Efecto secuestrador del D-002 sobre radicales hidroxilo en mucosa gástrica
Scavenger effect of D-002 on hydroxyl radicals in the gastric mucosa
Dra. C. Yohani Pérez Guerra, MSc. Ambar Oyarzábal Yera, Téc. Sonia Jiménez Despaigne Dra. C. Vivian Molina Cuevas, Dra. C. Rosa Mas Ferreiro
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Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC). La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: el agente causal de la ulceración gástrica está asociado al desequilibrio entre factores agresivos y defensivos que actúan sobre la mucosa gástrica. El D-002, mezcla de seis alcoholes alifáticos primarios superiores purificada de la cera de abejas, produce efectos gastroprotectores mediados por múltiples mecanismos y reducción de la peroxidación lipídica en la mucosa gástrica.
Objetivo: determinar si el D-002 es capaz de capturar el radical hidroxilo añadido in vitro o generado in vivo en ratas con úlcera gástrica inducida por indometacina.
Métodos: En la experiencia in vitro el D-002 se añadió a concentraciones entre 0,9 y 1 000 mg/mL. En la experiencia in vivo las ratas se distribuyeron en seis grupos: un control negativo y cinco que recibieron indometacina: un control positivo tratado con el vehículo, tres con D-002 (5, 25, y 100 mg/kg, respectivamente, p.o.) y otro con omeprazol (20 mg/kg i.p.). Los tratamientos se administraron una hora (vehículo y D-002) o 30 min (omeprazol), respectivamente, antes de inducir las úlceras. En ambas experiencias se tomaron alícuotas de mucosa gástrica, y se determinó el daño a la 2-desoxirribosa por el radical hidroxilo.
Resultados: la administración oral del D-002, no in vitro, protegió a la 2-desoxirribosa del daño oxidativo de modo marcado, significativo y dependiente de la dosis con respecto al control positivo.
Conclusiones: los resultados indican que la capacidad del D-002 (25 y 100 mg/kg) administrado por vía oral para secuestrar el radical hidroxilo, generado en la mucosa gástrica por la indometacina, pudiera contribuir a sus efectos antioxidantes y gastroprotectores sobre el daño que los antiinflamatorios no esteroideos producen sobre la mucosa gástrica. ]]>
Palabras clave: D-002, radical hidroxilo, mucosa gástrica, úlceras gástricas, úlcera por indometacina.
ABSTRACT
Introduction: the etiology of the gastric ulceration is associated to the imbalance between aggressive and defensive factors acting upon the gastric mucosa. D-002, a mixture of 6 higher primary alcohols purified from the beeswax, cause some multiple mechanism-mediated gastroprotective effects and decrease of lipid peroxidation in the gastric mucosa.
Objective: to determine whether D-002 can scavenge the in vivo added or in vivo generated hydroxyl radical in rats with indometacin-induced gastric ulcer or not.
Methods: For the in vitro experiment, D-002 was added at concentrations 0.9 and 1 000 mg/mL For the in vivo experiment, the rats were randomized into 6 groups: one negative control, and five indometacin-treated groups as follows a positive excipient-treated control, three under D-002 treatment (5, 25 or 100 mg/kg, respectively, p.o.), and another group treated with Omeprazole (20 mg/kg i.p.). These lines of treatment were given 1 hour (excipient and D-002) or 30 min (Omeprazole) prior to inducing the ulcers. In both experiments, aliquots from the gastric mucosa were taken and the damage infringed to 2-deoxiribose by the hydroxyl radical was determined.
Results: oral administration of D-002, rather than in vitro addition, significantly protected 2-desoxiribose from the oxidative damage depending on the dosage as compared to the positive control.
Conclusions: these results indicate that the ability of the orally administered D-002 (25 and 100 mg/kg) to scavenge the hydroxyl radical endogenously generated on the gastric mucosa by indometacin could contribute to its antioxidant and gastroprotective effects against the damage that the non-steroidal anti-inflammatory drugs carry to the gastric mucosa.
Key words: D-002, hydroxyl radical, gastric mucosa, gastric ulcer, indometacin-induced ulcers.
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INTRODUCCIÓN
Ha sido demostrado que la ulceración gástrica no se debe exclusivamente al aumento de la secreción ácida, sino que resulta del desequilibrio entre factores agresivos (antiinflamatorios no esteroidales AINEs, Helicobacter pylori, alcohol, estrés) y defensivos (mucus gástrico, microcirculación gástrica, prostaglandinas, entre otros) que actúan en la mucosa gástrica.1,2 Los factores agresivos pueden causar daño a la mucosa por diferentes mecanismos en los cuales se encuentran involucradas las especies reactivas de oxígeno (EROs) y el aumento de la peroxidación lipídica (PL), con el consiguiente aumento de la formación de radicales hidroxilo radical, extremadamente tóxico por no existir un mecanismo endógeno de defensa antioxidante capaz de eliminarlo directamente.3,4
Los inhibidores de la bomba de protones, medicamentos muy efectivos en el tratamiento de la enfermedad ácido péptica, no deben su eficacia solo a su conocido efecto antisecretor derivado de la inhibición de la bomba de protones de las células parietales, sino también a su potente acción antioxidante debida al bloqueo del aumento de la generación del radical hidroxilo, y de los procesos asociados de PL y oxidación de proteínas.5,6
Consecuentemente, diversos estudios han demostrado que compuestos con actividad antioxidante reducen la incidencia y severidad del daño gástrico inducido por factores agresivos,7,8 en particular, la capacidad de algunos extractos naturales para capturar el radical hidroxilo en el modelo de úlcera gástrica inducida por indometacina, en el cual se producen altas concentraciones.9-11
El D-002, mezcla de 6 alcoholes alifáticos primarios purificada de la cera de abejas (Apis mellifera), contiene triacontanol como principal componente, así como tetracosanol, hexacosanol, octacosanol, dotriacontanol y tetratriacontanol.12 Investigaciones preclínicas han demostrado que el D-002 produce efectos gastroprotectores13-20 mediados por múltiples mecanismos, como el aumento de la secreción del mucus gástrico, mejoría de su composición y reducción de la PL en la mucosa gástrica.13-15
De acuerdo con la relación entre este último proceso y los radicales hidroxilos, el objetivo del presente trabajo consistió en determinar si el D-002 es capaz de capturar dicho radical añadido in vitro o generado in vivo en ratas con úlcera gástrica inducida por indometacina.
MÉTODOS ]]>
AnimalesSe utilizaron ratas Wistar machos (150-20 g) provenientes del CENPALAB (Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, La Habana), las cuales fueron adaptadas durante 7 días a las condiciones de laboratorio con libre acceso al agua y la comida. Las experiencias se realizaron de acuerdo con los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio vigentes en la República de Cuba y los procedimientos del Centro de Productos Naturales (CPN).
Administración y dosificación
El D-002, suministrado por las Plantas de Producción de Productos Naturales (CNIC, La Habana, Cuba) y el omeprazol (Astra, Suecia) se prepararon en forma de suspensión en un vehículo goma acacia (10 mg/mL). La indometacina (Quimefa, Cuba) se disolvió en solución de bicarbonato de sodio al 5 %.
Después de culminada la cuarentena, las ratas fueron sometidas a un período de 18 h de ayunas con libre acceso al agua previas a la realización de dos experimentos. El primero evaluó los efectos in vitro del D-002 sobre el secuestro del radical hidroxilo en un medio de mucosa gástrica de ratas y el segundo evaluó sus efectos in vivo sobre el secuestro de este radical en mucosa gástrica de ratas con úlcera inducida por indometacina.
Para el estudio in vitro el D-002 se añadió directamente sobre el medio de mucosa gástrica, mientras que para el estudio in vivo el D-002 y el vehículo se administraron mediante entubación gástrica (5 mL/kg de peso), y el omeprazol (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) antes de inducir las úlceras.
Experimento 1: efectos in vitro del D-002 sobre el secuestro del radical hidroxilo en mucosa gástrica
Los animales se sacrificaron mediante eutanasia, para lo cual se anestesiaron en atmósfera de éter y se desangraron por la aorta abdominal. Seguidamente, se les extrajeron los estómagos y se obtuvieron alícuotas de mucosa gástrica que se homogeneizaron en 1 mL de solución salina fisiológica, a las cuales se añadieron directamente el vehículo (control) o el D-002 (0,9; 3,9; 15,6; 62,5; 250; 500 y 1 000 mg/mL).
Experimento 2: efectos in vivo del D-002 sobre radical hidroxilo generado en mucosa gástrica de ratas con úlcera inducida por indometacina. ]]>
Las ratas se distribuyeron en seis grupos (10 ratas/grupo): un control negativo y cinco que recibieron indometacina: un control positivo tratado con el vehículo, tres con D-002 (5, 25 y 100 mg/kg, respectivamente, p.o.) y otro con omeprazol (20 mg/kg i.p.). Los tratamientos se administraron 1 h (vehículo y D-002) o 30 min (omeprazol), respectivamente, antes de inducir las úlceras.
Inducción de la úlcera gástrica por indometacina
Las úlceras gástricas se indujeron por administración oral de indometacina (50 mg/kg) mediante entubación gástrica.21 Las ratas se sacrificaron 4 h más tarde en atmósfera de éter, se les extrajeron los estómagos, se cuantificaron las lesiones y se obtuvieron las alícuotas de mucosa gástrica.
Cuantificación de las lesiones: se extrajeron los estómagos, se abrieron por la curvatura mayor y se cuantificaron las lesiones en mucosa gástrica midiendo su longitud con una regla en milímetro, bajo una lupa con amplificación 3x. El índice de úlcera se determinó como la suma total de la longitud de las lesiones (en milímetro) por dos observadores independientes que trabajaron a ciegas.16
Las alícuotas de mucosa gástrica obtenidas de las ratas de ambos experimentos se utilizaron para realizar las siguientes determinaciones:
Determinación del daño sobre la 2-dexoxiribosa (capacidad de secuestrar el radical hidroxilo)
Para esta determinación se utilizó la técnica descrita por Burdon y Knippenberg, 1991,22 donde la inhibición del daño a la desoxirribosa se midió como la formación de sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (SRATB). La mezcla de reacción (1,2 mL volumen final) contenía 2,8 mmol/L de desoxirribosa (BDH, Inglaterra), solución reguladora KH2PO4/KOH (pH 7,4; 15 mmol/L), FeCl3 20 mmol/L, EDTA 100 mmol/L, H2O2 2,8 mmol/L, ácido ascórbico 100 mmol/L y el vehículo o D-002 a las concentraciones utilizadas. Las soluciones de ascorbato y cloruro de hierro III (FeCl3) se prepararon frescas en agua bidestilada. El EDTA y el FeCl3 se mezclaron antes de ser añadidos al medio de incubación. Las mezclas de reacción se incubaron durante 1 h a 37 oC, considerado al inicio de la reacción en el momento en que se adicionó el ascorbato. Posteriormente, se determinó la concentración de SRATB con el fin de investigar si el D-002 posee un efecto secuestrador de radical hidroxilo.
]]> Determinación de SRATB
La determinación de las SRATB se realizó según la técnica de Ohkawa y otros, 1979.23 Para ello, tras la incubación a la mezcla de reacción se le añadió 0,2 mL de SDS al 8,1 %, 1,5 mL de ácido acético al 20 % ajustada a pH 3,5, y 1,5 mL de una solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8 %. L a mezcla fue calentada a 95 °C durante 1 h. Con el objetivo de evitar la producción de aducios de ATB, se añadió BHT (1 mmol/L) al medio. Posteriormente se enfriaron las muestras, se añadieron 5 mL de una mezcla n-butanol: piridina (15:1 v/v), se agitó vigorosamente con ayuda de un Vortex y se centrifugó a 4 000 rev/min durante 20 min. Se extrajo la capa orgánica y se leyó a 534 nm en un espectrofotómetro (UV//Visible Genesys 10).
Los niveles de SRATB se calcularon según las concentraciones de malondialdehído (MDA), para lo que se construyó una curva patrón con malondialdehído bis (dimetil acetal). Los valores de MDA se informaron como nmol de MDA/mg de proteína. La concentración de proteína se determinó por el método de Lowry modificado.24
Análisis estadístico
Las comparaciones con el control se hicieron utilizando la prueba de la U de Mann Whitney. A priori se estableció un nivel de significación a= 0,05 para la determinación de la significación estadística. Los datos fueron procesados de acuerdo con el paquete de programas Statistic para Windows. (Release 6.0, Stat Soft, Inc USA). El estudio de relación dosis/efecto se realizó mediante el método de regresión lineal y correlación utilizando el programa Primer of Biostatistics (Stanton A, Glantz; copyright (c) 1992, McGraw-Hill, Inc Versión 3.01).
RESULTADOS
La tabla 1 muestra los efectos del experimento in vitro. Como se observa, la adición de D-002 no fue capaz de proteger significativamente la oxidación de la 2-desoxirribosa en mucosa gástrica. ]]>
Todas las ratas del grupo control positivo, pero ningún control negativo, mostraron la presencia de úlceras gástricas inducidas por indometacina. La administración por vía oral de indometacina no solo indujo las úlceras características, sino que aumentó significativamente la oxidación de la 2-desoxirribosa provocada por el radical hidroxilo en la mucosa gástrica con respecto al grupo control negativo (tabla 2).El pretratamiento por vía oral con D-002 disminuyó de forma marcada, significativa y dependiente de la dosis (p= 0,027; r= 0,999) el índice de úlcera con respecto al grupo control positivo, de manera que resultaron efectivas las dosis de 25 y 100 mg/kg, no la de 5 mg/kg.
El omeprazol (20 mg/kg), sustancia de referencia, redujo de modo marcado y significativo el índice de úlcera (93 %) respecto al control positivo, efecto significativamente mayor que el de la dosis mayor de D-002 (100 mg/kg) (75 % de inhibición). Además, el tratamiento por vía oral con D-002 protegió del daño oxidativo a la 2-desoxirribosa de modo marcado, dependiente de la dosis (p= 0,019; r= 1) y significativo en relación con el control positivo. El omeprazol (20 mg/kg) inhibió del daño oxidativo a la 2-desoxirribosa al 100 %, de modo más efectivo que la dosis mayor de D-002 (100 mg/kg) (70 % de inhibición).
DISCUSIÓN
El presente estudio demuestra que la adición in vitro del D-002 a homogenatos de mucosa gástrica no modificó la oxidación de la 2-desoxirribosa, mientras que su administración por vía oral protegió a la 2-desoxirribosa del daño oxidativo producido por el radical hidroxilo en la mucosa gástrica de ratas con úlcera inducida por indometacina.
El resultado negativo del estudio in vitro indica que el D-002 añadido directamente al medio no presenta efecto secuestrador directo. En este caso, el Fe3+ responsable de desencadenar el proceso oxidativo, se añade acomplejado con el EDTA, permanece en solución y al añadir H2O2, se generan los radicales hidroxilos que reaccionan con la 2-desoxirribosa.25 Por tanto, si la sustancia a evaluar no inhibe este proceso en presencia de EDTA, se infiere que no es capaz de la quelación directa de los radicales hidroxilos.
En cambio, la administración por vía oral del D-002 a dosis de 25 y 100 mg/kg redujo significativamente el índice de úlcera en un 60 y un 75 %, respectivamente, con respecto al grupo control positivo, lo que concuerda con reportes previos que muestran que la administración oral del D-002 a ratas protege contra las úlceras gástricas inducidas por AINEs, efecto que involucra un aumento de la secreción de mucus gástrico, una mejoría de su calidad y una reducción de la PL en la mucosa gástrica.26-30
De modo consistente, la administración por vía oral del D-002 protegió a la 2-desoxirribosa del daño oxidativo infringido por el radical OH• de modo marcado y dependiente de la dosis. Teniendo en cuenta que el radical hidroxilo produce daño oxidativo de lípidos y proteínas, la capacidad del D-002 para secuestrar in vivo estos radicales en mucosa gástrica pudiera ser uno de los mecanismos que sustenta sus efectos antioxidantes y que explica su efecto protector sobre la mucosa gástrica.
Una explicación plausible de que el D-002 sea capaz de secuestrar la generación del radical hidroxilo en la mucosa gástrica de ratas con úlcera por indometacina, pudiera deberse a que los alcoholes alifáticos primarios saturados de cadenas largas que lo constituyen se trasformen en sus respectivos ácidos, como se ha demostrado para alcoholes de larga cadena, incluidos algunos de los que componen al D-002.31,32 Por tal razón, es posible que los alcoholes de alto peso molecular del D-002 se transformen en estructuras más reactivas,33-35 capaces de capturar al radical hidroxilo. En tal sentido, el hecho que el D-002 sea capaz de capturar el radical hidroxilo in vivo, no in vitro, pudiera depender de que la transformación requerida para ello sea metabólica, a nivel de peroxisomas,33-35 y no simplemente química. No obstante, estudios ulteriores deberán corroborar esta hipótesis. ]]>
Pese a que diversos estudios experimentales y clínicos han documentado los efectos antioxidantes del D-002, esta investigación es la primera que informa que su administración por vía oral permite el secuestro del radical hidroxilo generado por la indometacina en la mucosa gástrica. El omeprazol, sustancia de referencia utilizada en el estudio in vivo, fue capaz de inhibir totalmente (100 % de protección) el daño sobre la 2-desoxirribosa generado por el radical hidroxilo, resultado coherente con estudios que demuestran que su efecto antiulceroso no se debe solo a su acción inhibitoria sobre la bomba de protones (H+-K+-ATPasa) de las células parietales, sino además a sus efectos antioxidantes, incluida su acción sobre el radical hidroxilo.9,36El efecto protector del tratamiento por vía oral con D-002 (100 mg/kg) (70 % de inhibición) sobre el daño a la 2-desoxirribosa por el radical hidroxilo fue menor que el del omeprazol (20 mg/kg) (100 % de inhibición), de modo consistente con la reducción del índice de úlceras con ambos tratamientos: 75 % con D-002 100 mg/kg, 93 % con omeprazol 20 mg/kg. No obstante, las reducciones logradas con el D-002, aún y cuando no se pueda confirmar que sean las máximas por no haber investigado dosis mayores y no haber obtenido efectos estacionarios, son marcadas (³ 70 %), lo que permite considerar tales efectos no solo estadísticamente significativos, sino fisiológicamente relevantes.
En conclusión, la adición in vitro de D-002 (0,9-1 000 mg/mL) a la mucosa gástrica no protegió a la 2-desoxirribosa del daño oxidativo, mientras que su administración por vía oral (25 y 100 mg/kg) fue efectiva en proteger a la 2-desoxirribosa del daño producido por el radical hidroxilo, generado en mucosa gástrica de ratas con úlcera inducida por indometacina. Así, la capacidad del D-002 para secuestrar in vivo el radical hidroxilo pudiera ser uno de los mecanismos de sus efectos antioxidantes y gastroprotectores sobre el daño que los AINEs producen sobre la mucosa gástrica.
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Recibido: 12 de octubre de 2011.
Yohani Pérez Guerra. Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC). Calle 198 entre 19 y 21, Atabey, municipio Playa, Apartado Postal 6414, La Habana, Cuba. Correo electrónico: yohani.perez@cnic.edu.cu ]]>
