Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Evolución de la resistencia a insecticidas en Culex quinquefasciatus (Díptera: Culicidae) en un área de La Habana

Dr. Juan A. Bisset,¹ Lic. María M. Rodríguez,² Lic. Cristina Díaz² y Téc. Alaín Soca³

RESUMEN

El uso de malation para el control de mosquitos en Cuba durante 7 años hasta 1986 seleccionó 2 mecanismos de resistencia, el de elevada actividad de esterasas no específicas y la acetilcolinesterasa alterada (Ache) en Culex quinquefasciatus (Say). En La Habana, específicamente en el área de estudio (Río Quibú), el malation fue reemplazado por cipermetrina en 1987, y ciclos de tratamiento con cipermetrina han sido usados desde 1987 hasta la fecha en forma de radiobatida cuando se incrementan las poblaciones de Aedes o Culex. En Culex quinquefasciatus (Say) del Río Quibú, los niveles de resistencia declinaron significativamente desde 1986 hasta 1997, sobre todo a malation, no resultó así para los piretroides, donde se observó un incremento de la resistencia durante este período de 11 años. El mecanismo de esterasas elevadas se incrementó a una frecuencia de 1 al igual que hubo un incremento en la frecuencia del mecanismo de Ache. Hasta 1986 se seleccionó en esta población la esterasa B1, responsable de la resistencia a malation, pero no a piretroides. A partir del uso de piretroides para el control en esta área se seleccionaron 2 nuevos fenotipos de esterasas, nombradas A6 y B6, en apariencia relacionadas con la resistencia a piretroides.

Descriptores DeCS: INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS; ESTERASAS; ACETILCOLINESTERASA; RESISTENCIA A INSECTICIDA.

El uso prolongado y sostenido de malation durante la campaña de erradicación del Aedes aegypti (Linneaus) en Cuba, favoreció el reemplazo de este mosquito por otro no menos peligroso, Culex quinquefasciatus, en zonas urbanas.¹ Cx. quinquefas-ciatus es un importante vector de la filariasis de Bancrofti, y desempeña un papel importante en la transmisión de algunas encefalitis.² Es una de las especies de mosquito mejor adaptada a las más diversas condiciones y modalidades del hábitat humano.³

Los insecticidas organofosforados han sido usados contra especies de Culex en muchos países, y el mecanismo basado en la elevada actividad de esterasa ha sido el predominantemente seleccionado. Ambos mecanismos de resistencia, basados en una alta actividad de esterasas y acetilcolinesterasa alterada, han sido seleccionados por la presión de los organofosforados sobre Culex pipiens en Francia e Italia y Cx. quinquefasciatus de Cuba.^4,5-8

En Cuba el malation fue usado como larvicida y en forma de rociado espacial por 7 años hasta 1986. El desarrollo de resistencia ha conducido a realizar ciclos alternativos de cipermetrina y malation y cipermetrina sola en el área central de La Habana en 1987.⁵ A principios de 1990 se realizaron bioensayos con permetrina y cipermetrina en poblaciones de Cx. quinquefasciatus en la zona central de La Habana y esto sugirió que la resistencia a piretroides estaba comenzando a desarrollarse.⁷

En este trabajo se siguió la evolución de la resistencia a insecticidas organofosforados y piretroides en Cx. quinquefasciatus durante un período de 11 años, se compararon los años 1986 y 1997, y se midieron los cambios en la frecuencia de los mecanismos de resistencia, así como el tipo de esterasa seleccionada en poblaciones bajo diferentes presiones de selección con insecticidas.

MÉTODOS

QUIBÚ: Una cepa obtenida de la misma área en 1986 y otra colectada en 1997.

Los niveles de resistencia en la cepa QUIBU fueron comparados con la población susceptible BLEUET por los bioensayos en larvas. Las larvas de IV estadio fueron expuestas a insecticidas por el método de la Organización Mundial de la Salud (OMS).⁹ Cada insecticida y las soluciones de acetona fueron adicionadas para dar las concentraciones requeridas para el ensayo.

La acción de 2 sinergistas, SSS tributyl phosphorotrithioate (DEF) y piperonyl butoxide (PB) fueron investigados mediante la exposición de las larvas de cuarto estadio a 0,008 mg/L de DEF o 5 mg/L de PB durante 4 h previo a la adición de la solución del insecticida.¹⁰ No existió mortalidad a estas concentraciones del sinergista solo.

Para los bioensayos se realizaron 5 réplicas (20 larvas por réplica) para 5 dosis, que provocaron una mortalidad entre 2 y 98 %. La concentración final de acetona en las soluciones de prueba fue siempre ajustada a 1 % del volumen final de la prueba. Esta concentración de acetona no causó mortalidad en los controles. El análisis de regresión de las líneas de los bioensayos se realizó con el programa probit log.¹¹

La acetilcolinesterasa insensitiva (Ache) fue ensayada en insectos individuales después que fueron centrifugados los homogenatos a 12 000 g por el método de Hemingway y otros.¹² La actividad de Ache en la fracción normal e inhibida fue leída 20 min después de comenzar la reacción a 420 nm. La actividad de las esterasas se determinó individualmente en larvas según el método de Peiris & Hemingway.¹³

Se determinó la frecuencia de genes de resistencia para ambos mecanismos, el de esterasas y el de Ache alterada según la fórmula de equilibrio de Hardy-Weinberg.

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para la identificación de las esterasas.

• Buffer del gel: 0,1 mol tris borato/EDTA buffer pH 8,6.
]]> Buffer de corrida: 0,1 mol de tris borato/EDTA pH 8,0.
• No se utilizó gel concentrador, solo un gel de corrida a un porcentaje de 7,5. Se aplicaron 10 uL de muestra + 10 uL del indicador redox bromofenol azul (0,5 % diluido en sacarosa 5 %). La corrida se realizó a 200 V durante 1 h aproximadamente.
• Para la tinción se sumergieron los geles en 50 mL de buffer fosfato, conteniendo 4 mL de cada uno de los sustratos inespecíficos de las esterasas (a -naftil acetato y de b -naftil acetato) y se le añadió 0,5 g del colorante fast-blue RR. El gel se sumergió en ácido acético 10 % para fijar la coloración de las bandas.

RESULTADOS

Se analizaron los niveles de susceptibilidad o resistencia a insecticidas, organofosforados, piretroides y un carbamato en Cx. quinquefas-ciatus procedente del Río Quibú. Para el cálculo del valor del factor de resistencia (FR₅₀), se utilizaron los valores de CL₅₀ de la cepa de Cx. quin- quefasciatus de referencia BLEUET.

Como se muestra en la figura 1, la resistencia a los insecticidas organofosforados declinó en el período comprendido entre 1986 y 1997, principalmente a malation, declinando de un valor de FR₅₀ de 94 x en 1986 a 23,6 x en 1997. La resistencia a malation disminuyó, pero aún se mantienen los genes de la resistencia a este insecticida en las poblaciones de Cx. quinquefas-ciatus del Río Quibú.

En 1986 no se observó resistencia a pirimifos metil (1x), pero declinó aún más su valor hasta 0,2 x. También se observó una disminución de la resistencia al insecticida organofosforado temefos (de 6,0 x a 1,3 x) y al carbamato propoxur (4,4 a 3,14 x).

Un comportamiento diferente se observó en este período con respecto a los piretroides. Como se observa en la figura 2, hubo un incremento de la resistencia a los 3 piretroides evaluados. Se incrementó la r esistencia a permetrina de 1,7 x a 10,33 x, a cipermetrina de 1,2 x a 14,4 x y a lambdacialotrina de 5,0 x a 28 x.

Fig. 1. Variación del factor de resistencia para los insecticidas organofosforados (malation, pirimitos metil y abate) y un carbamato (propoxur), calculados en 1986 y 1999, en Culex quinquefasciatus, procedente del Río Quibú.

Fig. 2. Variación del factor de resistencia (FR₅₀) para los insecticidas piretroides (permetrina, cipermetrina y lambdacialotrina), calculados en 1986 y 1997 en Cx. quinquefasciatus procedente del Río Quibú.

Para determinar in vivo el mecanismo de resistencia de las oxidasas de función múltiple, se utilizó el sinergista butóxido de piperonilo (PB) y se calculó el valor del factor de sinergismo (FS) para cada insecticida, comparando la CL₅₀ obtenida al aplicar el sinergista con la CL₅₀ obtenida sin aplicar este.

Como se observa en la tabla 1, el valor del FS resultó menor que 1 para todos los insecticidas organofosforados y carbamatos y mayor que 1 para los insecticidas piretroides, por lo que se infiere que el mecanismo de oxidasas de función múltiple no desempeña una función importante en la resistencia observada en la cepa QUIBU, 1997, a los insecticidas organofosforados malation y temefos, pero sí interviene en la resistencia observada a los piretroides.

TABLA 1. Valor del factor de sinergismo (FS), calculado para 3 insecticidas organofosforados (malation, pirimifos metil y temefos), 3 piretroides (permetrina, cipermetrina y lambdacialotrina), y un carbamato (propoxur) en Cx. quinquefasciatus procedente del Río Quibú, 1997, con la utilización del sinergista PB.

Se determinó la variación de la frecuencia de los mecanismos de resistencia de esterasas y acetilcolinesterasa entre los años 1986, 1990 y 1997 (tabla 2), con la utilización como cepa de referencia la cepa BLEUET. Como se muestra en la tabla 2, hubo una declinación entre 1986 y 1990 y un incremento tanto en la frecuencia del mecanismo de esterasas, como del mecanismo de Ache alterada entre 1990 y 1997.

TABLA 2. Cambios en la frecuencia de los mecanismos de resistencia de esterasas inespecíficas y acetilcolinesterasa alterada en el período comprendido entre los años 1986 y 1997, en Cx. quinquefasciatus del Río Quibú

Hasta 1986 se seleccionó en la población de Cx. quinquefasciatus del Río Quibú una esterasa denominada B1 (fig. 3), sin embargo después que se comenzaron a utilizar piretroides para el control en esta área, aparecieron 2 nuevos tipos de esterasas, clasificadas de acuerdo con su movilidad electroforética y su especificidad por sus sustratos a y b naftil acetato, como esterasas (Est) A6 y B6 (fig. 4).

Fig. 3. Patrones de esterasas observadas en una población de Culex quinquefasciatus del Río Quibú (esterasa B1), en el año 1986.

Fig. 4. Patrones de esterasas observadas en una población de Culex quinque-fasciatus del Río Quibú (esterasas B1-A6-B6), en el año 1997.

DISCUSIÓN

En 1986 hubo un incremento de las densidades de Cx. quinquefasciatus en áreas urbanas de Cuba a pesar del tratamiento de estas poblaciones con insecticidas, y se demostró la presencia de resistencia a malation en 2 poblaciones de campo de Cx. quin-quefasciatus, colectadas del campo en Provincia Habana, donde se observó resistencia cruzada a temefos y propoxur, este último no utilizado para el control de mosquitos en Cuba.⁵ Se demostró además que la resistencia estaba dada por la presencia de 2 mecanismos de resistencia, el de elevada actividad de esterasas inespecíficas y la acetilcolinesterasa alterada (Ache).

En 1986 el malation fue reemplazado por piretroides para el control de Cx. quinquefas-ciatus en Cuba y en 1990 se observó en 5 poblaciones de Cx. quinquefasciatus de Ciudad de La Habana la presencia de ambos mecanismos de resistencia; aunque hubo una declinación en su frecuencia comparada con el año 1986.⁷ En 1997 la frecuencia de esterasas elevadas se incrementó aún más a un valor de 1, lo que puede estar asociado con los nuevos fenotipos presentes (Est A6 y B6), además del fenotipo de Est B1 que se reportó en 1986.

La correlación entre la actividad de esterasas y la resistencia a los compuestos organofosforados está bien documentada^5,7,14-16 Han sido reconocidas 8 esterasas en Culex como responsables de la resistencia a insecticidas organofosforados, basado en su movilidad electroforética y en su preferencia por hidrolizar_a o b naftil acetato.^17,18 Se demostró que los altos niveles de resistencia conferidos por las esterasas B, en cepas resistentes a organofosforados, estaban relacionados con una superproducción de la enzima, como resultado de la amplificación genética.¹⁹

La esterasa B1 observada en Cx. quin-quefasciatus de Cuba no genera resistencia cruzada a piretroides,⁷ pero aparentemente son los nuevos fenotipos de esterasas A6 y B6, por sí solos o asociados con la esterasa B1, los que generan resistencia cruzada a los piretroides.

Los datos de este trabajo indican que la resistencia a piretroides en el Quibú, La Habana, no es todavía un problema serio. Por lo tanto a través de un cuidadoso uso regulado, la vida útil de los piretroides en Cuba podría prolongarse indefinidamente. La presencia de la alta frecuencia de 2 mecanismos de resistencia a organofosforados, 11 años después de detener el uso de los tratamientos con malation, significa que no es fácil revertir a las aplicaciones con malation para eliminar la resistencia a los piretroides. Sin embargo pirimifos metil es relativamente no afectado por los mecanismos de resistencia a malation, aun cuando los factores de resistencia han sido seleccionados cerca de su fijación. Teniendo en cuenta que pirimifos metil es también completamente efectivo contra la resistencia a piretroides en Cx. quin- quefasciatus de Cuba, este insecticida podría ser apropiado para su uso en un esquema rotacional de control de la resistencia.

SUMMARY

The use of malathion to control mosquitoes in Cuba during 7 years until 1986 selected 2 resistance mechanisms: that of elevated activity of nonspecific esterases and that of altered acetylcholinesterase (Ache) in Culex quinquefasciatus (Say). In Havana, specifically in the area under study (Quibú River), malathion was replaced by cypermethrin in 1987 and cycles of treatment with cypermethrin have been intensively used since l987 up to now when the populations of Aedes or Culex increase. In Culex quin-quefasciatus (Say) from the Quibú River the resistance levels, mainly to malathion, declined significantly from 1986 to 1997. An increase of resistance to pyrethroid was observed during that period of 11 years. The mechanism of elevated esterases rose to a frequency of 1 and there was also an increase in the frequency of the mechanism of Ache. The esterase B1, responsible for the resistance to malathion, but not to pyretrhroid, was selected in this population until 1986. Starting from the use of pyrethroid for the control in this area, 2 new phenotypes of esterases named A6 and B6, apparently related to pyrethroid resistance, were selected.

Subject headings: INSECTICIDES, ORGANOPHOSPHATE; ESTERASES, ACETYLCHOLINESTERASE; INSECTICIDE RESISTANCE.

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Recibido: 3 de febrero del 2000. Aprobado: 7 de junio del 2000. ]]> Dr. Juan A. Bisset. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: ciipk@ipk.sld.cu