Se normalizó la DL50 de las cepas de Leptospira interrogans utilizadas en el ensayo de potencia de la vacuna antileptospirósica trivalente cubana para uso humano. Se introdujo en la metodología el control del contenido de leptospiras de los cultivos mediante dilución de ajuste (10 a 12 leptospiras por campo). Ésta fue la clave de la normalización del ensayo, por garantizar la reproducibilidad del valor estimado de DL50 de cada serogrupo: 105,98 para canicola, 105,60 para icterohaemorrhagiae y 106,49 para pomona, con límites de 1 log10 de 104,98 - 106,9; 104,60- 106,60 y 105,49 -107,49 respectivamente, y para un intervalo de confianza de 95 % (±2 DE) fueron 105,54 - 106,19; 105,33 - 105,75 y 106,35 - 106,60 respectivamente, que son inferiores a los anteriores, lo que implica aún mayor reproducibilidad. La metodología descrita fue satisfactoria en la normalización de la DL50 de las cepas de reto y podría ser utilizada también en la evaluación de la virulencia de otras cepas de L.interrogans, incluidas las de producción de la vacuna.
Descriptores DeCs: DOSIFICACION LETAL MEDIANA; LEPTOSPIRA INTERROGANS/inmunología; LEPTOSPIRA INTERROGANS/aislamiento & purificación; VACUNAS BACTERIANAS; CUBA.
La leptospirosis es una enfermedad de amplia difusión en todo el mundo. Su agente causal es Leptospira interrogans, se reportan más de 50 especies animales que sirven de reservorio a este microorganismo (roedores, insectívoros, carnívoros, primates, ranas, serpientes, lagartos, peces, etcetéra), por lo que se encuentra en constante circulación en el entorno natural e infectan a los animales domésticos y al hombre. Desde el punto de vista epidemiológico la leptospirosis se considera una zoonosis. El agua contaminada es uno de los factores que más contribuyen a su diseminación.1,2
Las medidas de prevención son múltiples y entre ellas se destacan el control de roedores, la higiene del medio ambiente, y la vacunación de animales y personas con alto riesgo de padecer la leptospirosis.2-5
Las vacunas utilizadas para estos fines se controlan en el laboratorio durante su proceso de producción mediante diferentes ensayos. Uno de ellos es el de potencia, el cual mide la protección que confiere el producto a animales inmunizados que reciben una dosis conocida de leptosopiras virulentas, la cual se expresa cuantitativamente y su unidad de medida es la dosis letal 50 % (DL50). Este término es muy utilizado para expresar la magnitud de la virulencia de microorganismos (virus, bacterias) y la toxicidad de sustancias sintetizadas por éstos. Se define en general como la menor cantidad de gérmenes virulento o de toxina que al administrarse por la vía apropiada a un número de animales susceptibles, provoca la muerte de la mitad de éstos (50 %) al término de un período dado.
En la producción de vacunas, las dosis de reto o de confrontación de los animales inmunizados correspondientes al ensayo de potencia se refieren siempre en términos de DL50.6-10 Ésta a su vez se puede expresar de diferentes maneras: como gérmenes por dosis, títulos, dilución, unidades arbitrarias, unidades de masa o volumen (en el caso de toxinas), etcétera.
En relación con la vacuna antileptospirósica, las cepas usadas en la producción deben mantener altos niveles de virulencia para lograr un preparado de calidad; este parámetro se controla mediante la evaluación de la DL50 , al igual que en las cepas destinadas al ensayo de potencia, donde se necesita además que el valor estimado sea reproducible para garantizar dosis de confrontación que contengan de 10 a 10 000 DL50, como se especifica en algunos documentos regulatorios.9,10
La Dl50 de L. interrogans, al igual que para otras bacterias y virus, se determina mediante un ensayo biológico consistente en inocular diluciones seriadas (generalmente con factor igual a 10)preparadas a partir de una suspensión virulenta del microorganismo, las cuales se inoculan en hámsters u otros animales de laboratorio que sean susceptibles. Este ensayo es muy específico, pero está sometido a grandes variaciones debidas sobre todo a la naturaleza biológica de sus componentes fundamentales: animales y microorganismos.
]]> Por estas 2 razones es muy importante, cuando se define la DL50 de un germen determinado, fijar todos los parámetros posibles bajo los cuales se desarrolla satisfactoriamente el ensayo, para que los valores calculados sean reproducibles y, por tanto, útiles para los fines a los que están destinados. El primer parámetro que se debe controlar es la conservación de la virulencia de las cepas. La liofilización es una forma muy usada para estos fines, sobre todo si se trata de microorganismos que intervienen en la producción y el control de vacunas por sus múltiples ventajas, entre ellas, la facilidad de almacenamiento a largo plazo en condiciones normales de refrigeración (2 a 8EC) y la garantía de la integridad de las cepas al utilizar el sistema de lotes semilla recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS),11 que implica reproducibilidad en los procesos y ensayos donde sean utilizadas las cepas.L. interrogans pierde con facilidad su virulencia cuando se somete a pases repetidos por medios de cultivo; la liofilización no ha sido la forma más exitosa para su conservación,12 lo cual limita la posibilidad de aplicar correctamente el sistema de lotes semilla. El mantenimiento en nitrógeno líquido ha mostrado ser apropiado,13 pero resulta costoso y limitado. El uso de medios semisólidos es frecuente, aunque tiene el inconveniente de que no conserva la virulencia por largo tiempo; algunas publicaciones refieren que L. interrogans se mantiene virulenta mediante pases por animales susceptibles,3,14 y en el caso específico de las cepas de confrontación, el día del ensayo se recuperan los gérmenes de macerados de hígado de animales moribundos con los que se preparan las suspensiones para retar a los animales inmunizados.14 Este método es muy laborioso y no permite un buen control del inóculo. Otras referencias no especifican cómo se deben conservar las cepas de reto virulentas.9,10,15
El segundo parámetro en importancia se relaciona con el cultivo: medio, edad y condiciones en que debe mantenerse hasta el momento de ser utilizado. El tercero se refiere al ajuste de la suspensión a partir de la cual se preparan las diluciones seriadas que reciben los animales. Se reporta el uso de la cámara de Petroff-Hausser para realizar el conteo del número de leptospiras presentes en el cultivo de partida,10 en ese caso la DL50 se expresa en leptospiras por dosis inoculada, valor que se toma después para preparar los inóculos de reto de modo que contengan de 10 a 10 000 DL50.
El cuarto parámetro se relaciona con la especie animal que se va a utilizar, la cantidad y el peso; a veces el sexo también es importante. El quinto tiene que ver con la dosis y la vía de administración del inóculo, el sexto con las condiciones en que deben mantenerse los animales y el séptimo con el tiempo de observación de éstos.
Si se procura que estas condiciones se repitan para cada ensayo, entonces la variación en los resultados será menor y mayor la reproducibilidad, por lo que se garantizará el éxito de la prueba.
En el presente trabajo se describe la metodología utilizada para normalizar la DL50 de las cepas de L. interrogans serogrupos canicola, icterohaemorrhagiae y pomona que intervienen en el ensayo de potencia de la vacuna antileptospirósica trivalente cubana (vax-SPIRAL), de acuerdo con los parámetros señalados.
Cepas de L. interrogans. Se usaron las cepas canicola canicola No. 87, pomona mozdok No. 108 icterohaemorrhagiae copenhageni No. 169 de los laboratorios de producción de la vacuna veterinaria (LABIOFAM), conservadas en medio Fletcher. Estas cepas fueron aisladas en Cuba, en los años 1988, 1990 y 1993, respectivamente, por el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Arroyo Arenas, en La Habana.
Medios de cultivo y soluciones. Medio Fletcher16 para conservar las cepas; medio EMJH17 para realizar aislamientos de hígado, pases de cepas y diluciones de los cultivos; solución de formaldehído al 10 % tamponada con fosfatos (FT) para inactivar los microorganismos.
Animales. Hámsters (Mesocricetus auratus) de 40 a 60 g, de igual sexo, suministrados por CENPALAB, Cuba.
Preparación del lote semilla de trabajo. Se inocularon animales con los gérmenes virulentos, que se recuperaron posteriormente, por siembra en medio EMJH, de muestras de hígado de los animales moribundos. Después de 7d de incubación a 28 EC se dio pase a tubos que contenían medio Fletcher, los cuales conformaron el lote semilla de trabajo y se mantuvieron a 28 EC.
]]> Determinación de la DL50. Seis días antes del ensayo, se transfirieron 0,5 mL de la conservación en medio Fletcher a 3 tubos com medio EMJH (a cada uno de ellos) y se incubaron a 28 EC. El día del ensayo se procedió a examinar la pureza y viabilidad de los cultivos por observación microscópica en campo oscuro y se prepararon diluciones 1:5; 1:10; 1:20 y 1:40 de éstos en medio EMJH, con un volumen máximo de 1 mL, a éstas se les adicionó respectivamente 50 FL de FT y se esperó 10 min para su inactivación. Usando microscopia de campo oscuro y aumento de 400 veces se procedió al conteo de los microorganismos en una muestra de 5 FL de la dilución correspondiente, colocados entre porta y cubreobjetos. Se observaron 20 campos y se contó el número aproximado de leptospiras en cada uno; se calculó la media aritmética, la cual se consideró satisfactoria si daba como resultado 10 a 12 leptospiras por campo; si con ninguna de las diluciones antes mencionadas se obtenían esos valores, se realizaban los cálculos necesarios para determinar de forma teórica la dilución correcta, la cual se preparó a partir del cultivo puro, se inactivó y se sometio al conteo. La dilución que presentó 10 a 12 leptospiras por campo se denominó dilución de ajuste y se consideró apropiada para preparar una dilución equivalente a partir del cultivo puro, de volumen no inferior a 5 mL de la cual se tomó una muestra de 1 mL, se inactivó y verificó por conteo, como ya se ha descrito, que contenía de 10 a 12 leptospiras por campo. A partir de la dilución de ajuste sin inactivar se prepararon diluciones seriadas con factor de 10, desde 10-1 hasta 10-8 y se usó medio EMJH como diluente; posteriormente se inocularon 6 animales por cada dilución con 0,5 mL vía intraperitoneal y se observaron durante 14 d; se anotaron las muertes ocurridas y los animales que presentaron síntomas el último día se reportaron como muertos. Con los datos obtenidos se calculó la DL50 por el método de Reed-Muench,18 y se expresó en términos del inverso del valor de la dilución donde ocurrió la muerte del 50 % de los animales inoculados, referido a la dilución de ajuste.Se realizaron 14 determinaciones de la DL50 de cada una de las cepas de reto, mediante igual metodología. El valor estimado de DL50 para cada serogrupo se calculó sobre la base de la media geométrica de los valores individuales obtenidos respectivamente. En el serogrupo icterohaemorrhagiae se observó que cuando las conservaciones en medio Fletcher tenían más de 100 d de edad, el valor de la DL50 se afectaba de forma apreciable; esto ocurrió en los 2 últimos ensayos, los cuales fueron excluidos de los cálculos. Este comportamiento no sucedió con pomona, que se mantuvo muy estable. La conservación de canicola tenía sólo 57 d de edad cuando concluyó el estudio y su comportamiento era adecuado.
En los 3 casos los animales inoculados con la dilución de ajuste murieron el quinto día posterior a la inoculación en todos los ensayos realizados.
La tabla presenta el resumen de los resultados de la determinación de la DL50 para cada serogrupo. Los valores estimados de la DL50 que aparecen en ésta se calcularon a partir de los 12 primeros ensayos realizados.
Tabla. Resumen de los resultados de los ensayos para normalizar la DL50 de los serogrupos de Leptospira interrogans
| Serogrupo | Dilución de ajuste Media geométrica ]]> (DL50/dosis) | Varianza (S2) | Límites 95 % de confianza | Límites 1 log10 |
| canicola | 105,98 | 1,15 | 105,54 y 106,19 | 104,98 y 106,98 |
| ]]> icterohaemorrhagiae | 105,60 | 9,78 | 105,33 y 105,75 | 104,60 y 106,60 |
| pomona | 106,49 | 2,43 | 106,35 y 106,60 | 105,49 y 107,49 |
Los valores de la media geométrica de las DL50 dosis referidos a la dilución de ajuste fueron 105,98 para canicola, 105,60 para icterohaemorrhagiae y 106,49 para pomona; por lo que la virulencia de las cepas en orden decreciente fue pomona mayor que canicola y ésta a su vez mayor que icterohemorrhagiae.
Los límites máximos del intervalo de la media reportados para este tipo de ensayo6 son de 1 log10 cuando se parte siempre del mismo cultivo semilla de trabajo, por lo que para canicola resultaron ser 104,98 y 106,98, para icterohaemorrhagiae 104,60 y 106,60 y para pomona 105,49 y 107,49. Sin embargo, los límites calculados para un intervalo de confianza de 95 % (± 2DE) fueron para canicola 105,54 y 106,19, icterohaemorrhagiae 105,33 y 105,75 y para pomona 106,35 y 106,60, que son inferiores, por lo que se garantiza mayor reproducibilidad en los resultados.
Tomando como referencia la varianza (S2), el serogrupo que presentó mayor variación fue icterohaemorrhagiae (S2 = 9,78) y el menos variable fue canicola (S2 = 1,15). Esto concuerda con las variaciones en el crecimiento del serogrupo icterohaemorrhagiae en medio EMJH observadas en los diferentes ensayos, que parecen influir directamente en su virulencia. No ocurrió así con los serogrupos canicola y pomona, que presentaron patrones de crecimiento más estables.
El número de pruebas realizadas siguiendo siempre la misma metodología garantizó que los parámetros que influían de forma directa en los resultados estuvieran siempre bajo control y permitió normalizar el ensayo de determinación de la DL50 de las cepas de reto utilizadas en el control de la potencia de la vacuna antileptospirósica trivalente cubana para uso humano (vax-SPIRAL), ya que se demostró que los límites de los valores estimados de las respectivas DL50 para un intervalo de confianza de 95 % (± 2DE), se encontraban ampliamente dentro de los reportados para 1 log10.
El parámetro crítico fue el ajuste del cultivo, que se resolvió con la introducción de la dilución de ajuste, la cual constituyó el elemento clave en la normalización del ensayo, pues resultó ser la base de la reproducibilidad del estimado del valor de DL50 determinado para los serogrupos estudiados, ya que aparte del crecimiento obtenido en el cultivo puro, cada serogrupo se ajustó para cada ensayo de acuerdo con el mismo criterio, de modo que tuviera de 10 a 12 leptospiras/campo y de esta manera el inóculo de partida fue semejante cada vez que se efectuó un nuevo ensayo. Esto hizo que la metodología descrita se diferenciara de las reportadas, donde no se especifica la manera de ajustar el cultivo9,14,15 o se realiza por conteo de leptospiras en la cámara de Petroff-Hausser.10 Este tipo de ajuste fue llevado a cabo al principio en nuestro laboratorio, pero en experiencias previas de validación demostró mayor variación y dependencia del analista que el conteo por campos (no se presentan los datos), por lo que nos decidimos por este último. Los resultados obtenidos fueron adecuados, por lo que el conteo por campos se consideró satisfactorio para estos fines.
La muerte de los animales inoculados con la dilución de ajuste al quinto día se tomó como criterio de calidad del lote semilla de trabajo. Esta característica se logró mediante pases repetidos por animales.
Se debe seguir esta metodología para lograr resultados satisfactorios en los ensayos de potencia de la vacuna antileptospirósica cubana para uso humano (vax-SPIRAL); además, podría ser utilizada también en la evaluación de la virulencia de otras cepas de L. interrogans incluidas las de producción de la vacuna.
Parasitologists from different medical institutions in Havana City carried out he external validation of ENZYMEBA, a diagnostic procedure of intestinal amebiasis developed at the «Pedro Kourí» Institute of Tropical Medicine. To this end, serial faeces specimens from 212 individuals were collected and observed on the microscope (reference test). The ENZYMEBA immunoassay (validation test) was also made. On comparing ENZYMEBA with the microscopic examination, satisfactory indexes of sensitivity and specificity were found. No cross-reactions were detected in faeces specimens, where found other parasites were present, too. Taking into account that only one faeces specimen per patient is enough for the diagnosis of intestinal amebiasis with ENZYMEBA, this procedure may be useful in studies of therapeutical efficacy and prevalence.
Subject headings: IMMUNOENZYME TECHNIQUES; ENTAMOEBA HISTOLYTICA/ enzymology; FECES/parasitology; EFFICACY; PREDICTIVE VALUE OF TESTS; PEPTIDE HYDROLASAS/analysis; CUBA.
Recibido: 25 de enero de 1997. Aprobado: 18 de julio de 1997.
]]> Lic: Esther María Fajardo. Instituto "Finlay". Ave. 27 No. 19805. La Lisa, Ciudad de La Habana. Cuba, Código Postal 11600.1 Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada. Instituto "Finlay".
2 Licenciado en Microbiología. Especialista en Control de Medicamentos. Instituto "Finlay".
3 Médico Veterinario. Especialista en Producción de Vacunas Veterinarias. LABIOFAM.
4 Médico Veterinario. Especialista en Control de Medicamentos. Instituto "Finlay".
5 Licenciado en Matemáticas. Investigador Agregado. Instituto "Finlay".
6 Técnico Medio en Procesos Biológicos. Instituto "Finlay".
7 Técnico Medio en Farmacia Industrial. Instituto "Finlay".