Centro de Histoterapia Placentaria

Aislamiento de polisacáridos a partir de cordones umbilicales humanos

Guillermo Lago,1 Gabriel Coto2 y Loida Oruña3

Resumen

Se realizó el aislamiento y caracterización de polisacáridos obtenidos a partir de cordones umbilicales humanos mediante una modificación a la técnica de Danishevsky y Bella. Se trataron los cordones con solución de cloruro de sodio bajo condiciones de temperatura y agitación controlada y se precipitaron los polisacáridos mediante la adición de una disolución de bromuro de cetiltrimetilamonio al 1 %. Se resuspendió el sedimento obtenido en una solución de cloruro de sodio 0,4 mol/L eliminando algunas impurezas que no se solubilizan a esta fuerza iónica mediante centrifugación y se precipitó el producto de interés mediante la adición de etanol al sobrenadante, caracterizándose por métodos químicos. El producto puede ser empleado como materia prima para obtener un gel cicatrizante en la Industria Médico-Farmacéutica.

DeCS: POLISACARIDOS/aislamiento & purificación; CORDON UMBILICAL; TECNICAS PARA INMUNOENZIMAS; SULFATO DE AMONIO.

En la actualidad tiene gran importancia el aislamiento de polisacáridos con actividad biológica a partir de fuentes naturales entre las que se pueden mencionar el humor acuoso, humor vítreo, piel, fluido pleural, crestas de gallo y del cordón umbilical de donde se pueden extraer un grupo importante de estos principios activos de elevado peso molecular de gran utilidad para el hombre.1,2

En años recientes se han logrado aislar estos principios activos de otras fuentes como puede ser la pulpa de mandíbulas de ratas, ricas principalmente en ácido hialurónico (AH) y otros proteoglicanos (proteínas ligadas a polisacáridos).3 ]]>
Los polisacáridos de cordón umbilical conocidos también como glucosaminoglicanos, son polímeros lineales formados por unidades de azúcares no reductores.1,4 A este grupo pertenecen la sal sódica del AH. , sulfatos de condroitina (SCh), sulfatos de heparina (SH), sulfato de queratina (SQ) y la heparina (H).4

Se conoce que la mezcla de estos azúcares y principalmente el AH tiene acción cicatrizante. Algunos avances recientes han demostrado que tienen múltiples funciones en la migración de queratinocitos y en la diferenciación durante la reepitelización, por tanto pueden modular la acción cicatrizante.4-6 Los estudios morfométricos e histopatológicos realizados en el Centro de Histoterapia Placentaria empleando un modelo en ratas con el uso de una formulación que contiene AH y otros polisacáridos sulfatados han demostrado la acción de estos como cicatrizantes; se conoce que los polisacáridos sulfatados y la glucosamina pueden sinergizar la promoción y síntesis de ácido hialurónico.7 Los glucosaminoglicanos como el AH pueden ser utilizados en el tratamiento de procesos reparadores hísticos de evolución clínicamente tórpida, por ejemplo en las úlceras venosas conocidas también como flebostáticas en las extremidades inferiores. Este último uso ha sido poco estudiado y es de interés por su novedad. Por otro lado se conoce que los azúcares de pequeño tamaño u oligosacáridos derivados del AH pueden inhibir la maduración de los monocitos humanos que son los responsables de la producción de las citokinas como son las interleukinas 1 ß (IL-1 a) y/o el factor de necrosis tumoral (TNF a); por lo que se dice que la presencia del AH solo o mezclado aun en pequeñas dosis puede tener acción cicatrizante y antiinflamatoria.8

El presente trabajo tiene como objetivos el aislamiento y caracterización de una materia prima que contiene AH, la cual tiene posibilidades de ser empleada en la elaboración de un gel cicatrizante de uso tópico.

Métodos

Aislamiento del producto a partir de cordón umbilical humano. Se tomó 500 g de cordones umbilicales previamente lavados a los cuales se le añadió 4 L de solución de cloruro de sodio calidad farmacéutica al 0,2 % de la firma Quimivita, y se agitó mecánicamente durante 24 h a temperatura de 2-8 oC. Estos cordones provienen de placentas humanas que son debidamente evaluadas desde el punto de vista de su control viral antes de su aprobación para su empleo. En el momento del parto se recoge la sangre del cordón umbilical y se obtiene el suero en dobles bolsas de nylon para el control del VIH y hepatitis B y C, mediante los correspondientes ensayos inmunoenzimáticos que se desarrollan en el laboratorio de control viral del Centro de Histoterapia Placentaria, como son los procedimientos para la detección del antígeno de superficie para la hepatitis B en suero (ACI 10.001.99), el procedimiento para la detección de anticuerpos al virus de la hepatitis C, VIH 1 y VIH 2 en suero humano (ACI 19.002.99) y el procedimiento para realizar la prueba confirmativa de muestras repetidas con el UMELISA HBsAg (ACI 19.003.99).

La solución salina se separó de los restos de tejido con el empleo de gasa y más tarde se le añadió 0,3 L de una solución de bromuro de cetiltrimetilamonio (BCTA) p.a. de la firma Readel D´ Haën al 1 %. ]]>
El producto sólido que se obtuvo en el paso anterior se separó de la solución madre mediante centrifugación a 4 420 x g. Este se resuspendió en solución de cloruro de sodio también de calidad farmacéutica a concentración de 0,4 mol/L con el objetivo de romper el complejo formado por el BCTA-AH y se centrifugó a la misma velocidad. Al sobrenadante obtenido del paso anterior se le añadió 3 volúmenes de etanol al 96 % calidad comercial y después de 1 h se centrifugó. El sedimento, de aspecto pastoso, se sometió a diferentes ensayos para su caracterización desde el punto de vista químico mediante la determinación de proteínas totales (proteínas libres y ligadas a polisacáridos), hialuronato de sodio, sulfatos, humedad y la identificación cualitativa de hexosaminas.

Técnicas analíticas de control

Determinación de hialuronato de sodio. La determinación de hialuronato de sodio se realizó según la técnica de Blumerk9 empleando un patrón de hialuronato de sodio p.a. de la firma Fluka. El método se basa en la reacción de los ácidos urónicos presentes en una muestra, previamente tratada con metahidroxibifenilo bajo condiciones de temperatura controlada. Es necesario un tratamiento previo de la muestra mediante extracciones con cloroformo o fenol/acetato de sodio para eliminar el resto de los polisacáridos que pueden formar asociaciones covalentes con las proteínas.10,11 Este método fue postulado primero por Balazcs12 en sus trabajos de aislamiento de AH ultrapuro y más tarde Brun13 lo utiliza como método auxiliar de análisis de fluido sinovial.

Por lo anterior, se tomó 80 mg del producto en estudio obtenido a escala de banco y se resuspendió en 100 mL de agua desmineralizada y hervida. Estos se trataron 4 veces con cloroformo, desechando la fase clorofórmica y la interfase en la que se eliminan los lípidos, proteínas libres y asociadas con polisacáridos.12 Se aprovecha la fase acuosa para realizar el ensayo de Blumerk cuyos resultados se expresan en miligramo por mililitro pero por comodidad y con fines comparativos estos se convierten en tanto por ciento según la expresión:

]]> % AH=(AH)*100/C

donde:
AH: concentración de AH (mg/mL).
C: concentración de muestra inicial (mg/mL).

Determinación de la humedad. Se empleó la técnica para la determinación de humedad según el manual del AOAC.14

Determinación de la concentración proteica. Se empleó la técnica de Bradford15 la cual permite cuantificar el nivel de proteínas totales (libres y ligadas a polisacáridos). Se pesó 120 mg del producto y una vez disuelto en 50 mL de agua desmineralizada y hervida se le realizó la determinación. Los resultados se expresan en miligramo por mililitro, pero por comodidad y con fines comparativos se llevan a tanto por ciento en peso según la expresión:

% P = (Prot)*5000/(P. muestra)

donde:

% P: composición de proteínas libres y ligadas a polisacáridos expresada en tanto por ciento. ]]> Prot: composición de proteínas libres y ligadas a polisacáridos (mg/mL).
P. muestra: peso de la muestra.

Determinación cualitativa de hexosaminas. Se desarrolló el ensayo cualitativo de Elson-Morgan16 basado en la reacción de la fracción de hoxosaminas presente en los polisacáridos con el N,N dimetil-aminobenzaldehído en medio ácido a temperatura entre 65-70 oC.

Determinación de sulfatos. Este análisis se realizó para determinar la presencia y la concentración de posibles polisacáridos sulfatados.17 La muestra (5 g) se secó en la estufa a 80 oC hasta peso constante, para eliminar el agua retenida en su estructura molecular, y de estos residuos secos se tomó 0,1 g y se trató en la mufla a 800 oC durante 2 h para destruir la materia orgánica en donde todo se convierte en sulfato.

El residuo de cenizas se pesó cuantitativamente en un vaso de precipitado de 100 mL al cual se le añadió 50 mL de agua desmineralizada y hervida. A continuación se le añadió 0,3 mg de cloruro de bario p.a. de la firma Readel D´ Haën y 10 mL de una solución acondicionadora preparada previamente disolviendo 120 g de NaCl p.a. de la misma casa comercial que los anteriores en 400 mL de agua desmineralizada, 10 ml de HCl concentrado y 500 mL de glicerina se agitó por 1 min y se dejó reposar 4 min leyendo la turbidez en un espectrofotómetro UV/Vis modelo Pye Unicam SP 1200 a una longitud de onda de 420 nm contra una curva de calibración de sulfato de sodio anhidro a diferentes concentraciones y bajo similares condiciones experimentales.

Determinación de azúcares reductores. Esta se realizó por la técnica del 2,4 dinitrofenol.18 Este reactivo reacciona con los grupos reductores presentes en estos azúcares y es una medida de la posible degradación de estos.

Resultados

TABLA. 1 Resultados analíticos de 15 muestras de extracto que contienen AH y proteínas que pueden estar libres o ligadas a polisacáridos

Discusión

FIG. Metodología de aislamiento de Danishevsky y Bella, donde CPC: cloruro de cetilpiridinio, AC: ácido hialurónico, SCh: sulfato de condroitina, SH: sulfato de heparina.

]]> El empleo de sales de amonio cuaternaria provoca la precipitación de los polisacáridos en forma de complejos insolubles eliminando otros posibles contaminantes como los lípidos y la mayor parte de las proteínas. Este complejo se rompe al aumentar la fuerza iónica del medio añadiendo disolución de cloruro de sodio 0,4 mol/L, pues la fuerza iónica resultante puede romper principalmente el complejo AH-BCTA aunque no se descarta la posibilidad de romper otros posibles complejos con azúcares sulfatados, lo cual no es un inconveniente para su posible empleo como cicatrizante sobre la base de los criterios ya manejados de que la presencia de los polisacáridos sulfatados potencializa la acción cicatrizante.7

Se observa en todos los casos que los CV son menores que 10 y pueden considerarse aceptables para estas muestras en las cuales la mayor parte de estos polisacáridos son de alto peso molecular y forman suspensiones. El nivel de AH oscila entre el 6 y el 8 % con un valor medio del 7 %, estos son relativamente altos en comparación con otros métodos de aislamiento conocidos19,21 cuyos rendimientos son más bajos (< 5 %), de ahí la novedad.

Los valores de “humedad” oscilan alrededor del 84 al 85 %. Estos valores relativamente altos pueden ser explicados por la habilidad que tienen las moléculas de dichos polisacáridos y especialmente el AH de retener agua en su matriz cuando precipitan con el empleo de etanol.1

El procedimiento descrito permite obtener un producto mediante una tecnología relativamente sencilla con altos rendimientos en comparación con otros métodos conocidos.

Las técnicas descritas son recomendadas como control de rutina para el análisis del producto a escala industrial.
]]> El ensayo cualitativo de Elson Morgan para la determinación cualitativa de hexosaminas en este caso derivados N-acetilados dio positivo, al aparecer un color violeta púrpura que confirma la presencia de estos tipos de azúcares.

El ensayo de azúcares reductores con valores entre el 1 y 1,5 % se pueden considerar aceptables para este método de aislamiento empleado, pues se considera12 que son las fracciones de glucosaminoglicanos de alto peso molecular las insolubles en alcohol y a ellas les corresponden valores de reductores que se mueven en esos rangos.

El ensayo de la determinación de la presencia de sulfatos se realizó y se encontró en la muestra una concentración media de 84 p.p.m. Estos sulfatos son un indicador de la presencia de heteropolisacáridos de cordón sulfatados como son los SCh, SH, etc., que como se discutió anteriormente favorecen el empleo de esta materia prima en la formulación de cicatrizantes.

Summary

The polysaccharides obtained from human umbilical cords by a modification of Danishevsky and Bella’s technique were isolated and characterized. The cords were treated with a sodium chloride solution under controlled temperature and agitation conditions. The polysaccharides were precipitated by adding a disolution of cetyltrimethylammonium 1 %. The sediment obtained in a sodium chloride solution 0.4 mol/L was resuspended, eliminating some impurities that were not soluble at this ionic force by centrifugation. The product of interest was precipitated by adding ethanol to the supernadant and it was characterized by chemical methods. This product may be used as a raw material to obtain a healing gel in the Medicopharmaceutical Industry.

Subject headings: POLYSACCHARIDES/isolation & purification; UMBILICAL CORD; IMMUNOENZYME TECHNIQUES; AMMONIUM SULFATE.

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Recibido: 29 de mayo de 2002. Aprobado: 27 de junio de 2002. ]]> Lic. Guillermo Lago. Calle 180 entre 5ta Ave. y 1ra, Edificio A-4, apto 17, municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: chppl@infomed.sld.cu

1 Investigador Auxiliar.
2 Licenciado en Bioquímica. Investigador Titular.
3 Doctora en Ciencias Veterinarias.