Nuevos productos naturales para la agricultura: las oligosacarinas

New natural products for agriculture: the oligosaccharins

Dr.C. Alejandro B. Falcón Rodríguez, Dra.C. Daimy Costales Menéndez, Dianevys González-Peña Fundora, Dra.C. María C. Nápoles García

Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700.

Las oligosacarinas son polisacáridos y oligosacáridos naturales que forman parte de las paredes celulares de las plantas y microorganismos como los hongos; sin embargo, las principales fuentes de materia prima para su preparación a gran escala lo constituyen subproductos agrícolas y el exoesqueleto de los crustáceos que se desechan de la industria pesquera. Poseen potenciales aplicaciones agrícolas, ya que promueven la germinación, el crecimiento de las plantas, el incremento de los rendimientos y el beneficio de la simbiosis de las leguminosas. Numerosos estudios demuestran la protección de los cultivos con oligosacarinas ante diferentes manifestaciones del estrés biótico y abiótico. Algunas como las quitosanas ejercen acción antimicrobiana directa, lo que eleva sus aplicaciones como agente protector de la calidad de las producciones agrícolas. Existen varios productos internacionales basados en estas macromoléculas que ostentan además, como valor agregado, la inocuidad y biodegradabilidad característica de estos compuestos. El Grupo de Productos Bioactivos (GPB) del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) ha desarrollado varios productos a base de oligosacarinas que constituyen alternativas nacionales a productos agrícolas, como reguladores del crecimiento y los rendimientos, protectores de los cultivos contra el estrés biótico y abiótico y biofertilizantes de nuevo tipo para la fijación biológica del nitrógeno en las leguminosas.

Palabras clave: estrés, hongos, microorganismos, oligogalacturónido, productos, quitosano.

ABSTRACT

Oligosaccharins are natural polysaccharides and oligosaccharides occurring as part of cell walls of plants and microorganisms such as fungi; however, main sources of raw materials for its large scale preparation are by products from agriculture and wasted crustacean exoskeletons from fishing industry. They have potential agricultural applications since they promote germination and plant growth, enhance crop yields and benefit symbiosis in leguminous. A great number of studies demonstrate crop protection by oligosaccharins against biotic and abiotic stress. Some oligosaccharins, such as chitosans, perform direct antimicrobial activity, this fact reinforce their application as protective agent of agricultural commodities quality. There are several international commercial products based on these macromolecules that bearing also, as an additional valor, the innocuous and biodegradable features of these compounds. The Group of Bioactive Products (GPB) from INCA has developed several oligosaccharins based products that constitute national alternatives to agro-products as plant growth regulators, enhancers of crop yields, plant protecting agents against biotic and abiotic stress and new type of biofertilizers for biological nitrogen fixation in leguminous.

Key words: stress, fungus, microorganisms, oligogalacturonide, products, chitosan.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad existe una creciente necesidad mundial de producción de alimentos, debido a su escasez en determinadas zonas geográficas y a los incrementos de los precios y costos de producción que resultan prohibitivos para muchos países del tercer mundo. Una gran parte de los agroquímicos que se utilizan actualmente tienen altos precios en el mercado mundial, lo que contribuye a los altos costos de producción agrícola. En adición, todavía la mayor parte de los químicos que se utilizan para la protección de los cultivos contra sus enfermedades y algunos que incrementan la eficiencia productiva, son considerados agentes contaminantes del suelo, de los propios cultivos, de la biodiversidad y causantes de enfermedades en animales y humanos. ]]>
La ciencia moderna en los últimos 20 años se ha proyectado a la búsqueda de soluciones y alternativas para dichos problemas que mantengan la eficiencia de la producción agrícola. Para esto, el desarrollo de las distintas ramas de la biología vegetal ha permitido profundizar en los mecanismos que las plantas tienen y desarrollan frente a los diferentes retos que la naturaleza y el hombre les impone, como son los diferentes estreses bióticos y abióticos a que están sometidos los cultivos en la actualidad. Los resultados de estas últimas dos décadas permiten vislumbrar el desarrollo de una nueva generación de compuestos inocuos o menos agresivos al ambiente y al hombre que basan su utilidad en la manipulación de las respuestas naturales de los vegetales, contra los diferentes estreses y en maximizar las potencialidades intrínsecas de los cultivos para elevar sus rendimientos.

La siguiente revisión versa sobre las características y potencialidades de un grupo de compuestos (las Oligosacarinas), inocuos y de origen natural, con grandes perspectivas en la agricultura orgánica y sostenible e incluso en la agricultura de gran escala o intensiva.

LAS OLIGOSACARINAS

Las oligosacarinas fueron descubiertas como resultado de los estudios realizados durante las décadas de los años 70 y los 80, vinculados a dos temas de gran importancia en biología vegetal. Por una parte, múltiples grupos del primer mundo estudiaban la interacción planta-microorganismos, especialmente las respuestas de la planta a patógenos y predadores, así como las señales vinculadas con estas respuestas; y por otra parte, un número menor de investigadores liderados por el Dr. Peter Albersheim en Georgia, EUA, estudiaban la estructura y los componentes de la pared celular de las plantas, bajo la sospecha de que debido a la complejidad de la misma, era muy probable que sus funciones en la planta no solo fueran las de sostén, forma y protección del contenido celular.

Ambas líneas confluyeron en resultados de gran importancia que revolucionaron conceptos y puntos de vista en ambos temas. De esta forma se conoce hoy que la pared celular de las plantas es, además de reservorio o sostén celular, un depósito de hormonas que actúan en una variada gama de funciones en la planta, posiblemente mediante acción directa o indirecta sobre las llamadas hormonas tradicionales de la misma y, especialmente, en la activación de respuestas defensivas y de la resistencia de la planta contra patógenos y predadores.

CONCEPTOS: ELICITORES Y OLIGOSACARINAS

Las plantas tienen la capacidad de defenderse de la mayoría de los microorganismos, potencialmente patógenos, que habitan en su entorno. De forma general, los cultivos presentan barreras estructurales y compuestos químicos que impiden el avance de infecciones; además de estos mecanismos defensivos preestablecidos, las plantas pueden inducir la expresión de numerosos genes defensivos, tanto local como sistémicamente en todos los tejidos, cuya acción coordinada logra detener el establecimiento de una enfermedad (1, 2).

La respuesta defensiva en las plantas es el resultado del reconocimiento por parte de estas de diversos compuestos liberados de los patógenos y de las propias plantas durante el proceso de patogénesis, cuando enzimas excretadas por ambos contendientes degradan las paredes celulares del otro organismo (3, 4, 5). Las estructuras liberadas y reconocidas por la planta se denominan elicitores.

Los elicitores son sustancias que pueden inducir respuestas defensivas cuando se adicionan en tejidos o en células de plantas. Son compuestos de diversa estructura y origen -oligosacáridos, glicoproteínas, péptidos, lípidos, entre otros-. Se ha demostrado que los elicitores de tipo oligosacárido tienen importantes funciones en las interacciones planta-patógeno (3).

Los componentes polisacáridos y glicoprotéicos de las paredes celulares constituyen una fuente de oligosacáridos, que además de ser elicitores de respuestas defensivas en la planta, algunos ejercen efectos en el crecimiento y desarrollo de la misma a bajas concentraciones. El término Oligosacarinas se refiere, por tanto, a oligosacáridos de diferente origen con efectos biológicos en las plantas. Están constituidos por una cadena de residuos glicósidos, unidos por enlaces glicosídicos (6, 7).

Las Oligosacarinas se denominan de tipo endógena o exógena, de acuerdo a si son obtenidas o liberadas de las paredes celulares de la planta o del patógeno, respectivamente. De acuerdo a su origen existen diferentes tipos (Figura).

Oligosacarinas endógenas

Entre las endógenas las más conocidas y estudiadas son los Oligogalacturónidos (Oligosacáridos pécticos) y los Xiloglucanos (Figura).

Los Oligogalacturónidos consisten en una cadena lineal de moléculas de ácido galacturónico unida por enlaces α-1-4. El número de restos de D-galacturonatos que contiene el oligosacárido define su grado de polimerización (5). Se localizan en la porción péctica que constituye la pared celular de las plantas y en condiciones naturales se liberan de la pectina mediante hidrólisis enzimática por acción de la planta o como resultado del ataque de patógenos (4, 5).

Por su parte, los polímeros de Xiloglucanos son los principales polisacáridos hemicelulósicos que componen la estructura de la pared celular primaria de las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas no poáceas. También forman parte de los polisacáridos de reserva en semillas de dicotiledóneas. Consisten en un esqueleto de residuos de glucosa, unidos por enlaces ß-1-4, algunos de estos residuos pueden estar sustituidos por α-Xilosa, ß-Galactosa y α-Fucosa (8). La fragmentación de estos polímeros por hidrólisis química o enzimática libera oligosacáridos de xyloglucanos con actividad biológica en plantas (9, 10). Específicamente, el fenómeno de crecimiento y extensión a nivel celular está estrechamente relacionado con el metabolismo de los polímeros de Xiloglucanos y su degradación enzimática, además de liberar los fragmentos mencionados, provoca el debilitamiento de la pared celular de la planta (11, 12).

Oligosacarinas exógenas

Otras fuentes de obtención

No obstante, el origen mencionado, las oligosacarinas pueden ser extraídas de otras fuentes más ricas en los polisacáridos que las contienen; así la pectina cítrica comercial es la fuente principal para obtener oligogalacturónidos, mientras que las semillas de tamarindo son ricas en xiloglucanos. El exoesqueleto de los crustáceos es muy rico en quitina y la presencia permanente de esta estructura química de manera natural en la biosfera es de 10 gigatoneladas (1013 kg) (14). Debido a la versatilidad de aplicaciones de sus derivados, principalmente la quitosana y la glucosamina, la quitina es producida a escala industrial, fundamentalmente, a partir de cangrejo, camarón, langosta y langostinos,en cantidades de alrededor de 10 000 toneladas anuales (14, 15).

Varios grupos de investigación y empresas agrícolas a escala mundial han comenzado a desarrollar agroquímicos alternativos a base de oligosacarinas, siendo la elección de la fuente apropiada de obtención de los polímeros y oligosacáridos uno de los factores fundamentales en la reducción de costos de obtención y de precios de venta para los distintos sistemas agrícolas. De esta forma, los productos a base de quitina y quitosana se obtienen en un 90 %, a partir del exoesqueleto de los crustáceos que se pescan por millones de toneladas a escala mundial y que constituyen desechos de esta industria (15).

Otro ejemplo es el de un producto de ß-glucanos que se vende comercialmente. Una importante empresa francesa (GOEMAR) en colaboración con el Centro Nacional para las Investigaciones Científicas de Francia desarrollaron un producto a base de laminarina, el Iodus 40^®; (Vacciplant), extraído de algas marinas, que activa la protección intrínseca de la planta contra patógenos potenciales cuando se aplica preventivamente en diversos cultivos de importancia agrícola.
]]> En Cuba, el Grupo de Productos Bioactivos (GPB) del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) desarrolló una metodología de obtención de una mezcla de oligogalacturónidos activos biológicamente en plantas, a partir de pectina cítrica comercial, nombrado “Pectimorf” y se trabaja actualmente en el desarrollo de una metodología para la preparación de un producto a base de quitosana, derivado de la quitina de exoesqueleto de langosta cubana, a partir de desechos contaminantes de la industria pesquera. Ambos productos han demostrado diferentes efectos biológicos en cultivos de interés económico^A (16).

EFECTOS BIOLÓGICOS DE LAS OLIGOSACARINAS

Las Oligosacarinas fueron primeramente reconocidas como polisacáridos y oligosacáridos que inducían respuestas defensivas y resistencia en plantas. Sin embargo, estudios posteriores desarrollados en la década de los 90 las implicaron, además, en varias respuestas relacionadas con el crecimiento y el desarrollo del vegetal (6, 17). El descubrimiento de la estructura del principal esqueleto carbonado de los factores de nodulación excretados por las bacterias de la familia Rizobiaceae y su efecto en la morfogénesis de las raíces de las leguminosas, contribuyó a establecer a las oligosacarinas como una nueva jerarquía de hormonas en las plantas, cuya acción precede la síntesis y acumulación de las conocidas hormonas tradicionales (6, 18, 19).

Regulación del crecimiento y desarrollo en las plantas

La aplicación exógena de oligosacarinas influye en el crecimiento y desarrollo de los tejidos de las plantas, estas evidencias han sido fundamentalmente obtenidas con oligosacáridos derivados de los polímeros de la pared celular de plantas y también con derivados de quitina y quitosana^A (20, 21). En la Tabla I se presentan algunos ejemplos de efectos de oligosacarinas endógenas y exógenas en cultivos de importancia comercial^B (22, 23, 24, 25, 26, 27).

Dentro de las oligosacarinas endógenas o derivadas de paredes celulares de plantas, los oligogalacturónidos u oligopectatos han sido los más ampliamente estudiados, en cuanto a su efecto en el crecimiento y el desarrollo vegetal. En muchos de los casos estudiados, el efecto provocado en la planta parece ser el contrario a la acción auxínica.

Se demostró el efecto negativo de los oligogalacturónidos de diferente grado de polimerización (GP) en el alargamiento de tallos del guisante inducido por ácido indol acético (AIA), la inhibición de la formación de raíces en capas celulares delgadas que crecían en medio de cultivo de enraizamiento, la reducción de la acumulación de una proteína en medio de cultivo que se induce con ciertos niveles de AIA en presencia de oligopectatos en el medio y la inhibición de la división celular, inducida por auxinas en las células parenquimatosas del floema (5, 28). Sin embargo, resultados posteriores obtenidos con una mezcla de oligopectatos, comercialmente conocida como Pectimorf (Pm), incluida en el medio de cultivo in vitro de diferentes especies, con determinado balance fitohormonal, indican un efecto auxínico basado en la estimulación del enraizamiento, el incremento de brotes y del crecimiento vegetativo (21, 22, 29). ]]>
En adición, se han obtenido con la misma mezcla resultados ex vitro relacionados con la formación de raíces en niveles similares a las inducidas con AIA^A (30).

Una aplicación potencial de los oligopectatos (y quizás de otras oligosacarinas) es la de provocar el incremento de color en algunos frutos. Recientemente, un grupo de investigación estudió la respuesta de color de la vid a la aplicación de una mezcla de oligogalacturónidos con grado de polimerización menor de 20, a escala productiva. Los resultados mostraron incrementos de color significativamente por encima del control y del producto comercial (Ethephon) que se utiliza para este propósito. El incremento estuvo directamente relacionado con aumentos del contenido de antocianinas (responsables del color en la vid) y además, con la expresión génica de la fenilalanina amonio liasa (PAL, en inglés) en los primeros días de la aplicación, enzima que abre varias rutas enzimáticas, algunas que conllevan a la formación de antocianinas (24). Esta correlación justifica la posibilidad de que otros inductores de PAL puedan causar incrementos de color en las uvas.

Fragmentos específicos de Xiloglucanos muestran actividad antiauxínica o auxínica, en dependencia del tipo de residuos de monosacáridos, unido a la cadena oligomérica de xiloglucano y de la concentración utilizada (31, 32). Sus efectos a concentraciones nanomolares los convierten en señales primarias a las hormonas que regulan.

Estudios más recientes realizados con xiloglucanos, obtenidos de semillas de tamarindo, mostraron efectos en la promoción del crecimiento primario de la raíz en interacción con la reducción de la formación de raíces laterales (33, 34), así como el acortamiento del ciclo celular, en particular en la fase G1 de la mitosis y la reversión de la ocurrencia de tamaños mayores o menores de fenotipos celulares, obtenidos con genotipos particulares de Arabidopsis thaliana (34, 35).

Por su parte, tanto el polímero de quitosana como sus derivados de menor tamaño se consideran reguladores del crecimiento y del desarrollo de las plantas, al estimular el crecimiento radical y vegetativo de varias especies (20, 36), acortar el período de floración y mejorar la floración y fructificación (37, 38). Incluso se han demostrado incrementos de los rendimientos y en la calidad en varios cultivos con estos derivados, lo que ha permitido que sean patentados para estos fines (36, 39). En general, en dependencia del órgano de la planta que se trate, se han obtenido los resultados benéficos antes mencionados cuando se hacen tratamientos a las semillas, a las raíces de las plantas o por aspersión foliar en los momentos adecuados para cada cultivo^B (36, 39, 40). ]]>
A su vez, las aplicaciones exógenas en plantas, principalmente con oligogalacturónidos y quitosanas (Tabla I), a escala de casas de cultivo y de campo, han demostrado influencias de estas oligosacarinas que favorecen el crecimiento y los rendimientos de especies de importancia económica dentro de las familias Solanáceae, Cucurbitáceae, Poáceae y Fabáceae, entre otras^{A, B, C} (25, 26, 27, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50). Algunos autores plantean que la influencia positiva sobre el crecimiento está relacionada con un efecto antitranspirante en la planta, inducido por el cierre de los estomas (51, 52).

De acuerdo a un estudio realizado, la reducción del riego de plantas de pimiento aplicadas con quitosana permitió una mejor adaptación y consumo del agua por la planta, ya que la aplicación foliar del polímero redujo el uso del agua por las plantas entre un 26 y un 46 %, mientras que la producción de biomasa y el rendimiento se mantuvo similar al de las plantas controles no sometidas al déficit hídrico (53). Esto ocurrió por disminución de la pérdida de agua a través de los estomas, debido a un cierre estomático provocado por la quitosana. Este cierre estomático fue estudiado posteriormente, demostrándose un incremento del ácido abscísico en las células de las hojas aplicadas con quitosana, lo que provocó la reducción de la conductancia estomática (52). Lo anterior justifica el empleo de la quitosana como antitranspirante para conservar el uso del agua en la agricultura.

Adicionalmente, las oligosacarinas sintetizadas y excretadas por rizobacterias fijadoras de nitrógeno de la familia Rhizobiaceae, provocan la germinación de diversas semillas de plantas y están involucradas en los eventos primarios de las raíces, que conllevan al establecimiento de la simbiosis entre las leguminosas y las bacterias mencionadas (18, 54, 55). Las estructuras de estas oligosacarinas consisten en oligosacáridos de quitina de cuatro o cinco restos de N-acetyl glucosamina unidas a otros grupos complejos que varían con la especie de Rhizobium. Estas oligoquitinas son las responsables de inducir las divisiones en las células corticales de la raíz que inician y conllevan a la formación posterior del nódulo (56).

El GPB del INCA estudió la aplicación de quitosanas en experimentos in vitro de soya en combinación con el microsimbionte Bradyrhizobium elkanii. Se demostró que la inclusión de quitosanas de diferente masa molecular en el medio de crecimiento de la planta, causó el aumento del número y de la masa seca de los nódulos que se forman en la raíz, en dependencia de las concentraciones utilizadas. También se observó un efecto dependiente de la concentración, en el crecimiento de las plántulas y en el volumen de las raíces producidas. Concentraciones por encima de 500 mg L^-1 no beneficiaron el crecimiento de las raíces y el sistema aéreo de las plantas^D (57, 58).

INDUCCIÓN DE RESISTENCIA EN PLANTAS CONTRAN PASTÓGENOS

Los oligosacáridos derivados de los polímeros de ß-glucanos, que conforman la pared celular de patógenos del género Phytophthora, han sido bien documentados como inductores de respuestas defensivas en plantas. Así, un hepta-ß-glucósido ramificado, obtenido del glucano de la pared de Phytophthora sojae por hidrólisis ácida, demostró ser un elicitor muy activo de la síntesis de la fitoalexina gliceolina en células cotiledonales de soya (59), demostrándose, además, que la hidrólisis parcial del glucano de P. sojae liberaba fragmentos con actividad elicitora en diferentes plantas de la familia Fabaceae (60), lo que indica un sistema similar de percepción en esta familia de plantas.

En células de tabaco, el hepta-ß-glucósido no actuó como elicitor; sin embargo, una cadena linear de ß 1-3 glucano (laminarina), extraída del alga Laminaria digitata mostró ser un elicitor activo de respuestas defensivas (61) e incluso causó la reducción de la infección fungosa en hojas de vid (62). A partir de resultados como los citados anteriormente (Tabla II), la empresa francesa GOEMAR en colaboración con el Centro Nacional para las Investigaciones Científicas, desarrollaron un producto a base de laminarina, el Iodus 40^® (Vacciplant), extraído de algas marinas que activa la protección intrínseca de la planta contra patógenos potenciales cuando se aplica preventivamente.

Oligosacáridos pécticos u Oligogalacturónidos

Los oligogalacturónidos derivados de los polisacáridos pécticos de las paredes celulares de las plantas han sido descritos como inductores de una gran variedad de respuestas defensivas en células, órganos y plantas completas de numerosas especies, entre las que se encuentran la inducción de fitoalexinas, inhibidores de proteinasas, proteínas PR y el proceso de lignificación (5, 7).

Los oligogalacturónidos se pueden generar de las sustancias pécticas de la pared celular primaria de la planta por hidrólisis ácida parcial o por acción de enzimas pectinasas o pectatoliasas de patógenos. Es conocido además que, sin importar el método de generación, son dependientes del grado de polimerización (GP) para la inducción de respuestas defensivas, siendo los GP entre 10 y 12 los más activos (5, 7).

En la última década se informó la protección de dos especies de importancia económica (Tabla II), contra sus principales patógenos, por inducción de resistencia con oligogalacturónidos^A (63). Es importante destacar que, a diferencia de las quitosanas, los oligogalacturónidos y los ß-glucanos no tienen acción directa antimicrobiana sobre los microorganismos, por lo que la protección que puedan ejercer en los cultivos es debida a la activación de resistencia inducida en las plantas.

La quitina, un polímero de N-acetil-glucosamina unido por enlaces ß 1-4, es un componente común de las paredes celulares de varias familias de hongos (64). Sus fragmentos (N-acetil quitooligosacáridos) han estado implicados en la inducción de una gran variedad de respuestas vinculadas a la defensa de la planta, como son la inducción de fitoalexinas, lignificación, proteínas PR, la expresión de genes defensivos y otros; fundamentalmente, en especies del grupo de las monocotiledóneas y, especialmente, en suspensiones celulares de arroz (65).

También se ha estudiado la activación de respuestas secundarias vinculadas a la transducción de la señal defensiva por fragmentos de quitina, entre las que se destacan cambios en el flujo iónico y fosforilación de proteínas, despolarización de la membrana plasmática y eflujo de iones Cl- y K+, acidificación citoplasmática, generación de especies reactivas de oxígeno y biosíntesis de ácido jasmónico (7, 65, 66).

La quitosana es un polímero de ß 1-4 glucosamina, componente natural de las paredes celulares de los hongos Zygomycetos (64). Tanto el polímero como sus oligómeros son potentes inductores de respuestas defensivas y de resistencia en la planta contra patógenos. Sin embargo, las concentraciones requeridas para la activación de las respuestas defensivas son superiores a aquellas necesarias para inducir dichas actividades con los oligómeros de quitina (7, 65).

Como en el caso de los oligogalacturónidos, los fragmentos de quitina (y también los de quitosana) son dependientes del grado de polimerización (GP) de la molécula en la activación de las respuestas defensivas antes mencionadas, siendo los tamaños por encima de GP 4 y principalmente el heptámero y el octámero los que inducen las respuestas a las menores concentraciones (7, 66).

La quitosana es, entre las oligosacarinas, la más estudiada y de mayores aplicaciones en el campo de la agricultura de pre y pos-cosecha. Posee tres características esenciales en su actividad biológica que la hacen deseable en este campo, benefician el aumento del crecimiento y los rendimientos de muchos cultivos probados; causan la inducción defensiva y de resistencia contra patógenos en plantas aplicadas y, a diferencia de las otras oligosacarinas estudiadas; provoca la inhibición del crecimiento y desarrollo de micro-organismos en general (16, 67, 68, 69, 70). Es reconocido que su actividad biológica está relacionada con las cargas positivas libres, presentes en el grupo amino en condiciones de acidez, que interactúan con cargas contrarias de componentes de la pared celular y las membranas de microorganismos y plantas.

La actividad antimicrobiana de la quitosana ha sido documentada tanto en experimentos in vitro como in situ (14, 67). La literatura informa que la inhibición del desarrollo de muchos patógenos, que incluyen hongos, bacterias y oomycetes, está altamente correlacionada con el incremento de la concentración de quitosana en el medio de crecimiento, indicando que en la medida en que aumenta la concentración se incrementa la inhibición, existiendo diferencias entre acción fungistático y fungicida, de acuerdo a las concentraciones probadas (Tabla III).

Desde hace más de dos décadas se han evaluado estos compuestos sobre todos los estadios del ciclo de vida de los hongos, siendo las estructuras reproductivas las más afectadas (14, 67).

El estudio del efecto de la quitosana en el grupo de los oomycetes es más reciente. Algunos autores han demostrado que polímeros de quitosana afectan el desarrollo vegetativo de aislados del género Phytophthora. El aumento de la concentración en dependencia de la especie causa una disminución significativa del crecimiento de las colonias, lo cual se ha podido observar en especies como P. nicotianae, P. capsici y P. palmivora, todos ellos patógenos importantes de numerosas especies de plantas^E (71, 72, 73, 74). Algunas de estas especies son más sensibles que otras, por ejemplo, P. nicotianae y P. capsici redujeron su crecimiento vegetativo más de un 50 % con alrededor de 0,5 g L^-1 (71, 73, 74), mientras que P. palmivora necesitó más de 2 g L^{-1 E}. Entre oomycetes y hongos verdaderos, los resultados muestran, en general, una aparente mayor sensibilidad en los primeros, como se ha observado al comparar experimentos entre Phytophthora y Pythium contra especies de diferentes grupos de hongos; siendo incluso, mucho menos sensibles algunos hongos nematófagos y entomopatógenos (71, 74, 75).

Otros estadios de los microorganismos, como son las estructuras reproductivas y de dispersión asexual, pueden ser más sensibles que las de crecimiento vegetativo. La inhibición de la germinación de esporas por quitosana se ha observado en numerosos hongos, tales como Aspergillus niger, Alternaria alternata, Rhizopus stolonifer, Mucor sp. y Pochonia chlamydosporia (74, 75, 76, 77, 78, 79, 80).

Dentro de los oomycetes, el género Phytophthora ha sido de los más estudiados. Polímeros y oligómeros de quitosana causan la inhibición de la formación y germinación de zoosporas y zoosporangios en P. capsici, P. nicotianae y P. palmivora^E (16, 71, 72, 73). ]]>
Las propiedades físico-químicas de estos compuestos también influyen en la inhibición del crecimiento de los microorganismos. Por ejemplo, la reducción de la masa molecular del polímero y del grado de acetilación aumenta la inhibición del crecimiento micelial y la germinación de esporas de Phytophthora nicotianae (16, 73). De manera similar, en Rhizopus stolonifer, variaciones desde 1,0 hasta 2,0 g L^-1 no alteraron la formación o germinación de esporas; sin embargo, se observó inhibición de estos procesos al emplear quitosanas de diferente masa molecular (76).

Se sugiere que la acción antimicrobiana de la quitosana se deba principalmente, al carácter policatiónico de la molécula cuando se encuentra en soluciones a pH por debajo de 6,0, ya que los grupos aminos, cargados positivamente, pueden interactuar con los fosfolípidos de las membranas celulares de los microorganismos y alterar su permeabilidad. Esto puede provocar desbalances osmóticos que conllevan a desorganizaciones estructurales y finalmente puede culminar con la lisis celular (67, 81). Para el caso de las oligoquitosanas se ha demostrado la internalización de estas moléculas en la célula microbiana y se especula su posible interacción con el ADN de la misma (72). La magnitud de las afectaciones encontradas puede variar, fundamentalmente, en dependencia de las propiedades físico-químicas del polímero y las concentraciones que se empleen (14, 67).

A pesar de las numerosas bondades de la quitosana demostradas en decenas de trabajos y del incremento en el número de patentes de aplicación en los últimos 15 años, puede considerarse este polímero todavía no muy explotado en el contexto agrícola mundial. De hecho, la mayoría de los productos agrícolas con base quitosana (Elexa^®, Chitogel^®, Aminogro^®, Chito-Plant^®, Chito-Care^®, etc) comenzaron a aparecer aproximadamente hace una década y no tienen todavía una demanda o producción elevada (41, 82). Sin embargo, recientemente se ha notado un impulso de las evaluaciones de quitosana en condiciones controladas, no controladas y de invernadero^A (16, 41, 82, 83) e incluso su extensión y evaluación como resultado de decisiones gubernamentales. En la actualidad este polímero es reconocido dentro de los biopesticidas como un “derivado de crustáceos activador de la defensa de las plantas” (84).

Protección de las plantas por quitosanas ante el estrés biótico

La protección de los cultivos contra sus principales enfermedades, mediante aplicaciones de quitosanas, se ha estudiado por más de 20 años en diferentes interacciones planta-patógeno por numerosos grupos de investigación a escala mundial. Varios ejemplos de protección informadas en diferentes especies y distintos momentos del cultivo se referencian en la Tabla II (70, 73, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100). La protección encontrada contra el ataque de patógenos puede deberse a la actividad antimicrobiana que estos polímeros y oligómeros ejercen sobre los microorganismos o puede ser el resultado de la elevación de la resistencia basal de la planta, causada por la activación de resistencia inducida que ejercen estos compuestos en el vegetal. En muchos casos pueden ocurrir simultáneamente ambos efectos (16, 67, 69, 70).

Protección de las plantas por oligosacarinas ante el estrés abiótico

Estudios más recientes han demostrado las potencialidades de las oligosacarinas en la protección de algunas especies contra diferentes manifestaciones del estrés abiótico. La mayoría de los estudios divulgados se refieren a evaluaciones y resultados de la última década con oligosacarinas exógenas; sin embargo, resultados con oligosacarinas endógenas han resultado incluso en la publicación de patentes. ]]>
En este sentido, fue patentado un proceso para la adaptación de plantas a diferentes estreses abióticos, que incluye la aspersión foliar de un derivado de xiloglucano en condiciones particulares de aplicación. De acuerdo a los autores, el proceso beneficia el crecimiento de las plantas, bajo diferentes tipos de estrés, que incluyen bajas temperaturas, sequía, humedad o salinidad, mediante la estimulación de enzimas y compuestos que reducen los niveles de las especies reactivas de oxígeno que se liberan durante el estrés y amplifican, además, algunas señales que conllevan a la formación y activación de las hormonas tradicionales que actúan en la célula vegetal (101).

Un creciente número de resultados de protección contra el estrés abiótico se han informado en plantas con diferentes tipos de tratamiento con quitosanas. Los estudios abarcan desde ensayos controlados hasta experimentos en mayor escala, así como en diferentes cultivos. Por su parte, las aplicaciones pueden ser por recubrimiento o imbibición de semillas, durante un corto tiempo con altas concentraciones o lo inverso, concentraciones menores y mayores tiempos de contacto, en dependencia del tipo de semilla. También se han obtenido buenos resultados con tratamientos por aspersión foliar, aplicación al sustrato de crecimiento o por inclusión de estacas o raíces en soluciones de quitosana.

Las diferentes manifestaciones del estrés abiótico han sido ensayadas con mayor o menor éxito, en dependencia de las condiciones de experimentación. Algunos ejemplos de protección de especies contra diferentes manifestaciones del estrés abiótico se resumen en la Tabla IV (102, 103, 104, 105, 106).

BONDADES ECOLÓGICAS DE LAS OLIGOSACARINAS

El propio origen y estructura química oligosacárida de las oligosacarinas habla ya de sus posibles características no tóxicas. Los oligogalacturónidos que forman parte del Pectimorf se extraen mediante hidrólisis enzimática de pectina cítrica, materia prima utilizada ampliamente en la industria alimenticia y el producto final es biodegradable por microorganismos del suelo, una vez aplicado, no quedando trazas del producto en la planta o sustrato^F.
]]> Algo similar sucede con los productos basados en quitina y quitosana ya que aunque esta puede ser tóxica para muchos fitopatógenos del suelo, resulta una fuente de carbono excelente para otros. Por otra parte, los productos de quitina y quitosana son ampliamente utilizados para la medicina humana y animal, la cosmética, así como en la industria ,debido a su inocuidad para el hombre (15, 107).

Otro aporte ecológico importante de ambos productos lo constituye el hecho de que las materias primas (pectina y quitina industrial) de donde se obtienen cada uno, constituyen el valor agregado que se obtiene de subproductos potencialmente contaminantes de las industrias alimentaria y pesquera respectivamente, ya que constituyen los desechos de la producción de jugos y del exoesqueleto de los crustáceos que se pescan para el consumo humano. Por tanto, la preparación de ambos productos ofrece una salida económica y ecológica a subproductos de ambas industrias.

RESULTADOS Y PERSPECTIVAS DE PRODUCTOS CUBANOS A BASE DE OLIGOSACARINAS

El GPB del INCA tiene una experiencia de 20 años en el estudio de las oligosacarinas, su preparación y efectos en plantas. El grupo desarrolla productos a base de oligogalacturónidos (Pectimorf^®) y quitosanas -QuitoMax^®-, como principales agentes activos, a partir de metodologías propias. Ambos ejercen diferentes efectos biológicos en plantas y permiten diversas aplicaciones como productos alternativos para diferentes agroquímicos.

El Pectimorf (Pm) promueve el desarrollo de raíces en plantas a concentraciones entre 5 y 20 mg L^-1, lo que se ha demostrado en experimentos de tratamiento de semillas, esquejes y mediante aspersión foliar y en combinación de las formas de aplicación mencionadas en cultivos como hortalizas, frutales y plantas ornamentales (25, 26, 27). Este producto se introduce y extiende como enraizador en la agricultura cubana por todo el país y se están probando nuevas presentaciones del producto para facilitar su utilización por los agricultores.

Los incrementos en el desarrollo foliar y del crecimiento de la planta, también han sido observados en solanáceas y leguminosas, así como de los rendimientos en soya y frijoles (26, 27, 108). Igualmente, se ha demostrado un efecto positivo en la activación del crecimiento en plantas ornamentales de crecimiento lento como la Areca, el Anturium y las orquídeas, mediante la aspersión foliar del Pm en diferentes concentraciones y momentos de aplicación (25, 109, 110). ]]>
En el cultivo in vitro, el Pectimorf ha sido ampliamente estudiado, demostrándose su capacidad como sustituto de hormonas tradicionales, auxinas y citoquininas, en diferentes estadios y en diversos cultivos como la caña de azúcar, el café, los cítricos, la papa, el tomate, el tabaco, el banano, el arroz, el ajo, entre otros^F (21, 22, 23, 29). En este caso también se han observado beneficios al cultivo como la promoción del enraizamiento, el incremento de brotes, así como resultados beneficiosos en el estadio de adaptación ex vitro. Otros resultados encontrados con el Pm son el retraso en la apertura de flores recién cortadas, específicamente en rosas y el incremento de brotes en violetas tratadas por aspersión del producto^F.

Con el Pectimorf también se han realizado estudios relacionados con la protección de las plantas contra diferentes tipos de estrés. Por ejemplo, se evaluó la inducción de respuestas defensivas y protección contra oomycetes (Phytophthora) en tomate y tabaco, mediante tratamiento de semillas y aspersión foliar^A.

En relación con el estrés abiótico, se ha evaluado el potencial de esta mezcla de oligogalacturónidos en la protección de plantas de tomate contra el estrés por metales pesados, encontrándose que la imbibición previa de semillas de tomate con Pm permitió reducir la afectación de las plántulas que crecían en un sustrato envenenado con cobre, obteniéndose valores en las variables de crecimiento semejantes al control cultivado en sustrato carente del metal (111).

El GPB ha desarrollado metodologías para la preparación de compuestos de quitosana con diferentes características químico-físicas. De esta forma se estudiaron las potencialidades biológicas de quitosana en polímero, parcialmente hidrolizada y de oligosacáridos de quitosana, encontrándose diferencias en su accionar biológico en dependencia de la masa molecular y el grado de acetilación en el grupo amino. Estos compuestos han sido investigados como inductores de resistencia contra patógenos en cultivos como tabaco, tomate, soya y arroz y, además, como inhibidores de los patógenos fundamentales de estos cultivos^{D, E} (16, 73, 74, 112, 113, 114). Igualmente fueron demostradas sus potencialidades para aumentar el crecimiento y los rendimientos en cultivos de interés como tabaco, tomate, maíz y pepino^B (16, 115, 116).

A partir de los resultadosen los cultivos mencionados, el GPB desarrolló un formulado de quitosana conocido como QuitoMax^® que se encuentra en fase de registro como bioestimulante en presentación líquida y se continúan sus validaciones en campo mediante extensiones y campos controles en diferentes provincias de Cuba. En este sentido, durante tres campañas agrícolas (2012-2015) el QuitoMax^® se ha extendido de cientos a miles de hectáreas en el país fundamentalmente en los cultivos de papa, frijol y maíz. En la campaña 2014-2015 se generalizó en las 1700 ha de papa plantadas en la provincia de Mayabeque y se extendió en cientos de hectáreas de Matanzas y Ciego de Ávila obteniéndose incrementos de más de tres toneladas por hectárea como promedio. En frijol se generalizó en más de 2000 ha en la misma provincia y en más de 1000 ha a nivel nacional en el cultivo del maíz. Adicionalmente, se ha extendido en decenas de hectáreas en el cultivo del tomate y el tabaco en la provincia de Granma. ]]>
Los estudios realizados en las pruebas de validación del QuitoMax^® sustentan la preparación de polímeros de quitina y quitosana a partir del exoesqueleto de la langosta cubana, que constituye actualmente un desecho contaminante de la industria pesquera, con el fin de ser aplicados en la agricultura a mayor escala. Entre las ventajas de su utilización para este fin se puede agregar que son compuestos no tóxicos y biodegradables una vez liberados al ambiente y se pueden obtener, a través de metodologías no contaminantes, de materias primas nacionales que constituyen desechos (16). A lo anterior debe añadirse su acción antimicrobiana contra patógenos y su compatibilidad, e incluso, acción sinérgica con varios controles biológicos; la activación de resistencia inducida contra posteriores ataques de patógenos, cuando se aplican previamente en los cultivos y el demostrado efecto de promover el crecimiento, desarrollo vegetativo y el rendimiento^B (16, 70, 73).

Los resultados del GPB demuestran el incremento del crecimiento y los rendimientos que van desde el 10 al 60 % por encima de los controles, en dependencia del producto evaluado (Pectimorf o QuitoMax^®), las diferentes formas de aplicación experimentadas en el cultivo y la localidad de que se trate^{B, B, C}. Estos resultados promisorios, algunos en fase de extensión, se han demostrado en cultivos como tabaco, tomate, papa, maíz, arroz, pepino, soya y frijol. En estos dos últimos se ha demostrado un efecto sinérgico de ambos productos por separado con los microorganismos fijadores biológicos de nitrógeno que se utilizan como biofertilizantes de dichos cultivos^C (108).

El grupo ha diseñado y desarrollado además, un nuevo concepto dentro de los biofertilizantes para la fijación biológica del nitrógeno, basado en la obtención de biopreparados a base de rizobios y enriquecidos en factores de nodulación, oligosacarinas sintetizadas y excretadas por estos microorganismos simbiontes de las leguminosas (117, 118).

Al explotar una mayor presencia de estas macromoléculas en dichos biopreparados, se logra un valor agregado que va más allá del simple aumento de la biomasa bacteriana para proponer además, un mayor número de las estructuras que inducen los primeros eventos en la formación de los nódulos donde se fijará posteriormente el nitrógeno atmosférico.

La comparación de biofertilizantes tradicionales para soya con aquel enriquecido en factores de nodulación (conocido comercialmente como Azofert), demostró las ventajas del segundo en la formación de nódulos en las raíces y el aumento del crecimiento y los rendimientos del cultivo (119). Resultados adicionales demuestran que la presencia de estas oligosacarinas en los biopreparados provoca una mayor protección en cultivos de soya contra el estrés biótico y abiótico (120, 121). ]]>
Las más recientes investigaciones y validaciones del GPB que se ejecutan a escala de campo, vislumbran en promisorios resultados en los cultivos del frijol y la soya, un efecto sinérgico entre oligosacarinas exógenas y endógenas con inóculos microbianos, lo que permite considerar la utilización de oligogalacturónidos y quitosanas para la potenciación sinérgica o aditiva del biofertilizante respectivo, en el proceso simbiótico y de crecimiento de las leguminosas.

CONCLUSIONES

Las oligosacarinas constituyen compuestos naturales, no tóxicos y biodegradables, con diversos efectos biológicos en plantas y microorganismos que le confieren atractivos para su aplicación en la agricultura sostenible e intensiva, en la sustitución de agroquímicos para la protección de las plantas contra enfermedades y como sustitutos de reguladores del crecimiento.

Aunque son estructuras que forman parte de las paredes celulares de plantas y microorganismos, existen otras fuentes, comerciales o de desechos industriales, que permiten abaratar su obtención, la cual, puede realizarse mediante métodos químicos, físicos y enzimáticos, que no resultan de alto costo.

Resultados del GPB, tanto en el desarrollo de productos a base de oligosacarinas como en su aplicación y extensión a escala productiva, demuestran la potencial introducción de algunos de estos productos en el beneficio de la agricultura cubana e internacional, como sustitutos de hormonas en el cultivo in vitro, alternativas de protección contra el estrés y reguladores del crecimiento y los rendimientos de los cultivos.

Los autores quieren agradecer a la International Foundation for Science (IFS) y a la Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons (OPCW) por su contribución a las investigaciones que conllevaron a los resultados del Grupo de Productos Bioactivos del INCA que se recogen en esta revisión. El apoyo de esta organización se realizó a través de los proyectos F-4446-1 y F-4446-2F mediante financiamiento para equipamiento, reactivos, material informático e información científica.

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Recibido: 26 de diciembre de 2014
Aceptado: 20 de marzo de 2015