in silvopastoral systems, with a low condensed tannin content of low biological activity, which causes a positive impact on the non-ammonia nitrogen flow from the rumen.

Key words: digestibility, Samanea saman, tannins.

Samanea saman (samán, algarrobo, árbol de la lluvia o cenízaro) es una fabácea con fenología típica de las plantas deciduas, originaria de la América tropical y con presencia en África, el sureste asiático y el Pacífico (Durr, 2001). Se reconoce como una planta leñosa de valor forrajero, por su composición química y nutricional (García et al., 2006) y, más recientemente, por sus propiedades funcionales de tipo antimicrobiano (Jagessar et al., 2011). Al igual que ocurre en el resto de las fabáceas arbóreas, a menudo sus potencialidades son limitadas en los sistemas de pastoreo, debido a su menor tasa de crecimiento respecto a las poáceas dominantes, al riesgo de provocar timpanismo por la elevada solubilidad de sus proteínas y a la presencia de una variada gama de metabolitos secundarios (Ramírez-Restrepo y Barry, 2005; García y Medina, 2006).

En las condiciones del trópico seco, donde prevalecen los sistemas integrados basados en el ramoneo o la poda frecuente, el potencial de la fracción comestible de esta planta leñosa depende de factores genéticos y ambientales (Brewbaker et al., 1982). Por ello es de particular importancia generar información acerca de las variaciones que puede mostrar, durante el año, el valor nutritivo de la fracción comestible de esta planta, lo que determinará, en buena medida, su potencial de integración en los sistemas sostenibles de silvopastoreo con rumiantes. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la evolución anual de la composición química, la astringencia, la producción de gas in vitro y la degradabilidad ruminal de la fracción comestible del follaje de S. saman, en un bosque seco tropical semicaducifolio de Venezuela.

Muestreo de la vegetación. La toma de muestras de follaje verde (foliolos, estructuras reproductivas y material leñoso) se efectuó cuando las plantas tenían una altura superior a 1,5 m y más de 5 años de edad, en el horario de las 8:00 a.m., en cinco ocasiones durante el año; se identificaron las fenofases predominantes (Fournier, 1974) en cada muestreo: febrero (senescencia foliar), abril (inicio de fructificación), mayo (brote de las hojas y desarrollo de la fructificación), junio (brote de las hojas y fructificación remanente) y octubre (desarrollo foliar). Las muestras comprendieron la fracción potencialmente disponible para el ramoneo por los vacunos; se colectó la biomasa localizada a una altura igual o inferior a 2 m, y se consideraron solo los tallos con un diámetro inferior a 6 mm (Muller-Dumbois y Ellemberg, 1974). Se utilizaron 10 plantas diferentes en cada muestreo y cada una se empleó como réplica en el análisis estadístico. Una vez colectadas las muestras se trasladaron al laboratorio y se preservaron bajo refrigeración (CO2 en estado sólido), hasta su deshidratación a 40ºC en estufa con ventilación forzada. Posteriormente, se molieron en un molino de martillos, con malla de 1 mm de diámetro de paso, y se preservaron en envases de color ámbar.

Análisis químico. Se determinaron los contenidos de proteína bruta (PB, N x 6,25), extracto etéreo (EE), calcio (Ca) y fósforo (P), por la técnica de la AOAC (1995). Las determinaciones de fibra en detergente neutro (FDN) y ácido (FDA), hemicelulosa, celulosa y lignina ácido detergente (LAD) se efectuaron de acuerdo con la metodología de Van Soest et al. (1991), con la adición de sulfito de sodio para remover parcialmente los complejos taninos-proteína (Terril et al., 1994). La cuantificación del total de fenoles (FT) y taninos (TT) extractables se realizó mediante el método de Folin-Ciocalteu modificado (Makkar, 2001), y los resultados se expresaron como equivalentes (Eat) de ácido tánico (Lab. Merck®). La fracción de taninos condensados extractables (TC) se determinó con el empleo de n-Butanol/HCl/Fe3+ (Porter et al., 1986), y los resultados se expresaron como equivalentes de leucocianidinas (Eleu) en base seca.

Valoración de la astringencia. La astringencia, empleada como un indicador de la actividad biológica de los taninos, se estimó mediante el ensayo de difusión radial (Hagerman, 1987); los taninos extractables se evaluaron en 100 mg de muestra, incubados a 35ºC durante 96 h, en cápsulas de Petri con solución base de agarosa (Sigma® A-6013/ Tipo I: Low EEO), en buffer de acetato y seroalbúmina bovina (Sigma® A-3350) como proteína de referencia. Se construyó una curva patrón con ácido tánico, y los resultados se expresaron en g Eat/100 g muestra en base seca.

Producción de gas y degradación ruminal in vitro. La producción in vitro de gas se midió mediante la técnica descrita por Mauricio et al. (1999), con el empleo de envases de vidrio de 168 cm3, a los que se adicionó 1 g de follaje deshidratado y molido, 90 mL de solución nutritiva (macro y microminerales), solución tampón de bicarbonato de sodio, así como 10 mL del inóculo ruminal colectado de vacas adultas (428 ± 13,1 kg PV) fistuladas en el rumen; estas pastaban en los potreros de gramíneas de mediana calidad (fundamentalmente Cynodon nlemfuensis) y se les suplementó con alimento concentrado a razón de 2 kg/animal/día (2,7%-N, 7,6%-cenizas, 37,2%-FDN y 15,6%-FDA). Se incubaron cuatro envases por cada réplica, a 39ºC; la presión del gas se registró a las 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 96 h, con un transductor de presión (Red Lion®, Modelo DP5-1/8 DIN) acoplado a un lector digital. El volumen de gas (V, mL) se determinó por medio de la transformación de las lecturas de presión a volumen (Mauricio et al., 1999); mientras que los parámetros de la cinética de producción de gas se estimaron con la aplicación de un modelo exponencial, desarrollado por France et al. (1993), con el empleo del procedimiento NLIN de SAS (1994).

Por cada réplica se incluyeron cuatro envases adicionales que permanecieron hasta las 48 h, los cuales se colocaron en baño de maría inverso (4ºC) para detener el proceso de fermentación; después su contenido se filtró en crisoles de vidrio con placas de porcelana porosa (poro #1), previamente pesados. El crisol y su contenido se deshidrataron a 105ºC hasta alcanzar el peso constante, y por diferencia de peso se obtuvo la degradabilidad aparente de la materia orgánica (MOd) y de la FDN (FNDd), corregidas por la inclusión de tres envases sin muestra (blancos).

Diseño del experimento y análisis estadístico. Los resultados se sometieron a un análisis de varianza, de acuerdo con el siguiente modelo:

Yij = m + Ai + ej, donde:

Yij es la variable dependiente;

m es la media; ]]> Ai el efecto debido a la fecha de muestreo; y

ej el error residual.

El análisis estadístico se realizó mediante el procedimiento GLM (General Linear Models) del software estadístico SAS (SAS, 1994). En las variables que presentaron diferencias significativas (P<0,05) las comparaciones entre medias se efectuaron mediante la prueba de Tukey, y el grado de asociación entre variables se estableció a través del coeficiente de correlación de Pearson.

En la tabla 1 se presentan los resultados correspondientes a la composición química y la astringencia de las muestras evaluadas. No se observó variación (P>0,05) en los contenidos de MO (94,1 ± 1,5%), PC (20,1 ± 1,5%), hemicelulosa (17,5 ± 3,7%), celulosa (10,5 ± 2,5%), LAD (11,1 ± 1,8%) y FT (2,8 ± 1,1%). En general, estos valores fueron similares a los señalados para la fracción comestible de esta especie, cuando se desarrolló en diferentes condiciones ambientales (Conklin et al., 1991; Pedraza et al., 2003; García et al., 2006); así como a los de otras fabáceas tropicales (García y Medina, 2006).

El contenido de PC fue superior al de los pastos tropicales naturales e introducidos (Minson, 1990), y se ubicó por encima de las necesidades mínimas de los rumiantes (7-8% en BS), para un óptimo consumo y funcionamiento ruminal (Van Soest, 1994). Los contenidos de EE, FND, FAD y Ca aumentaron de mayo a octubre (P<0,05); mientras que los de TT (P<0,05) y TC se incrementaron durante el mes de octubre. Respecto al P, las muestras mostraron su mayor contenido (P<0,05) en febrero (0,15%) y disminuyeron hasta 0,08% en octubre. No se detectó actividad biológica de los taninos de febrero a abril, aunque en junio y octubre se observó la capacidad de precipitar proteínas de estos metabolitos secundarios, con mayor actividad (P<0,05) durante el mes de octubre (0,50 g Eat/100 g de MS).

S. saman es referida como caducifolia, con una defoliación completa al cabo de uno a tres meses después de iniciada la época seca, y abundantes brotes foliares al inicio del periodo de lluvias (Durr, 2001); sin embargo, este patrón fenológico puede variar en áreas donde el período seco no sea tan marcado (Janzen, 1982), como en la zona donde se desarrolló el estudio. De este modo, la especie mantuvo un comportamiento de planta semicaducifolia, lo cual permitió que la FND y la FAD de la fracción comestible se mantuvieran constantes a través del año, y disminuyeran solo durante el periodo de transición sequía-lluvia (abril-mayo), cuando predominaron los brotes foliares en la biomasa. Durante mayo a octubre, la pared celular mostró una tendencia (P<0,11) a incrementar su nivel de lignificación (12,3 ± 1,16% LAD), lo cual debe ser un factor a considerar en la valoración nutricional de este follaje, debido a la alta correlación negativa entre LAD y el consumo voluntario en los rumiantes (Van Soest et al., 1991).

La relación Ca:P varió desde 3,2:1 (febrero) hasta 18,8:1 (octubre), lo que demuestra la superioridad relativa del follaje de S. saman respecto a las gramíneas tropicales en cuanto al suministro de Ca, con valores ajustados a las necesidades estimadas para los vacunos de niveles medios de producción. Sin embargo, los valores de P (0,12 ± 0,03%) indicaron la necesidad de suplementación para cubrir las necesidades de dicho mineral, cuando se emplee este recurso (NRC, 2001).

No hubo variaciones en el contenido de FT (2,8 ± 1,1%); mientras que TT y TC presentaron una evolución similar en su comportamiento, con las mayores concentraciones (P<0,05) en el mes de octubre (3,75 y 0,99%, respectivamente). Los valores de FT y TT se ubicaron dentro del rango señalado para esta especie (Durr, 2001; García et al., 2006) y para otras plantas leñosas tropicales de valor forrajero (Valerio, 1994; García y Medina, 2006), aunque fueron inferiores a los de especies leñosas forrajeras de los géneros Acacia y Erica (Abdulrazak et al., 2000; Hervás et al., 2003). Estas variaciones han sido ampliamente reportadas no solo entre especies, sino también entre individuos de una misma especie, ya que en la síntesis de estos metabolitos influyen diversos factores, tales como: el clima, la fertilidad del suelo, el grado de madurez de los tejidos y la exposición a defoliadores, entre otros (Wood et al., 1994). ]]> Las cantidades de TC estuvieron en el rango considerado como beneficioso para la nutrición del rumiante, por su capacidad para reducir el riesgo de timpanismo, controlar las infecciones parasitarias y promover el flujo de nitrógeno no amoniacal al tracto posterior (Makkar, 2001); no obstante, fueron inferiores a lo que se esperaba, si se consideran los niveles de FT y lo informado para el follaje de diferentes plantas leñosas no cultivadas (Frutos et al., 2002; Melaku et al., 2010). Aunque no están claros los motivos de los bajos valores de TC, ello pudo deberse a la poca sensibilidad del método empleado para su análisis químico, como consecuencia de una reducida participación de leucocianidinas en la estructura química de la fracción de los polifenoles (Schofield et al., 2001), o a una limitada fijación genética de la síntesis y almacenamiento vacuolar de TC, debido a que el manejo tradicional de estos bosques bajo un esquema de pastoreo estacional no promueve la interacción planta-ramoneador (Launchbaugh et al., 2001). La actividad biológica de los taninos (astringencia) varió en el transcurso del año, lo cual ha sido señalado como una consecuencia de las modificaciones metabólicas asociadas a los cambios fenológicos, que ocurren por la interacción de los factores genéticos y ambientales (Wood et al., 1994). En las condiciones del presente estudio, S. saman debe considerarse un recurso forrajero con taninos de baja actividad biológica, por presentar astringencia inferior a 1 g Eat/100 g de MS (Hagerman, 1987).

Durante el mes de febrero, el follaje presentó la mayor (P<0,05) producción potencial de gas (63,3 mL/g de MS), sin diferencias entre los restantes meses (47,7 ± 6,2 mL/g de MS), como se observa en tabla 2. La degradabilidad de la MO y FND fue menor durante el mes de abril (44,7% y 24,7%, respectivamente), sin diferencias durante el resto de la evaluación (51,2 ± 3,4% y 37,7 ± 3,3%, respectivamente). No se observaron diferencias estadísticas entre los meses para b (0,04 ± 0,01 mL/h), To (1,2 ± 0,2 h) y T½ (21,3 ± 3,3 h). Los parámetros de la producción de gas in vitro en plantas leñosas, citados en la literatura, presentan rangos ampliamente variables, con valores para a (22-149 mL/g DM), b (0,02-0,06 mL/h), To (0,8-4,5 h) y T½ (11-28 h), los cuales muestran el efecto de la edad y el estado fisiológico de la planta, el contenido de metabolitos secundarios y las condiciones ambientales, entre otros (Frutos et al., 2002; Bakhashwain, 2010).

La evaluación in vitro mostró un menor valor nutricional del follaje durante el mes de abril. Si bien este comportamiento no puede ser completamente explicado a través de las determinaciones químicas del presente estudio, Durr (2001) y García et al. (2009) refirieron diversos metabolitos secundarios en la fracción comestible de esta especie (saponinas, alcaloides, inhibidores de tripsina, esteroles, fósforo fítico y mimosina, entre otros), relacionados en grado variable con las limitaciones en la disponibilidad de nutrientes y la actividad enzimática microbial a nivel ruminal y, consecuentemente, con la valoración nutricional de este recurso (Launchbaugh et al., 2001).

En la tabla 3 se muestra la correlación entre las variables químicas y la valoración in vitro del follaje de S. saman. Se observó una relación negativa de la PC con los compuestos fenólicos (FT, TT y TC, P<0,01) y el T½ (P<0,05). Esto, además de reafirmar la relación entre dichos metabolitos secundarios y la fracción nitrogenada del follaje, revela la importancia de la evaluación de sus potenciales efectos adversos en el metabolismo nitrogenado del animal y la tasa de fermentación ruminal (García et al., 2009). La FAD, la hemicelulosa y la celulosa mostraron una relación positiva con las diferentes fracciones de taninos (P<0,05), particularmente FT y TT, debido a la participación de los compuestos polifenólicos como precursores de las reacciones de condensación múltiple, requeridas para la formación de algunos componentes de la pared celular (Hervás et al., 2003).

Se observó una importante relación de los compuestos fenólicos entre sí, fundamentalmente TC con FT (r = 0,95; P<0,01) y TT (r = 0,92; P<0,01). En las condiciones de esta evaluación, y ante la poca reactividad biológica de la fracción de TC, se evidenció la reducida participación de los taninos que precipitan la proteína en el follaje de S. saman, lo que se manifiesta en una limitada presencia de fenoles de elevado peso molecular (Makkar, 2001).

Por otro lado, la ausencia de asociación entre las fracciones de los taninos y los parámetros de producción de gas, y la degradabilidad, confirmaron que en el marco de este estudio los metabolitos secundarios no ejercieron un peso decisivo en la valoración nutricional de la biomasa comestible de S. saman; el contenido de FNDd fue el de mayor importancia y presentó una elevada correlación (r = 0,86; P< 0,01) con la MOd.

Se concluye que la caracterización química, la astringencia, la producción de gas y la degradabilidad in vitro de la biomasa comestible de S. saman, que crecía en un bosque seco tropical semicaducifolio, demostraron el valor forrajero de esta planta perenne y evidenciaron su elevado potencial para ser incorporada en los sistemas silvopastoriles con rumiantes, como una importante fuente de nutrientes en períodos en los que se reduce el aporte de materia seca de las gramíneas. Se recomienda realizar estudios que incluyan el diseño y la evaluación de los sistemas silvopastoriles con la utilización del follaje de S. saman.

Los autores desean expresar su agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero para la realización de esta investigación (Proyecto CDCH N° PG-01-36-4995-2002).

2. Abdulrazak, S.S. et al. Nutritive evaluation of some Acacia tree leaves from Kenya. Anim. Feed Sci. Technol. 85 (1):89 2000.

3. AOAC. Official methods of analysis (16th ed.). Association of Official Analytical Chemist. Washington D.C., USA 1995.

4. Bakhashwain, A.A. Nutritive value assessment of some Saudi Arabian foliages by gas production technique in vitro. Met. Env. & Arid Land Agric. Sci. 21 (1):65 2010.

5. Brewbaker, J.L. et al. Nitrogen fixing tree resources: potentials and limitations. In: Biological nitrogen fixation technology for tropical agriculture. (Eds. P.H. Graham and S.C. Harris). CIAT. Cali, Colombia. p. 413 1982.

6. Conklin, N.L. et al. Ranking twenty-two tropical browse species from Guanacaste, Costa Rica. Turrialba. 41 (5):615 1991.

7. Durr, P.A. The biology, ecology and agroforestry potential of the raintree, Samanea saman (Jacq.) Merr. Agrof. Syst. 51 (3):223 2001.

8. Fournier, L.A. Un método cuantitativo para la medición de características fenológicas en árboles. Turrialba. 24 (4):422 1974.

9. France, J. et al. A model to interpret gas accumulation profiles associated with in vitro degradation of ruminant feeds. J. Theor. Biol. 163 (1):99 1993.

10. Frutos, Pilar et al. Condensed tannin content of several shrub species from a mountain area in northern Spain, and its relationship to various indicators of nutritive value. Anim. Feed Sci. Tech. 95 (3-4): 215 2002.

11. García, D.E. & Medina, María G. Composición química, metabolitos secundarios, valor nutritivo y aceptabilidad relativa de diez árboles forrajeros. Zootecnia Trop. 24 (3):233 2006.

12. García, D.E. et al. Composición química, factores antinutricionales potenciales y valor nutritivo de dos especies del género Pithecellobium. Pastos y Forrajes. 29:177 2006.

13. García, D.E. et al. Caracterización químico-nutricional de forrajes leguminosos y de otras familias botánicas empleando análisis descriptivo y multivariado. Avanc. Investig. Agrop. 13 (2): 25 2009.

14. Hagerman, A.E. Radial diffusion method for determining tannin plant extracts. J. Chem. Ecol. 13 (3):437 1987.

15. Hervás, G. et al. Evolución anual del contenido de taninos del brezo (Erica vagans) y relación con otros parámetros indicativos de su valor nutritivo. ITEA. 99A (1):69 2003.

16. Jagessar, R.C. et al. Selective antimicrobial properties of leaf extract of Samanea saman against Candida albicans, Staphylococcus aureus and Escherichia coli using several microbial methods. J. Americ. Sci. 7 (3):108 2011.

17. Janzen, D.H. Cenízero tree (Leguminosae: Pithecellobium saman) delayed fruit development in Costa Rican deciduous forests. Amer. J. Bot. 69 (9):1269 1982.

18. Launchbaugh, K.L. et al. Herbivore response to anti-quality factors in forages. J. Range Manage. 54 (4):431 2001.

19. Makkar, H.P.S. Quantification of tannins in tree foliage. A laboratory manual for the FAO/IAEA Co-coordinated Research Project on use of nuclear and related techniques to develop simple tannin assays for predicting and improving the safety and efficiency of feeding ruminants on tanniferous tree foliage. FAO/IAEA, Viena. p. 26 2001.

20. Mauricio, R.M. et al. A semi-automated in vitro gas production technique for ruminant feedstuff evaluation. Anim. Feed Sci. Techn. 79 (4):321 1999.

21. Melaku S. et al. Chemical composition, in vitro dry matter digestibility and in sacco degradability of selected browse species used as animal feeds under semi-arid conditions in Northern Ethiopia. Agroforest. Syst. 80 (2):173 2010.

22. Minson, D.J. The chemical composition and nutritive values of tropical grasses. In: Tropical grasses. (Eds. P.J. Skerman and F. Rivers). FAO, Rome. p. 163 1990.

23. Muller-Dumbois, D. & Ellemberg, H. Aims and methods of vegetation ecology. John Wiley & Sons. New York, USA.  p. 547 1974.

24. NRC (National Research Council). Nutrient requirements of dairy cattle. 7th rev. ed. National Academy of Sciences. Washington, D.C., USA. p. 381 2001.

25. Pedraza, R.M. et al.   Nota técnica: Degradabilidad ruminal efectiva y digestibilidad intestinal in vitro del nitrógeno del follaje de leguminosas arbóreas tropicales. Pastos y Forrajes. 26:237 2003.

26. Porter, L.J. et al. The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin. Phytochem. 25 (1):223 1986.

27. Ramírez-Restrepo, C. & Barry, T. Alternative temperate forages containing secondary compounds for improving sustainable productivity in grazing animals. Anim. Feed Sci. Tech. 120 (3-4):179 2005.

28. SAS. User's guide. 4th ed. Statistical Analysis System Institute, Inc. Cary, USA. p. 470 1994.

29. Schofield, P. et al. Analysis of condensed tannins: a review. Anim. Feed Sci. Technol. 91 (19):21 2001.

30. Terril, T.H. et al. Effect of drying method and condenses tannin on detergent fiber analysis of Serica lespedeza. J. Sci. Food Agric. 66 (3):337 1994.

31. Valerio, Silvia. Contenido de taninos y digestibilidad in vitro de algunos forrajes tropicales. Agroforestería en las Américas. 1 (3):10 1994.

32. Van Soest, P.J. Nutritional ecology of ruminants. 2nd ed. Cornell University Press. Ithaca, USA 1994.

33. Van Soest, P.J. et al. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and non starch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy Sci. 74 (10):3583 1991.

34. Wood, C.D. et al. Interspecies differences and variability with time of protein precipitation activity of extractable tannins, crude protein, ash, and dry matter content of leaves from 13 species of Nepalese fodder tress. J. Chem. Ecol. 20 (12):3149 1994.