Detección molecular de Pneumocystis jiroveci en tejido parafinado de fallecidos por VIH/sida
Molecular detection of Pneumocystis jiroveci in paraffin-embedded tissue from persons who died from HIV/AIDS
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Yaxsier de Armas RodríguezI; Virginia Capó de PazII; Ledy Xiomara López FuentesIII
I Máster en Entomología Médica y Control de Vectores. Máster en Epidemiología. Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador. Instructor. Departamento de Anatomía Patológica. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Ciudad de La Habana, Cuba.
II Doctor en Ciencias Médicas Diagnósticas. Especialista de II Grado en Patología. Investigador Titular. Profesora Auxiliar. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
III Técnica en Anatomía Patológica. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
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RESUMENINTRODUCCIÓN: Pneumocystis jiroveci es uno de los más frecuentes patógenos oportunistas que afectan a los pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida.
OBJETIVO: detectar P. jiroveci en tejidos embebidos en parafina mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
MÉTODOS: se emplearon 6 bloques de parafina procedentes de 3 fallecidos por sida y neumonía por P. jiroveci. Se realizaron coloraciones de rutina y especiales de anatomía patológica, así como la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa para el diagnóstico del microorganismo.
RESULTADOS: con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa se identificó este agente infeccioso en los bloques de parafina estudiados. Se logró detectar P. jiroveci hasta una dilución de 1:100 del material genético extraído de cada bloque.
CONCLUSIONES: contar con métodos moleculares que permitan identificar P. jiroveci en tejido parafinado abre el camino para la determinación de los genotipos involucrados en la pandemia sida cubana y permitirá determinar si la cepa infectante, en los casos que resulten fatales, presenta resistencia a los fármacos empleados.
Palabras clave: Pneumocystis jiroveci, reacción en cadena de la polimerasa, parafina, sida, VIH.
ABSTRACT ]]>
BACKGROUND: Pneumocystis jiroveci is one of the most frequent opportunistic pathogens affecting the patients with the acquired immunodeficiency syndrome.
OBJECTIVE: to detect P. jiroveci in paraffin-embedded tissues by means of the polymerase chain reaction.
METHODS: six paraffin blocks from 3 dead persons who died from AIDS and P. jiroveci pneumonia. Routine and special staining of the pathological anatomy together with the PCR for diagnosis were performed.
RESULTS: the PCR identified this infective agent in the studied paraffin blocks. It was possible to detect P. jiroveci up to 1:100 dilution of the genetic material extracted from each block.
CONCLUSIONS: the availability of molecular methods to identify P. jiroveci in paraffined tissue opens up the road to determination of genotypes involved in the Cuban AIDS pandemics and will allow ascertaining whether the infective strain, in fatal cases, is resistant to the drugs that are being used.
Key words: Pneumocystis jiroveci, polymerase chain reaction, paraffin, AIDS, HIV.
]]> INTRODUCCIÓN
Pneumocystis jiroveci, conocido anteriormente como Pneumocystis carinii f. sp. hominis, continúa siendo uno de los más importantes patógenos oportunistas que afectan a individuos con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y pacientes inmunocomprometidos negativos al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).1
El diagnóstico convencional de este agente etiológico es realizado por métodos de tinciones como azul de toluidina, plata metenamina, giemsa y las técnicas de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales. Sin embargo, todos estos procedimientos dependen de un alto grado de calidad de la muestra seleccionada.2
Para la identificación de este microorganismo se han empleado diferentes técnicas de laboratorio. En la actualidad, los métodos moleculares han demostrado ser más efectivos en la detección de P. jiroveci que los métodos convencionales.3 Hasta el momento, escasos han sido los reportes en la literatura que abordan la identificación de este agente oportunista en tejidos humanos embebidos en parafina (TEP).2-5
En el presente estudio, se detectó P. jiroveci en TEP de fallecidos por VIH/sida empleando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP).
Se utilizaron 6 bloques de parafina procedentes de 3 pacientes fallecidos por sida y neumonía por P. jiroveci en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba. Se fijaron en formol tamponado 2 fragmentos de tejido pulmonar de cada bloque estudiado y se procesaron por el método convencional para su inclusión en parafina.6
A cada bloque se le hizo 2 cortes histológicos consecutivos de 5 µm de espesor con micrótomo rotario RM 2035 (Leica, Leizip, Alemania), que se colorearon con hematoxilina y eosina para sugerir evidencias de infección por P. jiroveci. Se tomaron otros 2 cortes de cada bloque, para ser empleados en coloraciones histológicas especiales para la identificación de hongos como son la tinción de PAS y la de Grocott.6 Otros 5 cortes de 10 µm de cada bloque de parafina se colocaron en microtubos de 1,5 mL para realizar la extracción del material genético.
Para la extracción de ADN, a los cortes de tejido pulmonar obtenidos de cada fragmento procesado se les realizó 3 lavados con xilol y 3 con etanol. Luego, el tejido se resuspendió en 300 µL de solución amortiguadora TEN (Tris_HCl, (pH 8,3) 0,04 M, NaCl, (pH 8,0) 0,2 M, EDTA 1 mM) con 5 µL de proteinasa K 20 mg/mL (Merck, Darmstadt, Alemania) y 5,25 µL de SDS 20 %. La solución se incubó a 55 ºC por toda la noche y se calentó a 100 ºC por 10 min para inactivar la proteinasa K. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a 13 000 rpm por 10 min, se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto en presencia de NaCl (concentración final 0,2 M). Se incubó la solución a temperatura ambiente por 30 min, se recentrifugó a 13 000 rpm por 30 min y el precipitado se resuspendió en 40 µL de H20 destilada estéril, para su posterior empleo en la RCP.
Se utilizó como secuencia diana un fragmento de 193 pares de bases (pb) del gen que codifica para la subunidad mayor del ARN ribosomal mitocondrial (ARNr mt) de P. jiroveci.7 La mezcla de reacción (50 µL) contuvo Tris/HCl (pH 8,3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxirribonucleótidos (dNTP) 200 µM, iniciador (pLE1 y pLE2) 0,4 µM, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Bioline, Londres, Reino Unido), y diferentes concentraciones de ADN molde (1 µL, 3µL dilución 1:10 y 3 µL dilución 1:100) de cada fragmento empleado. El perfil de amplificación fue: 94 °C por 4 min, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C y 1,5 min a 72 °C, con una extensión final de 7 min a 72 °C. ]]>
Para la detección de los productos amplificados se analizaron 20 µL de cada mezcla resultante mediante electroforesis en gel de agarosa 1,2 % con solución reguladora de Tris-borato-EDTA. La corrida se realizó a 80 V por 1 h. Los resultados fueron visualizados en un transiluminador ultravioleta (Macrovue 2011, LKB, Suecia) y luego fotografiados con una cámara digital Power Shot G6 (Cannon, Japón).En las RCP, se empleó como control positivo ADN extraído del pulmón de un fallecido por P. jiroveci, detectado por hematoxilina y eosina, PAS, compatible con la clínica e histología de esta infección y positivo por la RCP para el fragmento de 193 pb del ARNr mt. El ADN se obtuvo a partir del macerado del tejido fresco obtenido en la autopsia del fallecido por la misma metodología antes descrita; eliminando los lavados con xilol y etanol; como control negativo fue empleado agua destilada estéril en lugar de ADN molde.
Las coloraciones histológicas de rutina y las especiales empleadas brindaron elementos sugerentes de infección por P. jiroveci en las muestras de los 3 fallecidos analizados. Se emplearon 2 bloques de parafina de autopsia, con el fin de aumentar la posibilidad de resultados positivos. En la figura se pueden observar las bandas de 193 pb amplificadas a partir de los ADN extraídos de los 3 fallecidos involucrados y sus correspondientes diluciones. Con la RCP se detectó P. jiroveci con 1 µL, 3 µL de la dilución 1:10 y 3 µL de la dilución 1:100 del material genético extraído de los fragmentos de cada tejido pulmonar de los fallecidos analizados.
P. jiroveci es uno de los patógenos pulmonares más frecuentes en individuos inmunocomprometidos, particularmente en aquellos que tienen sida. Para su detección se han empleado diferentes muestras clínicas (lavados bronquiales, orales, inducción de esputos, aspirados nasofaríngeos y traqueales). También, ADN genómico obtenido de tejidos de cerdos embebidos en parafina se han utilizado para amplificar material genético de P. carinii.4 Sin embargo, existen pocos reportes en la literatura que abordan esta problemática en TEP procedentes de humanos.2-5
La extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de TEP es una tarea difícil. El formol, aún tamponado, empleado para preservar la morfología del tejido puede causar entrecruzamiento entre las proteínas y el ADN, ello limita la purificación de fragmentos de alta talla molecular, lo que dificulta en cierta medida la amplificación por RCP.8 Por esta razón, se necesitan secuencias dianas cortas (= 300 pb) y que existan múltiples copias en el genoma para garantizar el éxito en el diagnóstico al emplear este tipo de material.9
Varias secuencias dianas han sido empleadas para detectar P. jiroveci en muestras clínicas de pacientes VIH/sida e inmunocompetentes. Entre ellas se pueden citar: el gen de la dihidropteroato sintetasa, las secuencias intergénicas transcriptas y los genes que codifican para el ARNr mt.5 Se han demostrado diferencias en cuanto a sus sensibilidades en la detección de este agente infeccioso cuando se emplean, y el ARNr mt resulta la secuencia más eficiente para lograr este objetivo.9
El fragmento de 193 pb del gen del ARNr mt de P. jiroveci empleado en este estudio, tiene múltiples copias en el genoma y baja talla molecular, que lo convierte en una secuencia diana atractiva para su uso en el diagnóstico de este agente infeccioso en los TEP. Esas características facilitan la detección de pequeñas cantidades de este microorganismo en las muestras analizadas. En el presente estudio se logró identificar P. jiroveci en diluciones de hasta 1:100 del ADN extraído de cada bloque de parafina. Estos resultados corroboran los obtenidos por De La Horra2 y otros que con el empleo de esa misma secuencia lograron detectar este agente infeccioso en muestras parafinadas de fallecidos con diluciones de ADN de 1:125. Recientemente, Chabé y otros detectaron muy baja infección de P. carinii en ratas de laboratorio. El objetivo de su experimento era obtener una técnica optimizada y sensible que pudiera detectar P. jiroveci en TEP procedentes de niños chileños fallecidos por muerte violenta sin aparente explicación.5
Un aspecto interesante de esta investigación fue la positividad encontrada a P. jiroveci en diferentes regiones del pulmón de cada uno de los bloques de parafina analizado. Se han obtenido resultados discrepantes, cuando se obtienen diferentes muestras clínicas de regiones distintas en el mismo paciente10 y de diferentes partes del pulmón de un mismo paciente.9 El empleo de 2 bloques de parafina por fallecido obtenido de diferentes regiones del pulmón brindó la posibilidad de demostrar la presencia de P. jiroveci por la RCP. Este detalle fue previamente identificado por Beard y otros en un estudio de tejidos fijados en etanol de autopsias de 58 niños y 384 adultos en diferentes ciudades de EE.UU.9
Este trabajo constituye el primer reporte de detección de P. jiroveci en TEP de fallecidos cubanos por VIH/sida con el empleo de la RCP. La posibilidad de contar con un método molecular para la detección de este agente etiológico en TEP representa un recurso invaluable para estudios de epidemiología molecular. En futuras investigaciones, debe ser evaluada la factibilidad de la detección de P. jiroveci en muestras clínicas de pacientes aquejados con sida que presenten manifestaciones clínicas compatibles con esta enfermedad. Más aún, la detección molecular de P. jiroveci en TEP abre el camino para la identificación de los genotipos involucrados a lo largo de la pandemia sida cubana y permitirá la detección de posibles cepas resistentes a diferentes fármacos empleados como tratamiento para esta infección.
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AGRADECIMIENTOS
Al doctor Gerardo Martínez Machín por sus opiniones críticas respecto al manuscrito.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Stringer JR, Beard CB, Miller RF, Wakefield AE. A new name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumocystis from humans. Emerg Infect Dis. 2002;8:891-6.
2. De La Horra C, Varela JM, Friaza V, Respaldiza N, Munoz-Lobato F, Montes-Cano M, et al. Comparison of single and touchdown PCR protocols for detecting Pneumocystis jirovecii DNA in paraffin-embedded lung tissue samples. J Eukaryot Microbiol. 2006;53:S98-9.
3. Helweg-Larsen J, Lundgren B, Lundgren JD. Heterogeneity and compartmentalization of Pneumocystis carinii f.sp.hominis genotypes in autopsy lungs. J Clin Microbiol. 2001;39:3789-92.
4. Varela JM, Fernández-Alonso J, Wichmann I, Calderón EJ. Pneumocystis carinii investigation in patients with Wegener's Granulomatosis. Br J Rheumatol. 1998;37:349-50.
5. Chabé M, Vargas SL, Eyzaguirre I, Aliooaut EM, Follet-Dumoulin A, Creusy C. Molecular typing of Pneumocystis jirovecii found in formalin-fixed paraffin-embedded lung tissue sections from sudden infant death victims. Microbiol. 2004;150:1167-72.
6. Luna LG, editors. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3ra. ed. New York: McGraw-Hill, Inc; 1967.
7. Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet.1990;336:451-3
8. Wu L, Patten N, Yamashiro CT, Chui B. Extraction and amplification of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2002;10:269-74.
9. Beard C, Fox MR, Lawrence GG, Guarner J, Hanzlick RL, Huang L, et al. Genetic differences in Pneumocystis isolates recovered from immunocompetent infants and from adults with Aids: Epidemiological implications. J Inf Dis. 2005;192:1815-8.
10. Totet A, Latouche S, Lacube P, Pautard JC, Jounieaux V, Raccurt C, et al. Pneumocystis jirovecii dihydropteroate synthase genotypes in immunocompetent infants and immunosuppressed adults, Amiens, France. Emerg Infect Dis. 2004;10:667-73.
Recibido. 26 de febrero de 2008. ]]> Aprobado: 28 de julio de 2008.
Lic. Yaxsier de Armas Rodríguez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". AP 601, CP 11300, Ciudad de La Habana. Teléf.: 2020652. Fax: 2046051. Correo electrónico: yaxsier@ipk.sld.cu ]]>
