Bases conceptuales para la estimación del vigor de las semillas a través de indicadores del crecimiento y el desarrollo inicial

¹Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey". Central España Republicana, CP 44280, Matanzas, Cuba
E-mail: marlen.navarro@indio.atenas.inf.cu
²Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba

RESUMEN

Se evaluaron, con métodos apropiados, los aspectos de la calidad de la semilla a través del estudio de la germinación, la viabilidad, la dormancia y el envejecimiento. La forma de almacenamiento en condiciones no controladas fue la seleccionada, por su prevalencia en los almacenes convencionales existentes en el país. Los resultados del trabajo condujeron a evaluar los métodos de escarificación como elementos que contribuyen a la ruptura de la dormancia. Además, permitieron tener un conocimiento más objetivo y preciso del vigor, debido a que se logró un equilibrio aceptable entre los elementos biológicos y matemáticos que se utilizaron. Al valorar en su conjunto los diferentes elementos de los estudios realizados, se propone considerar las bases conceptuales para la estimación del vigor de las semillas de especies de leguminosas tropicales arbustivas y arbóreas, u otras especies con características seminales similares en cuanto a la morfología y el comportamiento.

Palabras clave: germinación, semilla, viabilidad de la semilla.

An evaluation was made, with adequate methods, of the seed quality aspects through the study of germination, viability, dormancy and ageing. Storage under uncontrolled conditions was the form selected, due to its prevalence in the existing conventional storehouses in the country. The results of the work led to evaluate the scarification methods as elements which contribute to dormancy breakup. In addition, they allowed having more objective and accurate knowledge of vigor, because acceptable balance was achieved between the biological and mathematical elements used. When evaluating as a whole the different elements of the studies conducted, to consider the conceptual bases for estimating the vigor of seeds from tropical shrub and tree leguminous species, or other species with similar seed characteristics regarding morphology and performance is proposed.

Key words: germination, seed, seed viability.

La aplicación de conceptos esquemáticos y no integrales en el tratamiento que se les debe dar a las plantas en cualquier etapa de su vida puede conducir a decisiones graves en los trabajos de investigación y de producción, por lo que es importante evitar que esto ocurra. De tal forma, se alcanzarán resultados más objetivos, estables, universales, prácticos y de influencia directa en la sociedad en la que nos desenvolvemos.

Respecto al concepto y los procesos vinculados al vigor de las semillas, se especula y se debate profusamente (Delouche, 1976; McDonald, 1980; Perry, 1981; Steiner, 1990; Murcia, Peretti, San Martin y Pereyra, 2001; Shah, Watson y Cabrera , 2002). Una de las ideas es que las pruebas de vigor se desarrollan con la finalidad de ofrecer solo información complementaria a la obtenida por la prueba de germinación y que, a su vez, permiten estimar el potencial de la emergencia en el campo, en una amplia gama de condiciones ambientales (Barros, Nunes, Fernandes y Bhering, 2002; Costa y Carvalho, 2006).

Las investigaciones relacionadas con el vigor y la confección de metodologías apropiadas para su medición enfatizan en las especies hortícolas de diferentes ambientes, principalmente en áreas de clima templado. Sin embargo, el trabajo en esta dirección es muy escaso en especies tropicales pratenses y más aun en leguminosas de hábito de crecimiento arbustivo y arbóreo (Bonner, 1998; Tekrony, 2003; Tekrony, 2006).

Por ello, el objetivo de este trabajo fue realizar estudios que permitieran crear las bases conceptuales para medir el vigor de las semillas, a través de indicadores del crecimiento y el desarrollo inicial, apoyados en investigaciones diseñadas con esos fines en la especie Albizia lebbeck (L.) Benth. Se seleccionó esta leñosa perenne como especie «modelo»debido a la dormancia de sus semillas, la cual es provocada por factores físicos (Navarro y Mesa, 2005), al igual que sucede en un gran número de especies de leguminosas tropicales y subtropicales presentes en los sistemas de producción de la región.

Con este estudio, se pretendió crear un mecanismo estable, que permitiera la reproducibilidad de un resultado de manera confiable, al emplear métodos biológicos y matemáticos, sobre la base del análisis interactivo de elementos básicos cualitativos y cuantitativos que intervienen en el desarrollo de una semilla. ]]>  

La detección del deterioro de las semillas a través de las pruebas de vigor puede ser entendida como un componente importante en la evaluación de elementos de la calidad, y contribuye a la solución de problemas de la industria semillera, como el almacenamiento. Al respecto, Alizaga, Sterting y Herrera (1992) aseveran que el principal desafío de las investigaciones sobre pruebas de vigor es la identificación de indicadores relacionados con el deterioro, que preceden a la pérdida de la capacidad germinativa.

Si bien el comité de vigor de la Asociación Internacional para el Análisis de Semillas (ISTA) sugiere los protocolos de algunas pruebas de uso ya generalizado (ISTA, 1995; ISTA, 2001), debido a la difícil estandarización de algunas pruebas, es necesario realizar ensayos para conocer la respuesta de las semillas a las condiciones locales de siembra.

No obstante, en los últimos 50 años los especialistas en semillas propusieron, estudiaron y utilizaron diferentes métodos para evaluar el vigor. La excelencia de las investigaciones demostró que se ha diversificado el acercamiento a la estimación de este indicador y, como consecuencia, su integralidad, por lo que se necesita volver a encauzar los objetivos de las pruebas de vigor para alcanzar las metas que se proponen, ya que solo se utilizan internacionalmente algunos métodos. El comité de vigor de la ISTA concentró sus esfuerzos en la estandarización de nueve pruebas, mientras que la AOSA sugirió o recomendó los procedimientos para siete métodos.

Además, el vigor muchas veces se maneja de forma empírica o mediante la utilización de solo una o dos variables. En este trabajo se aplicó tal concepto y se le adjudicó una expresión más integral y dinámica. Los elementos (variables) seleccionados son expresiones biológicas del crecimiento y el desarrollo, y se les dio un contenido y expresión matemáticos para precisar su comportamiento.

Es de destacar que el almacenamiento se valoró como un elemento de envejecimiento y deterioro, y como expresión dinámica de todas las variables, aspecto de crucial importancia y que ratifica la correspondencia entre el método propuesto y el estado del arte en el tema objeto de estudio.

Ferguson (1995), en su intento por conceptualizar el vigor, expresó que este se basa en el comportamiento físico o fisiológico de un lote de semillas, e incluye: 1) los cambios en los procesos bioquímicos, 2) la tasa y uniformidad de la germinación y el crecimiento de las plántulas, y 3) la germinación o capacidad de emergencia de las semillas al ser expuestas a condiciones de estrés. A continuación se explica la manera en que estos argumentos se relacionaron con la secuencia de estudios, así como la intención de realizarlos.

1) Cambios en los procesos bioquímicos.

La manifestación visual de los cambios bioquímicos que ocurrieron puede ser valorada mediante el comportamiento de la viabilidad (Taiz y Zeiger, 2006), y se explicará en el epígrafe "Procedimiento y secuencia de trabajo". ]]> 2) Tasa y uniformidad de la germinación y el crecimiento de las plántulas.

La tasa y la uniformidad de la germinación y el crecimiento de las plántulas se abordaron de manera integral, a través de la selección y el análisis de las variables que se midieron durante la prueba de emergencia de las plántulas. La originalidad del método que se propone es integrar variables del crecimiento y el desarrollo, medidas en condiciones ambientales, es decir, en las condiciones reales del campo y no en locales acondicionados, como señaló Bennett (2002). Se empleó como unidades experimentales bolsas aviveradas, con un sustrato compuesto de suelo y estiércol ovino este se puede encontrar en cualquier unidad productiva de Cuba que se dedique a la actividad agropecuaria, dígase finca o banco de semilla.

El hecho de que casi todas las variables tuvieran un alto grado de preponderancia, explicada fundamentalmente en la primera y en la segunda componente principal, indica lo acertado de la selección (Navarro, 2009). Muchas de ellas pueden contribuir a explicar el vigor con más precisión e integralidad. Aunque al emplear el análisis de componentes principales se pretendía discriminar algunas variables, esto no fue posible ni es recomendable debido a que todas estuvieron expresadas en las dos componentes con un alto grado de preponderancia.

A continuación se explica cada una de las variables para las etapas de germinación, emergencia y crecimiento de las plántulas.

A partir de los registros diarios en el vivero experimental se interpretaron las siguientes variables, las cuales, a su vez, conformaron las evaluaciones realizadas en la primera y la segunda fase de experimentación.

Primera fase: germinación y emergencia de las plántulas.

a) Días para el inicio de la emergencia IE (Edwards, 1980).

b) Porcentaje de emergencia final para el período de la prueba Emer (Perry, 1984).

c) Día pico: en el que se observó la mayor cantidad de plántulas emergidas DP (Murillo, 1998). ]]> d) Emergencia pico: porcentaje máximo de emergencia observado en un mismo día EP (Murillo, 1998).

e) Valor de la germinación (VG), determinado mediante la fórmula propuesta por Djavanshir y Pourbeik (1976).

Donde:

Ved: velocidad de la emergencia diaria, calculada como el porcentaje de la emergencia acumulada entre el número de días desde el inicio de la prueba.

N: frecuencia o número de Ved que se calcularon durante la prueba.

Ef: porcentaje de emergencia de las plántulas al final de la prueba.

f) Energía de la germinación (Ener), tipificada por el valor más alto de la velocidad de emergencia diaria durante la prueba (Czabator, 1962).

g) Tasa de emergencia (TE) expresada en porcentaje de emergencia.d-1 (El-Kassaby, Edwards y Taylor 1992).

Segunda fase: crecimiento de las plántulas.

a) Altura de la plántula (cm): se utilizó una regla graduada. ]]> b) Largo del sistema radicular (cm): igual al anterior.

c) Longitud del hipocótilo (cm): se utilizó un pie de rey.

d) Peso fresco del sistema radicular (g): se empleó una balanza analítica con precisión de 0,001 g y los datos se expresaron en gramos por plántula.

e) Peso fresco de la parte aérea (g): igual al anterior.

Dichas variables se seleccionaron a partir de los criterios de diferentes autores (los cuales se encontraban dispersos en la literatura) sobre la relación de cada una de ellas con la expresión del vigor de las semillas y, por ende, con la calidad.

Esta relación se basa en que ellas describen y caracterizan el desempeño de las semillas en las condiciones reales de siembra. Asimismo, permiten estimar el potencial de emergencia de las plántulas en el campo, con el inevitable efecto de las condiciones ambientales; este aspecto, si no se considera, podría limitar el resultado certero, en función de la expresión dinámica del crecimiento y el desarrollo vistos en el tiempo.

3) Germinación o capacidad de emergencia de las semillas al ser expuestas a condiciones de estrés.

En el caso de la germinación o capacidad de emergencia de las semillas también se introdujeron elementos novedosos. La técnica para provocarles estrés, sin necesidad de utilizar cámaras de envejecimiento ni soluciones salinas o bajas temperaturas, fue simple. El almacenamiento al ambiente y los tiempos evaluados (desde 0 hasta 12 meses) constituyeron el método estresante, basado en que, como mecanismo natural para asegurar las sucesiones vegetales (según planteó Walters, 1998), las semillas impermeabilizan sus cubiertas (pérdida del agua intracelular) y con ello provocan una mayor resistencia a la renovación del crecimiento. Esto se relaciona con el tiempo de almacenamiento.

Por otra parte, las condiciones ambientales del almacén están vinculadas con los cambios en el contenido de humedad (CH), debido a la propiedad de las semillas de ser higroscópicas (Taiz y Zeiger, 2006), es decir, tratan constantemente de equilibrar su CH con la humedad relativa ambiental (Chai,Ma, Li y Du, 1998). Se conoce que al aumentar el CH se puede presentar más aceleradamente el fenómeno de deterioro o envejecimiento (McDonald, 2006), con el subsiguiente cambio en su fisiología (merma de sustancias de reserva, aberraciones cromosómicas, entre otras), además de estar expuestas al ataque de plagas de almacén. Todo ello fue descrito y ejemplificado por Harrington (1972). ]]> En los almacenes de Cuba, que poseen condiciones ambientales, las semillas están expuestas a los cambios de temperatura y humedad relativa del ambiente (Navarro y Lezcano, 2007), debido a que los envases que se emplean son permeables.

Procedimiento y secuencia de trabajo

- Viabilidad

De acuerdo con Besnier (1965), la viabilidad es la capacidad de las semillas para germinar en condiciones adecuadas de temperatura, agua, oxígeno y luz. Para hacer una estimación rápida de este indicador se utilizó el ensayo topográfico de tetrazolium (AOSA, 2005). Se empleó como reactivo para esta prueba una solución acuosa de cloruro de 2,3,5-triphenyl tetrazolium (pH 6,5-7,5) al 1,0% de concentración. Se establecieron cuatro repeticiones de 100 semillas cada una, las cuales se colocaron a embeber en dicha solución acuosa, que actuó como un indicador de los procesos de reducción que tienen lugar dentro de las células vivas. En la evaluación de la viabilidad, para el cálculo y la expresión de los resultados, se consideraron las reglas internacionales que rigen el trabajo en esta prueba bioquímica (ISTA, 1999). La evaluación se basó en la coloración que toman las diferentes estructuras embrionarias.

- Germinación

La germinación puede definirse como aquellos eventos que comienzan con la captación de agua por la semilla y finalizan con la elongación de los ejes embrionarios, es decir, la radícula y la plúmula (Bewley, 1997). La aparición de la radícula a través de las cubiertas seminales es el primer indicio visible de la germinación (Nonogaki, 2006).

Para el montaje de la prueba de germinación se emplearon cápsulas de Petri u otro recipiente adecuado, con 184 gramos de arena de río lavada y desinfectada como sustrato inerte y, en el momento de la siembra, se aplicaron 48 mL de agua (a temperatura ambiente), cantidad que se ajusta al valor de la capacidad de saturación de la arena. En cada evaluación las cápsulas se mantuvieron en cabinas, en condiciones controladas (luz, temperatura y humedad) durante 21 días, de acuerdo con lo normado por el ISTA (1999) para las semillas de árboles y arbustos tropicales. Se usaron cuatro repeticiones de no más de 100 semillas cada una. A medida que la semilla germinó se eliminó de la cápsula.

En cada evaluación la posición de las cápsulas de Petri se cambió cada tres días, con el fin de disminuir los errores experimentales (Murillo, 1998; Yang, Lovett-Doust y Lovett-Doust, 1999). La metodología puede desarrollarse en vivero.

- Emergencia ]]> Se considera que la plántula está emergida cuando en la superficie del sustrato se observan los cotiledones fuera de la envoltura seminal, debido al alargamiento y erección del hipocótilo (Besnier, 1965).

Para evaluar la emergencia de las plántulas se realizaron siembras en el vivero, en bolsas que contenían un sustrato compuesto por una mezcla de suelo Ferralítico Rojo y estiércol ovino totalmente descompuesto y seco, en partes iguales (1:1), u otro material orgánico. En cada evaluación se emplearon cuatro réplicas (bolsas) de 100 semillas y se realizaron conteos diarios durante 21 días; el riego se hizo a saturación. Se aplicaron los tratamientos de escarificación húmeda y seca propuestos por Navarro, Febles, Torres y Noda (2010a).

- Crecimiento de las plántulas

Para las mediciones durante el crecimiento y desarrollo inicial de las plántulas se sembró en el vivero y se siguió el mismo procedimiento descrito en la prueba de emergencia, con la diferencia de que todas las variables se midieron a los 30 días posteriores a la siembra; para ello se seleccionaron 10 plántulas en cada una de las cuatro repeticiones en cada evaluación (tiempo de almacenamiento), para los métodos de escarificación presiembra descritos por Navarro, Febles, Torres y Noda (2010b).

Se desarrolló un procedimiento original e integrado para la evaluación del vigor de las semillas, generado por las mediciones realizadas a las variables en el vivero durante la prueba de emergencia de las plántulas (primera fase) y la prueba de crecimiento de estas (segunda fase), el cual consistió en:

1. Seleccionar las variables relacionadas con el vigor, que aparecen descritas posteriormente, según el criterio integrado de diversos autores.

2. Caracterizar el comportamiento de los métodos de escarificación presiembra más adecuados y que están destinados a eliminar la dormancia.

3. Evaluar cada variable, en un momento inicial y durante los 12 meses subsiguientes (periodo de almacenamiento). El primero representó el inicio del almacenamiento (semillas recién cosechadas), y los posteriores, las semillas almacenadas en condiciones ambientales no controladas, etapa en la cual fue de interés evaluar la eficiencia de los tratamientos presiembra y su relación con el vigor de las semillas.

4. Comparar los cambios ocurridos en el vigor (calidad) durante el almacenamiento de las semillas, a partir de las variables. ]]>  

Para el procesamiento de la información en las dos fases anteriores, se utilizó la adecuación del modelo de Torres, Benitez, Lizazo y Álvarez (2007). Se empleó la combinación de dos técnicas multivariadas para explicar la variabilidad y la expresión del vigor, según los pasos siguientes:

a. Con los datos obtenidos de las evaluaciones en el vivero durante un año se construyó la matriz de datos a procesar.

b. Comprobación de las premisas de aplicación de los métodos multivariados.

c. Identificación del orden de importancia de las variables en la explicación de la variabilidad del vigor.

d. Clasificación de las evaluaciones, según los métodos de escarificación (presiembra), de acuerdo con los criterios: índice de eficiencia y formación de los grupos.

La evaluación del vigor durante la germinación, la emergencia y el crecimiento de las plántulas consta de dos partes: la expresión del vigor puntualmente y el vigor visto en el tiempo a través del almacenamiento, cuya conjugación se logró con el desarrollo de un índice denominado "índice de eficiencia"; este indica, mediante artificios matemáticos multivariados, la relación entre el desenvolvimiento de las variables medidas y los períodos de almacenamiento. Es así que la eficiencia de los tratamientos presiembra empleados también proporciona la información acerca del comportamiento del vigor, luego de la aplicación de uno u otro indistintamente.

Para conocer la importancia y la eficiencia del comportamiento global de las variables para cada tiempo de almacenamiento, independientemente del método de escarificación, se decidió que el término estadístico denominado por Torres et al., (2007) como "índice de impacto" se debe interpretar como índice de eficiencia de las variables evaluadas en los tiempos de almacenamiento, en su relación con la variabilidad del vigor.

El índice de eficiencia fortaleció y amplió la concepción y los resultados de este trabajo en la estimación del vigor; en él se creó una combinación de los tiempos de almacenamiento evaluados dentro de cada método presiembra. Este índice depende de las variables de mayor preponderancia; los valores positivos más altos indican cuáles tienen más influencia en cada tiempo de almacenamiento particular para cada método presiembra estudiado. Los valores negativos más altos indican lo contrario. ]]> Alrededor del valor del índice de eficiencia positivo más alto, que se corresponde con un tiempo de almacenamiento determinado, deben estar los otros tiempos, que pueden presentar un comportamiento similar y aceptable del vigor. Para verificar esta consideración hay que hacer un análisis de conglomerados, que agrupa los tiempos de almacenamiento, según el mejor o peor comportamiento de las variables. A partir de aquí se conforman grupos y en cada uno se aprecia la expresión de estas variables. A este nivel, el investigador tiene más probabilidad de elegir, de manera global e integral, cuál tratamiento presiembra específico debe dar a o no a sus lotes de semillas, con un mayor grado de confiabilidad y lógica por la relación de esta selección con el vigor.

Las semillas de mayor vigor son aquellas que, en las evaluaciones, presentan las mejores expresiones de las variables identificadas como de mayor preponderancia en el ACP, es decir, los valores positivos más altos para el índice de eficiencia (EfCP); así como los promedios más altos de dichas variables dentro del grupo en que se ubicaron, según el análisis de conglomerados. Lo contrario ocurre en las de menor vigor, y las de vigor medio tienen un comportamiento intermedio. Hasta el momento, y mientras no se diseñe un programa interactivo (software) que permita procesar automáticamente todos estos pasos, la apreciación del evaluador es determinante.

De todo lo anterior se deriva que el vigor siempre está presente en diferente grado de intensidad. De ahí que las semillas se clasificaran en las de vigor alto, medio y bajo.

Mediante las variables biológicas de la germinación y la emergencia, y con el empleo de mecanismos matemáticos, se logró definir para cada tratamiento presiembra:

1. Cuáles son las variables más relacionadas con el vigor.

2. En qué momento del almacenamiento de la semilla existe una mayor contribución de las variables seleccionadas.

3. Cuáles fueron los grupos, en cuanto a tiempo de almacenamiento (evaluaciones), con un comportamiento similar en cuanto al vigor.

Los tres razonamientos anteriores indican que la medición del vigor es aplicable a semillas de cualquier especie y con diferentes tiempos de almacenamiento. Además, permiten decidir qué tratamiento presiembra se debe utilizar y, como consecuencia, tener más seguridad y éxito en la plantación que se realice con cada lote de semilla.

Los experimentos tuvieron una visión y una estrategia integradoras, lo que constituye un enfoque original y novedoso para la estimación del vigor; esto se basa en las siguientes consideraciones. ]]> La prueba de envejecimiento acelerado (EA) para determinar el vigor es una de las que más se realizan a nivel internacional, y es necesario estandarizarla para cada especie. La clave está en el período de exposición de las semillas al envejecimiento, lo cual se logra mediante ensayos con varias temperaturas y números de horas de permanencia en la cámara de envejecimiento. Una de sus deficiencias radica en que, en dependencia de la especie para una misma temperatura, el aumento del período de exposición proporciona ganancias en los porcentajes del contenido de agua de las simientes. Para contrarrestar este factor, se sugiere el uso de soluciones saturadas de sales (NaCl, KCl o NaBr) durante la realización de la prueba, con el objetivo de reducir la humedad relativa en el interior de los compartimientos individuales, con lo que se retarda la absorción de agua por la semilla. Esta modificación se denomina "test de envejecimiento acelerado con uso de soluciones saturadas de sal" (SSAA por sus siglas en inglés) y fue propuesto por Jianhua y McDonald (1996).

A pesar de los diversos estudios en cuanto a la temperatura y los períodos adecuados de exposición de la prueba de EA, no se ha llegado al consenso entre los investigadores y existe una carencia de información sobre varias especies de interés económico (Marcos Filho, 1999) y acerca de cómo estandarizar las diferentes partes del método.

En la literatura predominan investigaciones en las que el uso de varios períodos de exposición indicó diferencias de vigor entre las muestras evaluadas, debido a que un período determinado puede causar grados de estrés mucho más drásticos que los enfrentados por las semillas durante el transporte y el almacenamiento, y en las condiciones de siembra en campo (Lima, Athanázio y Bellettini, 2006).

Es necesario eliminar estos inconvenientes, y resulta importante lograr grados de estrés en correspondencia con las condiciones a las que serán expuestas las semillas y las plántulas durante la siembra y el establecimiento. El almacenamiento en condiciones ambientales visto en el tiempo, o lo que es igual, analizado mensualmente de inicio a fin, se enfoca como diferentes grados de estrés. La conducción de la prueba de emergencia de plántulas en viveros a pleno sol en la propia finca o en el banco, la medición de variables estrechamente interconectadas con el vigor de las semillas y, posteriormente, el análisis integrador de los resultados conducirán a resultados más precisos sobre el vigor de las semillas y, por ende, a su potencial de almacenamiento y calidad. De ello se deduce que la velocidad de expresión de las variables es fundamental para estimar el vigor.

Los resultados permitieron tener un conocimiento más objetivo y preciso del vigor, debido a que se logró un equilibrio aceptable entre los elementos biológicos y matemáticos utilizados. Este nuevo enfoque para la estimación del vigor permitió llegar a un concepto integrado y dinámico, en el que este indicador puede ser considerado como la interacción de aquellas propiedades bióticas y abióticas (las expresiones de la viabilidad, la dormancia, la germinación y la emergencia) que influyen en las semillas y determinan el nivel de actividad y su comportamiento en el tiempo. Por ello, el vigor no se puede desvincular de la calidad de las semillas.

Se recomienda continuar los estudios en esta temática, para desarrollar una metodología de trabajo de estimación del vigor de las semillas asequible a los técnicos de las fincas y bancos de semilla, que les permita tomar decisiones en la aplicación o no de un tratamiento presiembra en el campo.

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