Purificación y caracterización proteica de una cepa cubana del virus de la hepatitis A

RESUMEN

Palabras clave: VIRUS DE LA HEPATITIS A HUMANA/aislamiento y purificación; PROTEINAS VIRALES/análisis; IMITACION MOLECULAR; ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA/métodos; WESTERN BLOTTING/métodos; CUBA.

INTRODUCCION

Los estudios biológicos para la caracterización del VHA se han obstaculizado por la ausencia de un sistema de cultivo eficiente in vitro para la producción de gran cantidad de partículas.³ Esto ha limitado la obtención del antígeno (Ag) viral para el diagnóstico y la producción de vacunas. Asimismo, la detección de proteínas virales se ha visto dificultada debido al elevado fondo de productos celulares como resultado de la inhabilidad del virus para inhibir la síntesis de proteínas del hospedero.⁴

El VHA se ha logrado purificar a partir del cultivo infectado mediante diversas estrategias que incluyen desde la ultracentrifugación en gradiente hasta los métodos cromatográficos,^5-9 para ello se considera el tamaño de la partícula, su coeficiente de sedimentación y las propiedades iónicas.

El Western Blotting, que tiene la ventaja de combinar el alto poder de la separación electroforética de las proteínas y la gran sensibilidad de la inmunodetección, ha sido una de los métodos más utilizados para la caracterización proteica del VHA.^4,6,7,10-13

Como la afección que produce este virus es endémica en Cuba y afecta fundamentalmente a los niños en edad preescolar y escolar, y teniendo en cuenta que la vacunación parece ser un método prometedor para el control de esta enfermedad, nos interesamos en comenzar a realizar la caracterización de las cepas aisladas en Cuba,¹⁴ con el fin de seleccionar los aislamientos que reúnan las mejores propiedades antigénicas para la obtención de una vacuna inactivada.

MATERIAL Y METODO

Se utilizaron 19 frascos de 225 cm² con monocapa confluente de la línea celular continua de riñón fetal de mono rhesus (FRhK₄) procedente de la American Type Culture Collection (ATCC) en un rango de pases del 38 al 48. Las células se inocularon con la cepa M₂ del VHA aislada en Cuba en 1991,¹⁴ que se encontraba en el noveno pase en estas mismas células. La dilución del inóculo fue de 1:50 en medio de mantenimiento. Después de dejar el inóculo en contacto con la monocapa celular durante 1 hora a 37°C, se procedió a añadir el medio de mantenimiento que consistió en Dulbecco-MEM (GIBCO BRL, Escocia) con suero de ternero fetal (STF) (INTEGRA BIOSCIENCES, UK) al 2 % y gentamicina al 0,2 %. Los cultivos se incubaron durante 12 días a 37 °C con cambios de medio cada 5 días.

PURIFICACION DE PARTICULAS Y PROTEINAS VIRALES

Se descartó el sobrenadante y la monocapa celular se lavó 2 veces con tripsina-versene (0,25 % de tripsina y 0,02 % de versene en PBS 1X), dejándose 1 mL de esta solución en contacto a 37°C hasta que se observó el desprendimiento de ésta. El resto del protocolo de purificación se hizo según lo descrito por Bishop et al. (figura 1). ]]> Para preparar el gradiente discontinuo sacarosa-glicerol se dispensaron 0,5 mL de glicerol al 80 % vol/vol en NT (NaCl 100 mM, Tris HcL pH 7,4 10 mM) en el fondo del tubo para ultracentrífuga y a continuación se agregaron 1,5 mL de soluciones de sacarosa en concentraciones decrecientes de 30, 20 y 10 % (peso/vol en NT), añadiéndose a esta última SDS a una concentración final de 1 %. sobre el gradiente se aplicaron 6 mL procedentes de la ultrafiltración y ésta se realizó a 35 000 r.p.m. durante 6 horas a 18°C. Se colectaron con pipeta, desde el borde superior del tubo hasta el fondo, 11 fracciones de 1 mL.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS Y DETECCION DEL VIRUS PURIFICADO

La concentración de proteínas del material aplicado al gradiente y de cada una de las fracciones obtenidas después de la ultracentrifugación, se determinó por el método de Lowry.¹⁵ La presencia del antígeno viral en estas muestras se detectó mediante un ELISA de doble anticuerpo normalizado en el Laboratorio de Hepatitis del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) (resultados no publicados). La placa de ELISA (COSTAR) se sensibilizó con inmunoglobulinas IgG anti-VHA purificadas por cromatografía de intercambio iónico a una concentración de 20 mg/mL, incubándose a temperatura ambiente (TA) de 18 a 24 horas en cámara húmeda. Se realizaron 3 lavados con PBS-Tween₂₀ (PBS-T), luego de los cuales se añadieron las muestras a analizar y los controles, que se incubaron de forma similar. Como control positivo se utilizó antígeno del VHA obtenido en el Laboratorio Nacional de Referencia de Hepatitis (IPK) y como control negativo células FRhK₄ sin inocular. Después de 4 lavados se aplicó el conjugado (anti-VHA marcado con peroxidasa) diluido 1/1 000, incubándose en cámara húmeda a 37 °C durante 90 minutos. Posteriormente, se realizaron 5 lavados y se añadió el sustrato. La reacción se detuvo a los 15 minutos con H₂SO₄ al 12,5 % y se leyó en lector de ELISA a una l de 492 nm.

ANALISIS DE LAS PROTEINAS VIRALES ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE-SDS)

Se realizó una electroforesis en gel de policrilamina al 12,5 % según método de Laemmli.¹⁶ Para ello se utilizaron como muestras las 4 últimas fracciones (8, 9, 10 y 11) del gradiente y el material que fue aplicado a éste, las cuales se diluyeron 1/0,25 en buffer Laemmli 2x, siendo calentadas durante 5 minutos a 100 °C. En un gel de 7x8 cm sólo se aplicaron muestras de las fracciones a estudiar, incluyéndose además un marcador de peso molecular (SIGMA, EE.UU.) Esa corrida se realizó a 120 volts durante 90 minutos y el gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa.

En otro gel de 14x16 cm se aplicaron todas las muestras y la corrida se efectuó a 60 mA durante 90 minutos. Este gel se utilizó para teñir con nitrato de plata.¹⁷

WESTERN BLOTTING (INMUNODETECCION DE PROTEINAS)

Se realizó según el método reportado por Burnette.¹⁸ La transferencia se hizo a membrana de nitrocelulosa con poros de 0,2 mm (Hoefer Scientific Instruments, EE.UU.) en transfer semiseco durante 3 horas a 200 mA.

La membrana se incubó toda la noche a TA en agitación orbital suave con leche descremada (OXOID, Inglaterra) al 5 % en PBS-T al 0,1 %. Después de retirar el bloqueo, se incubó en iguales condiciones a las anteriores, pero con suero humano hiperinmune al VHA (título 10 000 - 100 000) a una dilución de 1/20 en tampón de dilución (leche descremada al 1 % en PBS-T al 0,1 %). Al incluir esta incubación se procedió a lavar la membrana 3 veces durante 5 a 10 minutos con solución de lavado (PBS-T al 0,1 %). El conjugado antiinmunoglobulinas humanas marcado con peroxidasa fue diluido 1/1 000 en tampón de dilución y se dejó incubando 1 hora a TA en agitación suave. Seguidamente se realizaron 3 lavados similares a los ya descritos y se procedió a revelar con el sustrato (3-3 diaminobencidina y peróxido de hidrógeno).

Los patrones proteicos obtenidos fueron comparados con los reportados para otras cepas del VHA, utilizadas en la producción de vacunas.^4,7,10,13,19

RESULTADOS

En la tabla se presentan los resultados de la determinación de la actividad específica, el rendimiento y el factor de purificación de cada fracción del gradiente.²¹ Como se puede observar, la actividad específica (actividad antigénica por cada mg de proteína) de la muestra inicial aplicada al gradiente es superada por la de las 4 últimas fracciones, el valor es prácticamente triplicado en la 10 y en la 11. En cuanto al rendimiento (tanto por ciento de recuperación de la actividad inicial), éste es mayor a partir de la fracción 8, en la última fracción se recupera casi el 30 % de la actividad inicial. Por otra parte, el factor de purificación que expresa cuántas veces ha sido purificada una proteína en relación con el control inicial presenta su valor máximo en la fracción 11.

En cuanto a la electroforesis de proteínas (figura 3), se puede observar que las bandas que corresponden a la muestra que se concentró con la ultrafiltración y se aplicó en el gradiente, son más intensas y más numerosas que las de las 4 últimas fracciones, lo que coincide con la deter-minación de la concentración de proteínas. En lo referente a la caracterización de las proteínas virales, vemos que en las fracciones 10 y 11 que a su vez presentaron las cifras de DO más altas por el ELISA, predominan las bandas cercanas a 30 KDa, 40 KDa y entre 43 y 67 KDa.

En el revelado de Western Blotting (figu-ra 4) la banda inmunodetectada más intensa que se presenta en las 4 últimas fracciones se corresponde con un PM de 33 KDa. También se observan bandas con pesos de 42 KDa, 56 KDa, 66 KDa y 72 KDa, así como bandas menores y más débiles de 24 KDa y 22 KDa.

DISCUSION

Por otro lado, como este virus es estable frente a altas concentraciones de detergente, su purificación y concentración se pudo hacer en un único paso de ultracentrifugación, maximizando el recobrado y minimizando el tiempo.

Los resultados representados en la figura 2 demuestran que la mayor parte del material celular quedó en las primeras 7 fracciones del gradiente donde la concentración de proteínas es mayor. La detección de DO indicativa de positividad en las primeras 6 fracciones puede corresponderse con la existencia de material viral unido estrechamente al celular, aun después de los pasos de purificación realizados, lo cual no es contradictorio con el conocimiento que existe acerca de la íntima relación virus-célula que se establece durante la replicación del VHA. Además de esto, es importante tener en cuenta que durante la multiplicación viral sólo se forman viriones infecciosos, sino también existen proviriones, procápsides e incluso pentámeros que no llegan a ensamblarse^4,6,7,20 y que tienen un coeficiente de sedimentación diferente al virión maduro, por lo que pueden quedar ubicados en los distintos niveles del gradiente. Estos resultados también indican que en las 4 últimas fracciones (8, 9, 10 y 11) quedaron ubicadas de forma predominante las partículas y proteínas virales.

Los datos expuestos en la tabla, conjuntamente con los mostrados en la figura 2 permiten asegurar que las proteínas y antígenos del VHA se purificaron y concentraron en un único paso, lo que coincide con los resultados reportados.⁷

Con la electroforesis de proteínas, se puede confirmar que las 4 últimas fracciones están más libres de contaminantes celulares y que por tanto contienen la mayor cantidad de antígenos y partículas virales, lo que a su vez coincide con lo reportado en una purificación similar,⁷ y se corresponde con la determinación de la concentración de proteínas. Los productos del lisado celular favorecen que se enmascare la presencia viral (enmascaramiento estérico de proteínas), lo cual es eliminado en el proceso de ultracentrifugación donde las proteínas y partículas virales, al ser más pequeñas, migran al fondo del tubo y se separan de las celulares.

Las bandas que están al nivel de los 30 KDa pueden corresponderse con VP1 y VP0, y las que están cercanas a 27 KDa y 24 KDa con VP2 y/o VP3. Por otro lado, se han descrito precursores de las proteínas de la cápside de aproximadamente 40 KDa (PX) y de 100 KDa (P1/2A),^4,6 que podrían justificar la presencia de las bandas superiores, esto último sin descartar que proteínas celulares unidas a las virales hayan migrado hacia estas fracciones. Un patrón electroforético similar se ha reportado para otras cepas del VHA purificadas a partir del cultivo de células.^{7,10-12,19,22} ]]> En cuanto al revelado del Western Blotting, la banda inmunodetectada más intensa de 33 KDa indica la existencia de VP1 que es la proteína mayor de la cápside viral y la que induce la formación de los anticuerpos neutralizantes del virus. Las bandas con pesos de 56 KDa, 66 KDa y 72KDa podrían corresponderse con proteínas virales que quedaron unidas a proteínas celulares, a pesar de la purificación realizada, como ya se ha comentado. Este patrón también se ha reportado por otros autores,^7,10,13,22 incluso utilizando anticuerpos más específicos para el reconocimiento de proteínas virales purificadas a partir del cultivo celular.

Las bandas menores y más débiles de 24 KDa y 22 KDa podrían ser VP2 y VP3, respectivamente; su identificación sólo es posible mediante la utilización de anticuerpos específicos a dichas proteínas. Por otra parte, la banda inmunodetectada de 42 KDa, podría indicar la presencia de la proteína precursora de VP1 (PX).^4,6

En un estudio realizado en células FRhK₄ infectadas con el VHA,²³ se detectó que proteínas celulares ribosomales que quedan unidas a la región no codificante 5' del genoma viral durante la replicación, tienen un PM de 39 KDa y 110 KDa.

Con este trabajo se pudo confirmar que el patrón proteico de la cepa M₂ es similar al obtenido por otros autores con otras cepas del VHA aisladas al nivel mundial. La normalización de la técnica del Western Blotting posibilitará su aplicación a estudios posteriores relacionados con este virus.

SUMMARY

Key words: HEPATITIS A; VIRUS HUMAN/isolation and purification; VIRAL PROTEINS/analysis; MOLECULAR MIMICRY; ELECTROPHORESIS; POLYACRYLAMIDE GEL/methods; BLOTTING; WESTERN/methods; CUBA.

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