Validación de una metodología por HPLC para cuantificar quercetina total en extractos de Calendula officinalis

Validation of an HPLC method for quantification of total quercetin in Calendula officinalis extracts

MSc. John Alexander Muñoz Muñoz,^I MSc. Jorge Enrique Morgan Machado,^I Dr. C. Mary Trujillo González^II

^I Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia.
^II Grupo Aseguramiento de Calidad, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia.

RESUMEN

Introducción: los extractos de Calendula officinalis se utilizan como materia prima natural en diversidad de preparaciones farmacéuticas y cosméticas, sin embargo, no existen métodos oficiales para el control de calidad de dichos extractos.
Objetivo: se validó una metodología analítica por HPLC para la cuantificación de quercetina total en extractos glicólicos e hidroalcohólicos de Calendula officinalis.
Métodos: para cuantificar el contenido de quercetina total en las matrices, fue necesario hidrolizar los flavonoides glicósidos en condiciones óptimas. La separación cromatográfica se realizó en una columna SiliaChrom C-18 5 µm 4.6x150 mm, adaptada a una precolumna SiliaChrom C-18 5 μm 4.6x10 mm, con un sistema de detección UV a 370 nm. El sistema de elución fue en gradiente, donde la fase móvil se compuso de Metanol (MeOH) y ácido fosfórico (H₃PO₄) (0.08 % p/v), la cuantificación se efectuó con el método de estándar externo y comparación con un estándar de quercetina de referencia.
Resultados: la selectividad de la metodología frente los componentes del extracto y a los productos de degradación en condiciones de hidrólisis ácida - básica, oxidación y exposición a la luz, mostró que no hay señales que interfieran con la cuantificación de la quercetina. Se comprobó estadísticamente que el método es lineal entre 1,0 y 5,0 μg / mL. La precisión intermedia expresada como coeficiente de variación fue de 1,8 y 1,74 % y el porciento de recuperación fue de 102.15 y 101.32 %, para los extractos glicólico e hidroalcohólico, respectivamente.
Conclusiones: la metodología propuesta cumple con los parámetros de calidad requeridos para la cuantificación de quercetina total, lo cual la convierte en una herramienta útil para el control de calidad de extractos glicólicos e hidroalcohólicos de C. officinalis.

Palabras clave: validación, HPLC, quercetina, flavonoides glicósidos, Calendula officinalis, control de calidad.

ABSTRACT

Keywords: validation, HPLC, quercetin, flavonoid glycoside, Calendula officinalis, quality control.

INTRODUCCIÓN

La actividad y seguridad de esta planta se encuentra respaldada tanto por el uso tradicional como por diversos estudios científicos, lo cual la ha llevado a ser una de las plantas con mayor volumen de comercialización en los últimos años⁶ y también el material vegetal con mayor número de registros sanitarios vigentes y de gran diversidad en preparaciones farmacéuticas y cosméticas,⁷ convirtiéndola en materia prima con alta demanda en el mercado. Como tal, se encuentra disponible como extracto hidroalcohólico y glicólico, en donde el primero se utiliza en productos con fines terapéuticos (jarabes, soluciones orales, preparaciones de uso tópico), mientras que el segundo se utiliza para inclusión en preparaciones con fines cosméticos.

Por lo anterior, es necesario desarrollar metodologías analíticas para complementar el control y el seguimiento de la calidad de la materia prima comercializada, pues de ella depende el efecto del producto determinado. Dado que la quercetina es la base de los flavonoides glicósidos principalmente relacionados con actividad anti-inflamatoria y cicatrizante, en este trabajo, se validó una metodología para su cuantificación en extractos glicólicos e hidroalcohólicos de Caléndula officinalis.

METODOS

EQUIPOS Y REACTIVOS

Los análisis se realizaron en un cromatógrafo Elite LaChrom con detector UV-VIS y DAD, que utiliza una columna cromatográfica SiliaChrom C18 de 150 × 4,6 mm y un tamaño de partícula de 5 um, adaptado a un guarda columna C18 de 4,6x10mm y 5 µm.

Los reactivos empleados fueron, metanol HPLC (Honeywell), éter etílico (Honeywell), ácido fosfórico (H₃PO₄) 85 % (Panreac), ácido clorhídrico fumante (HCl) (Merck), estándar de quercetina (USP). Los extractos glicólico e hidroalcohólico utilizados como matriz blanco fueron proporcionados por Phitother Laboratorios.

ESTANDARIZACIÓN DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Por la falta de un sistema oficial para la cuantificación de agliconas a partir de Caléndula officinalis, el desarrollo del sistema cromatográfico se basó en datos colectados de la literatura, en los cuales se describen sistemas constituidos por una fase orgánica (metanol, Acetonitrilo o mezcla de ambos) y una fase acuosa con ácido trifluoroacético (TFA) ó ácido fosfórico (H₃PO ₄).^8-12 Se realizaron modificaciones en porcentaje de la fase orgánica, concentración de ácido fosfóric ión del pico que se corresponde a la quercetina se efectuó por comparación con una solución estándar de quercetina USP. El sistema cromatográfico ideal para la elución de quercetina total a partir de extractos de C. officinalis se muestra en la tabla 1.

La muestra se sometió a una hidrólisis ácida a una temperatura óptima de 80°C, para obtener la quercetina a partir de los flavonoides glicósidos presentes en el material de partida. Las condiciones que se determinaron para la hidrólisis del extracto glicólico fueron HCl 2,0 M por 1 hora y una relación 1:3:3 de volúmenes de extracto:HCl:H₂O y para el extracto hidroalcohólico fueron HCl 3,5 M por 1 hora y una relación 1:1:1 de volúmenes de extracto:HCl:H₂O. Al culminar el tiempo de reacción, la muestra se colocó en un baño de hielo y se extrajo con 1 volumen equivalente de éter etílico, hasta juntar dos volúmenes. El éter etílico con las agliconas formadas, se lavó con agua destilada para remover el ácido remanente y se evaporó. El residuo se llevó a un volumen adecuado con una mezcla 80:20 de MeOH:H2O y filtrado a través de membrana de 0,45 µm.

VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA

La validación se realizó siguiendo los lineamientos de la AOAC¹³ (Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals) y la FDA¹⁴ (Guidelines for the Validation of Chemical Methods for the FDA Foods Program); se evalúan los siguientes parámetros:

SELECTIVIDAD

La evaluación de la selectividad se realizó,en primer lugar, frente a productos de degradación exclusivos de quercetina, por lo cual se partió de quercetina estándar de la cual se tomó un volumen para control y otro para la evaluación de degradación frente a hidrólisis ácida (HCl 0,1N) y básica (NaOH 0,1N), oxidación (H₂O₂ 3 %) y luz a 254 y 366 nm. De igual manera, se realizó la evaluación de selectividad frente a los productos de degradación de los componentes del extracto luego de su hidrólisis para la formación de las agliconas (quercetina, kaempferol e isorhamnetina).

Para la evaluación de la selectividad frente a excipientes, se analizaron individual y en mezcla a concentraciones usuales de trabajo en un extracto comercial como son propilenglicol, ácido ascórbico, benzoato de sodio, metilparabeno y propilprabeno, los cuales fueron evaluados de manera directa y tras someterse al proceso de hidrólisis aplicado para la formación de las agliconas.

LINEALIDAD DEL SISTEMA

Se analizó el comportamiento de soluciones de quercetina estándar a cinco niveles de concentración y tres réplicas (1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 5,0 µg/mL). Se realizó el análisis estadístico para determinar la ecuación de la recta, el coeficiente de correlación lineal (r),coeficiente de variación de los factores de respuesta, la significación estadística de la pendiente, el test de proporcionalidad (t student para α=0,05 y n-2= 13), la prueba F de Fisher y ANOVA para la linealidad del sistema.

Para la linealidad del método se prepararon soluciones de igual concentración a las utilizadas en la linealidad del método, a partir de los extractos glicólicos e hidroalcohólicos enriquecidos con quercetina. La extracción se obtuvo con éter etílico tal como especifica el tratamiento de la muestra. Para la evaluación del blanco, se realizó la extracción de la misma cantidad de matriz, sin enriquecimiento previo.

Para la repetibilidad del sistema se realizaron seis inyecciones consecutivas de soluciones estándar correspondientes al punto central de la curva de calibración y se determina la desviación estándar y el coeficiente de variación para el área. La precisión intermedia se evalúa por dos analistas en dos días diferentes en el mismo laboratorio y equipo con las condiciones de hidrólisis óptimas para cada matriz utilizada. Se evaluaron muestras por triplicado a un nivel de concentración, se determina el coeficiente de variación y el análisis de varianza para la precisión intermedia.

EXACTITUD

Se analizaron por triplicado soluciones preparadas a partir de los extractos glicólico e hidroalcohólico, enriquecidas con quercetina estándar. El porcentaje de recuperación se evaluó a tres niveles de concentración (1,0, 3,0 y 5,0 µg/mL). Los valores obtenidos se compararon con los esperados por interpolación en la gráfica de linealidad del sistema, obteniendo el valor de recuperación medio, y se evalúan los resultados por medio del test de Cochran para confirmar la homogeneidad entre las varianzas para los tres niveles de concentración trabajados.

RESULTADOS

APTITUD DEL SISTEMA

La evaluación de la aptitud del sistema realizada sobre seis inyecciones de una solución estándar de quercetina de 3 µg/mL, permitió determinar que el factor de capacidad (k´) es 3,82, el número de platos teóricos (N) es 22 284 y el factor de asimetría (As) 1,22 con valores de coeficiente de variación (% C.V.) menores al 2 %.

SELECTIVIDAD

Al realizar la degradación de las soluciones estándar de quercetina se observó disminución en el área de la quercetina con los tratamientos de luz a 254 nm; hidrólisis ácido-básica y oxidación. Al parecer el tratamiento con luz a 366 nm no afecta la estabilidad de la quercetina. En la figura 1 se muestran los cromatogramas correspondientes a los tratamientos de degradación para el extracto glicólico de C. officinalis, donde se observa que no existen señales de productos de degradación que interfieran con la determinación de la quercetina. Esto se corrobora con los respectivos espectros UV para la señal de quercetina, que permiten establecer una pureza de pico del 99,9 % en todos los casos.

Los resultados para la linealidad del sistema y del método para los extractos, se presentan en la tabla 2. De igual manera, los gráficos correspondientes se pueden observar en la figura 2.

PRECISIÓN

Los valores de concentración de quercetina presente en los diferentes extractos y determinadas por dos analistas en dos días diferentes y el resultados ANOVA para la precisión intermedia se muestran en la tabla 3.

EXACTITUD

Los porcentajes de recuperación promedio de quercetina, obtenidos a partir de los extractos evaluados y a tres niveles de concentración, son de 102,15 para el extracto glicólico y 101,32 para el hidroalcohólico, con coficientes de variación de 2,4 y 0,4 % respectivamente. La varianza de cada grupo de datos se usó para evaluar su variabilidad a travésdel test de Cochran, comparando el G_{critico (k=3, n=3)} que fue 0,87, con el G_calculado, que fue de 0,53 y 0,37 para el extracto glicólico e hidroalcohólico respectivamente.

DISCUSIÓN

Los resultados de los coeficientes de variación para el factor de capacidad, número de platos teóricos y asimetría no superan el 2 %, lo cual demuestra que el sistema cromatográfico es idóneo para la validación. Las condiciones cromatográficas empleadas en el método propuesto, permitieron detectar la quercetina a un tiempo de retención aproximado de 7,7 minutos y los compuestos kaempferol e isorhamnetina a 10,0 y 11,0 minutos respectivamente. La elución de distintos componentes de ambos extractos a tiempos mayores a los de estos, hizo necesario el aumento del gradiente hasta un 100 % de MeOH para garantizar la limpieza de la columna y así evitar sustancias interferentes.

Los ensayos de selectividad, muestran que la quercetina se degrada entre un 5 y un 27 %, en las condiciones descritas para la hidrólisis ácida-básica, oxidación y exposición a la luz. Los resultados muestran que la exposición a luz la 370 nm, no genera degradación de la quercetina. Es importante notar que la pureza de pico para la señal correspondiente a quercetina en todos los casos se mantuvo en un 99,9 %, lo cual indica que no hay productos de degradación que puedan interferir en el análisis. De igual manera los resultados de los ensayos de degradación del activo que se realizó a los extractos previamente hidrolizados y a la matriz compuesta de posibles interferentes en un extracto comercial, corroboran la selectividad de la metodología propuesta.

Los resultados correspondientes a la precisión intermedia permiten establecer que el coeficiente de variación CV, para la determinación de quercetina en extractos glicólicos e hidroalcohólicos es de 1,80 y 1,74 % respectivamente. De acuerdo a las guías de la AOAC¹³ y de la FDA¹⁴ para validación de métodos analíticos, el coeficiente de variación aceptable para concentraciones cercanas a 100 µg/mL, es del 4 %, y para concentraciones cercanas a 10 µg/mL, hasta del 6 %. Por lo tanto, los coeficientes de variación hallados para la cuantificación en ambos extractos se encuentran dentro de los rangos permitidos para la precisión intermedia. Por su parte, el ANOVA de la precisión intermedia muestra que no hay diferencia significativa entre realizar el análisis en días diferentes y por analistas diferentes.

Los porcentajes de recuperación para los extractos evaluados 102,15 y 101,32 %, para extractos glicólicos e hidroalcohólicos respectivamente, se encuentran dentro de los rangos establecidos por la AOAC y la FDA para muestras con concentraciones entre 10 y 100 µg/mL, los cuales se establecen entre 85 y 110 %. Además, de acuerdo al test de Cochran, los valores de Gcalculados fueron menores al valor crítico, por lo cual no hay evidencia del efecto de la concentración en la variabilidad de los resultados.

De acuerdo con los resultados para los diferentes parámetros de validación evaluados, el método desarrollado es selectivo, exacto y preciso para la cuantificación de quercetina total en extractos glicólicos e hidroalcohólicos de Caléndula officinalis. Este método, por lo tanto, es una herramienta útil para el control de calidad de los extractos que se utilizan como materia prima en la fabricación de productos fitoterapeúticos y cosméticos, además de servir en estudios de estabilidad de los extractos, con la utilización de la quercetina como marcador.

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John Alexander Muñoz Muñoz. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia. Correo electrónico: joamunozmu@unal.edu.co