Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”

Determinación de la actividad glutatión-S-transferasa en cepas de Culex quinquefasciatus de Cuba y otros países de América Latina

Lic. Cristina Díaz,¹ Lic. María Magdalena Rodríguez,¹ Téc. Mario Fresneda² y Dr. Juan  A. Bisset³

Resumen

Se optimizó el micrométodo para la determinación de la actividad específica de glutatión S-transferasa en una cepa seleccionada en el laboratorio con lambdacialotrina por 6 generaciones (SP6). Los valores de saturación para glutatión reducido y 1-cloro 2,4-dinitrobenceno fueron 15 mM y 40 mM, respectivamente; el tiempo óptimo de lectura de la reacción que permitió diferenciar la cepa resistente SP6 de la susceptible de referencia SLAB resultó de 3 min. A través del micrométodo ya optimizado se probaron 4 cepas procedentes de Cuba (SANTIAGO DE CUBA, SD4, QUIBÚ y SP6), una de Venezuela (MIRANDA), una de Colombia (MEDELLÍN) y una de Brasil (RÍO DE JANEIRO). Los más altos valores de actividad de la enzima fueron observados en la cepa MIRANDA. Sin embargo, este mecanismo de destoxificación se encontró a muy baja frecuencia en todas las cepas, indicando que no desempeña un papel importante en la resistencia a insecticidas en las cepas de estudio. Se compararon los valores de GST con las frecuencias de esterasas inespecíficas y acetilcolinesterasa modificada para cada una de las cepas estudiadas.

Palabras clave: Optimización, mecanismos de resistencia a insecticidas, glutatión S-transferasa.

El desarrollo de la resistencia a insecticidas ha sido quizás la más seria consecuencia de su amplio uso indiscriminado. Durante las últimas décadas muchos insectos han desarrollado resistencia a estos; hasta 1990 se reportaron 500 especies de insectos resistentes a una o más clases de los tóxicos.¹ La resistencia es heredada y ha demostrado ser uno de los mayores obstáculos en el control de los insectos. Los insecticidas han contribuido a disminuir males como la malaria, la fiebre amarilla, filariosis, encefalitis y arbovirosis, adquiridas o transmitidas por vectores; y a su vez han mejorado la producción agrícola en todo el mundo, pero se han visto limitados por la evolución de la resistencia en muchas especies de insectos.

Entre los mecanismos bioquímicos que confieren resistencia a un amplio grupo de insecticidas se encuentra la familia de la glutatión S-transferasa.^2-4

La glutatión S-transferasa (GST) es una familia de enzimas que catalizan la conjugación del glutatión endógeno a una variedad de compuestos electrofílicos, protegiendo las macromoléculas biológicas como las proteínas y los ácidos nucleicos de las consecuencias tóxicas de una reacción covalente con el insecticida. Estas enzimas han sido implicadas en la destoxificación y biotransformación de muchos xenobióticos, incluidos varios carcinógenos y un número considerable de medicamentos. La conjugación incrementa la solubilidad del compuesto electrofílico (e.g. insecticidas), facilitando la excreción de la molécula del organismo.⁵

La GST de insectos ha sido clasificada como clase theta. Se ha propuesto a esta clase como precursora de las clases alfa, miu y pi, basados en la distribución aparente de esta en un rango diverso de organismos que incluyen bacterias, levaduras, plantas e insectos.⁷

Varios estudios han correlacionado la resistencia a insecticidas con niveles incrementados de actividad GST y la producción de diferentes isoformas.^8,9 Las diferentes actividades catalíticas de GST y el número de enzima individual presente en las cepas de insectos susceptibles y resistentes han demostrado ser el factor responsable de la resistencia a varios insecticidas.^10,11

Este sistema enzimático generalmente está involucrado en la resistencia a insecticidas organofosforados y proveen la forma más importante de resistencia metabólica al organoclorado DDT a través de la dehidroclorinación a DDE, en insectos.^12,13

Los objetivos del presente trabajo fueron optimizar y aplicar este micrométodo para determinar la actividad de GST en Culex quinquefasciatus y precisar si este mecanismo estaba influyendo en la resistencia a insecticidas en cepas de este vector, procedentes de Cuba y otros países de Latinoamérica.

Para optimizar este método fue necesario determinar los valores de saturación de sustrato (glutatión reducido y 1-cloro 2,4-dinitrobenceno) y el tiempo óptimo de lectura de la reacción, lo cual permitió diferenciar la cepa resistente SP6 de la susceptible de referencia SLAB, así como conocer el estado de este mecanismo (GST) en otras cepas de Latinoamérica.

Métodos

Para el estudio se utilizaron las cepas siguientes:

SLAB: cepa susceptible de referencia de la especie Culex quinquefasciatus, donada por la Universidad de Montpellier, Francia.

QUIBÚ y SANTIAGO DE CUBA: cepas de Culex quinquefasciatus de Cuba, colectadas en el terreno en las ciudades de Ciudad Habana y Santiago de Cuba respectivamente y mantenidas en el Insectario.

SP6: cepa de Culex quinquefasciatus presionada en el laboratorio con el insecticida piretroide lambdacialotrina por 6 generaciones a partir de la cepa SANTIAGO DE CUBA.

MIRANDA: cepa de Culex quinquefasciatus de Venezuela mantenida en el Insectario.

MEDELLÍN: cepa de Culex quinquefasciatus de Colombia mantenida en el Insectario.

RÍO DE JANEIRO: Cepa de Culex quinquefasciatus de Brasil mantenida en el Insectario.

Optimización del ensayo

Para la optimización del micrométodo se utilizó la cepa SP6, seleccionada con lambdacialotrina por 6 generaciones, con un FR de 141,4 x para este insecticida comparada con la cepa susceptible SLAB.¹³ Las larvas individuales de cuarto estadio de SP6 fueron homogeneizadas en 200 mL de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.

La actividad GST fue determinada utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) y glutatión reducido (GSH), como sustratos; en todos los ensayos se utilizaron controles negativos (blancos) además de individuos de la cepa susceptible SLAB que fue tomada como referencia. El ensayo consistió de una mezcla de trabajo de 25 mL de GSH y 125 mL de CDNB. Las concentraciones de cada uno de los sustratos se variaron  de forma independiente, para determinar las concentraciones saturantes de cada sustrato. Las concentraciones variaron entre 5-70 mM para CDNB y 1-40 mM para GSH. Los reactivos fueron preparados diariamente antes de su utilización.

A cada pocillo de la placa de microtitulación se le adicionaron 200 mL de la mezcla de reacción y 20 mL del homogenato de las larvas. Las reacciones fueron llevadas a cabo a 25 °C y leídas en un lector de ELISA (Labsystems iEMS Reader MF) a 340 nm cada 30 s, durante 5 min. Luego se realizaron 3 lecturas más cada 5 min.

Las concentraciones saturantes de CDNB y GSH se determinaron a partir de los gráficos de actividad enzimática (Vo) contra concentraciones, teniendo en cuenta la cinética enzimática de Michaelis-Menten.

El tiempo óptimo de lectura de la reacción para discriminar entre la cepa resistente y la susceptible de referencia SLAB, se determinó como el punto dentro de la linealidad que difiriera significativamente, mediante una prueba t de Student.

El valor de corte para determinar la frecuencia de aparición de este mecanismo de resistencia se determinó como el valor máximo de actividad GST que se observó en los individuos de la cepa susceptible de referencia SLAB.

Determinación de la actividad GST en las cepas de campo

La concentración de proteínas se determinó según el método BCA protein assay, utilizando BSA como patrón.¹⁴

Análisis estadístico de los resultados. Los valores de actividad GST para todas las cepas se probaron para la normalidad. Las diferencias estadísticas entre las cepas se determinaron mediante un análisis de varianza de clasificación simple y una prueba de Duncan.

Resultados

Las concentraciones saturantes de los sustratos CDNB y GSH resultaron 40 y 15 mM, respectivamente (fig. 1). Estas concentraciones resultaron adecuadas para diferenciar de forma significativa los valores de actividad específica de GST de las poblaciones de SP6 de la cepa susceptible de referencia SLAB. La formación de DNP-GSH, producto de la conjugación del CDNB y el GSH por la enzima GST, mantuvo la linealidad hasta los 5 min. Brogdon y Barber (1990) obtuvieron resultados similares al ensayar esta enzima en mosquitos Anopheles arabiensis.¹⁵ El tiempo óptimo mínimo para la lectura de la reacción fue de 3 min (fig. 2).

Fig. 1. Concentración saturante para los sustratos CDNB y GSH (40 y 15 mM, respectivamente).

Fig. 2. Tiempo óptimo mínimo para la lectura de la reacción (3 min).

Fig. 3. Valor de corte para determinar la presencia del mecanismo de destoxificación mediada por GST (0,5 µM/min).

En las poblaciones ensayadas para la actividad GST (tabla 1) se observa que este mecanismo de destoxificación no se presenta con alta frecuencia, oscilando entre 0,047 (QUIBÚ y SANTIAGO DE CUBA) y 0,095 (RIO DE JANEIRO). La cepa MIRANDA, resultó la de mayor frecuencia de individuos con actividad incrementada de GST. Sin embargo, los valores promedio de actividad enzimática GST de las poblaciones de campo difirieron significativamente de la cepa susceptible de referencia SLAB (tabla 2).

Tabla 1. Frecuencia del mecanismos de glutatión S-transferasa (GST) en las cepas de Culex quinquefasciatus estudiadas

Tabla 2. Actividad enzimática promedio de glutatión S-transferasa (GST) en las poblaciones de Culex quinquefasciatus estudiadas

* Medias con letras diferentes difieren significativamente entre sí a p< 0,05 según una prueba de Duncan.

Discusión

Con el desarrollo de la resistencia a insecticidas se han incrementado las investigaciones sobre los mecanismos que la producen y ha sido necesario adecuar los métodos para su detección, lo que facilita el uso de insectidas de forma correcta por los programas de control.¹⁵

Peiris y Hemingway (1990) establecieron un micrométodo para la detección de esterasas elevadas en Culex quinquefasciatus,¹⁶ y Brogdon y Dickinson (1983) lo reportaron en Anopheles albimanus;¹⁷ en todo caso difieren las concentraciones de sustrato y colorante, así como el tiempo de lectura.

En Cuba se desarrolló la optimización del método para determinar GST en Aedes aegypti y se realizó la determinación de los valores en cepas de varios países.^18,19

El análisis de los resultados obtenidos en las cepas de campo estudiadas muestra que la frecuencia de aparición del mecanismo GST es muy baja. Esto puede deberse a que este mecanismo de destoxificación interviene generalmente en la resistencia a organofosforados, pero en las cepas estudiadas el mecanismo de esterasas elevadas fue el de mayor frecuencia en estas poblaciones y principal responsable de la resistencia a organofosforados, aunque también se encontró una acetilcolinesterasa alterada.^20,21 Sin embargo, estos autores no reportaron actividad GST debido a la ausencia de un método adecuado para su detección. Teniendo en cuenta que la GST posee actividad esterasa no específica,^22,23 este mecanismo pudo estar incrementando, en aquel momento, por la alta frecuencia de esterasas inespecíficas encontrada por Bisset y otros (1990)²⁰. El cambio de organofosforados por piretroides ha resultado en una disminución de la frecuencia de genes de esterasas inespecíficas elevadas y acetilcolinesterasa modificada y probablemente también los genes de GST elevada.

Actualmente en Venezuela se continúan utilizando insecticidas organofosforados para el control de poblaciones de mosquitos vectores, lo que ha resultado en la selección del mecanismo de esterasas elevadas¹⁸ y posiblemente esté comenzando a seleccionarse el mecanismo de resistencia metabólica mediado por GST, aunque aún se encuentra en baja frecuencia (0,37).

Un problema potencial para la detección de GST en el campo es que no se pueden discriminar visualmente individuos con alta o baja actividad de GST, con este método optimizado es posible diferenciarlo al nivel de laboratorio.

En general se puede afirmar que estas adecuaciones permiten, por primera vez en Cuba, diferenciar entre individuos y entre cepas susceptibles y resistentes a insecticidas mediante GST en Culex quinquefasciatus. Este método puede ser extendido para su utilización a otros países.

Summary

In the present paper, we standardized a microtitration assay for the determination of specific activity of glutathione-S-transferase using a Culex quinquefasciatus strain selected in lab with pyrethroid insecticide lambdacyhalothrin for 6 generations (SP6). The saturation values for reduced glutathione and 1-chlorine 2,4-dinitrobenzene were 15 mM and 40 mM, respectively; we also estimated that 3 minutes was the optimal time in order to differentiate resistant strain SP6 from the susceptible reference strain S-Lab (p>0.05). Additionally, the optimized microtitration method allowed testing 4 Culex strains from Cuba (SANTIAGO DE CUBA, SD4, QUIBU AND SP6), one from Venezuela (MIRANDA), one from Colombia (MEDELLIN) and the other from Brazil (RIO DE JANEIRO) for glutathione-S-transferase activity. MIRANDA showed the highest activity for this detoxifying enzyme. However, the mechanism of detoxyfication in all the strains was very unfrequent, which indicates that its role in resistance to insecticide for all the studied strains is not so important. Glutathione-S-transferase values were compared with non-specific esterase and altered acetylcholinesterase frequencies for each of the studied strains.

Key words: Optimization, mechanisms of insecticide resistence, gluthation- S-transferase.

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Recibido: 2 de octubre de 2003. Aprobado: 10 de febrero de 2004.
Lic. Cristina Díaz. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: 2020426. Correo electrónico: ciipk@ipk.sld.cu