ARTÍCULO DE REVISIÓN

Diagnóstico de la leishmaniasis: de la observación microscópica del parásito a la detección del ADN

Leishmaniasis diagnosis: going from microscopic observation of parasite to DNA detection

]]> Dr. C. Ana M. Montalvo, MSc. Jorge Fraga, Dr. C. Lianet Monzote, MSc. Marley García, MSc. Lisset Fonseca

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". La Habana, Cuba.

Introducción: la leishmaniasis es una enfermedad causada por varias especies del género Leishmania, de la cual se han incrementado los reportes en los últimos años. Diversos factores genéticos, inmunológicos y asociados al parásito determinan el establecimiento de la infección y la ocurrencia de enfermedad, que se presenta en formas clínicas muy diversas, lo cual condiciona, entre otros elementos, el método diagnóstico que se aplica.
Métodos: se hizo una revisión de la literatura básica y actualizada sobre aspectos generales de la leishmaniasis: la enfermedad y su situación epidemiológica, el ciclo de vida y la transmisión, vectores, presentaciones clínicas y diagnóstico; este último acápite contiene información sobre los principales métodos que se utilizan en el presente. Se puntualizó en la forma en que se apoya el diagnóstico desde el grupo de Leishmania del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", que constituye el centro nacional de referencia para esta enfermedad tropical.
Resultados: se muestra información actualizada sobre los temas escogidos, con un enfoque orientador y práctico, dirigido al personal de salud que debe enfrentar casos con sospecha de leishmaniasis. Se muestran tablas y gráficos que resumen de manera organizada aspectos relevantes, así como el algoritmo de trabajo que se sigue en el instituto con relación al diagnóstico de esta enfermedad, con énfasis especial en las aplicaciones al diagnóstico molecular que ha realizado el grupo de trabajo.
Conclusiones: debido a que la leishmaniasis permanece aún sin control, el diagnóstico oportuno continúa siendo una necesidad. Todos los métodos aportan información de utilidad para la toma de decisiones en el tratamiento clínico, la imposición del tratamiento y el enfoque epidemiológico de esta parasitosis. Entre ellos, proponemos un algoritmo de trabajo en nuestro laboratorio, con el empleo de los métodos que resultan más útiles de acuerdo a nuestras condiciones y experiencias.

Palabras clave: Leishmania, leishmaniasis, diagnóstico, algoritmo.

Key words: Leishmania, leishmaniasis, diagnosis, algorithm.

LA ENFERMEDAD Y SU SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA ACTUAL ]]>

La leishmaniasis es una enfermedad causada por protozoos parásitos del género Leishmania y se caracteriza por presentar una variedad clínica y epidemiológica en relación con las especies involucradas en la infección, los vectores transmisores, así como factores ligados al hospedero.^1,2

Alrededor de 20 especies son patógenas para el hombre, las cuales se distribuyen en distintas regiones del Viejo y el Nuevo Mundo (tabla 1). Según la Organización Mundial de la Salud, la enfermedad es endémica en 88 países de 4 continentes y se notifican alrededor de 2 millones de casos nuevos cada año (http://www.who.int/leishmaniasis/burden/magnitude/burden_magnitude/). Algunos autores indican que el número global de casos se incrementó, particularmente en Brasil,³ Bolivia, Perú,⁴ Colombia,⁵ y Afganistán.⁶ Tal incremento puede ser el resultado del inadecuado control de vectores y reservorios en las zonas endémicas, de la mayor detección de leishmaniasis cutánea asociada a infecciones oportunistas (VIH/sida),⁷ de la emergencia en la resistencia al tratamiento⁸ y del impacto reciente de los cambios climáticos, que inciden en la distribución y el comportamiento de los vectores implicados en la transmisión de distintas enfermedades, entre estas, la leishmaniasis.⁹

Tabla 1. Principales especies patógenas para el hombre y su distribución geográfica

Adaptado de Antinori y otros, 2012.

ASPECTOS GENERALES DEL CICLO DE VIDA Y LA TRANSMISIÓN

La forma infectiva del parásito es el promastigote metacíclico,¹² que se inocula en el mamífero mediante la picadura del insecto, y cuya transmisión constituye un ejemplo típico de antropozoonosis (Fig. 1). Por otra parte, aspectos relacionados con la conducta humana, como la urbanización y destrucción de los bosques,¹³ la ocurrencia de conflictos armados,¹⁴ y el incremento del turismo, provocan la migración de población susceptible hacia áreas endémicas y favorecen la dispersión de Leishmania.¹⁵

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Es muy probable que como consecuencia del calentamiento global la leishmaniasis se disperse hacia zonas actualmente templadas, donde los incrementos de la temperatura pudieran favorecer la extensión de las estaciones en las cuales se alimentan los vectores que transmiten el parásito, o que la baja temperatura provoque una extensión de su período larval¹⁶. También eventos naturales que en los últimos años se han hecho cada vez más frecuentes, como los terremotos, han provocado nuevos focos de la enfermedad en áreas que, con anterioridad, permanecían libres de esta infección¹⁷.

Además de la transmisión natural, es importante conocer que existe transmisión del parásito a partir de personas infectadas con Leishmania que utilizan drogas endovenosas, cuando existe uso de jeringuillas compartidas, lo que ha conllevado a la coinfección Leishmania-HIV. De forma general, se acepta que la incidencia global reportada para esta coinfección está subestimada, debido en parte a que la forma visceral de la enfermedad ocurre en "poblaciones olvidadas" y también al hecho de que al no estar la leishmaniasis dentro de la lista de enfermedades oportunistas, esta coinfección se notifica raramente.¹⁸

VECTORES

Los vectores de todas las especies de Leishmania descritas son hembras hematófagas de la familia Psychodidae, subfamilia Phlebotominae y de las 500 especies conocidas, solo 31 se identifican como vectores de especies patógenas y 43 como vectores probables, pertenecientes a los géneros Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomyia en el Nuevo Mundo¹⁹.

En Cuba no se reconocen vectores transmisores de Leishmania. En 1920 se describió para Cuba y las Islas Caimán la presencia de 2 especies de Lutzomyia: Lu. cubensis y Lu. orestes²⁰. En la década de los 80 se notificaron 2 especies y una nueva subespecie del género para Cuba: (Lu. novoae y Lu. diazi) y (Lu. cayennensis cruz); solo Lu. orestes, entre todas, es la que manifiesta hábitos antropofílicos y hematófagos. Al mismo tiempo, se realizó la caracterización biológica y ecológica de estos vectores, y se notificó su distribución en todas las regiones de la geografía cubana ²¹.

Contrario a lo que sucede en América Latina, donde la mayor actividad de los flebótomos es nocturna, Lu. orestes tiene hábitos diurnos con picos de actividad hematofágica que se relacionan con cambios en la temperatura, humedad y luminosidad; y tal como ocurre en otros casos, el ataque de las hembras se produce en oleadas,²² lo cual amplifica, teóricamente, su potencialidad vectorial. En años posteriores, se desarrollaron estudios encaminados a demostrar las posibilidades de transmisión experimental de Leishmania mediante este vector, utilizando como modelo el hámster dorado.²³ ]]> En la actualidad, sería imprescindible demostrar que Lu. orestes cumple los requisitos indispensables propuestos por Killick-Kendrick (1990), para poder considerarse como vector de Leishmania, y plantear, de manera fehaciente, que existen en Cuba posibilidades de transmisión de este parásito. No existen investigaciones recientes que aporten claridad sobre aspectos relativos a la posible transmisión en el país. Sin embargo, es necesario conocer los datos antes mencionados, porque no se puede descartar por completo la posibilidad de que bajo condiciones epidemiológicas específicas, en las que se presenten todos los elementos que componen la cadena epidemiológica de transmisión, se pueda producir este fenómeno que debería demostrarse rigurosamente.

PRESENTACIONES CLÍNICAS

En la leishmaniasis la presentación clínica es variada y depende por lo general de varios factores, entre los cuales la susceptibilidad genética del hospedero,²⁴ el contexto inmunológico en que se produce la infección²⁵ y la especie de Leishmania infectante²⁶ son los más importantes. Así, se pueden presentar de manera general, la leishmaniasis cutánea, mucocutánea y visceral, con características clínicas específicas que aparecen descritas en un artículo reciente,²⁷ por lo cual no se hará extensión en este aspecto. En varios países también se notifican otras presentaciones clínicas intermedias o atípicas.²⁸

DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS

El diagnóstico por lo general depende de la forma clínica de presentación y de las posibilidades tecnológicas existentes en el servicio médico que recibe al paciente. Una vez que se presenta un paciente con las caracterítiscas clínicas o epidemiológicas que hagan sospechar una leishmaniasis, pueden realizarse una serie de exámenes que se describirán más adelante, en relación con la forma de presentación de la enfermedad.

Aspectos clínicos útiles para la orientación del diagnóstico de las leishmaniasis

]]> Al existir diversas formas de presentación de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea, los aspectos clínicos que pudieran hacer pensar en la presencia de alguna de estas son diversos, razón por la cual se comentarán más adelante. De manera general, la evolución de la lesión inicial en el sitio de la picada del vector es similar. Tras un período de incubación de 2 semanas a 3 meses aparece una pápula o nódulo pequeño, que puede acompañarse de inflamación ganglionar, y a veces cura de manera espontánea. En otras ocasiones, la lesión evoluciona hacia una enfermedad de diversas características clínicas,²⁹ algunas de las cuales se describirán a continuación tomando en cuenta el área geográfica de origen.

En el Nuevo Mundo abundan las especies dermotrópicas, que producen manifestaciones más variadas que en el Viejo Mundo. Se puede presentar una lesión solitaria, o lesiones múltiples, en sitios cercanos a la picada del vector o en áreas distantes del cuerpo. La leishmaniasis cutánea localizada, que es la forma más común, se caracteriza por la aparición de una úlcera indolora de límites definidos, con aparición de costra central y a veces hemorrágica. Puede curar de forma espontánea dejando una cicatriz hipopigmentada. En dependencia del balance de la relación hospedero parásito, esa lesión puede evolucionar en algunos pacientes hacia otras formas más complejas.²⁹

La forma recidiva cutis es rara en esta área geográfica. Existen poco reportes donde se ha vinculado con parásitos que pertenecen al subgénero L. (Viannia), en Brasil³⁰ y Ecuador³¹ También Leishmania (L) amazonensis se ha relacionado con esta presentación.³²

La leishmaniasis cutánea diseminada se caracteriza por la aparición de múltiples y variadas lesiones, en lo fundamental acneiformes y papulares, en áreas no contiguas del cuerpo.³³ En zonas del norte de Brasil, donde aumentó la frecuencia de esta presentación, L. braziliensis fue la única especie que se identificó.³⁴

La leishmaniasis cutánea difusa se caracteriza por la presencia de nódulos abundantes en parásitos, que no ulceran, y se considera una forma rara de presentación.³⁵ Existen reportes en Centro y Sur América y también Etiopía, donde las especies relacionadas son L. mexicana, L. amazonensis y L. aethiopica, respectivamente.²⁹

La leishmaniasis mucocutánea la padece de 1 a 10 % de los pacientes con leishmaniasis cutáneas³⁶ y la produce en lo fundamental L. braziliensis, pero también se ha asociado con infecciones por L. guyanensis, L. panamensis y L. amazonensis. Puede aparecer de manera simultánea a la enfermedad cutánea o presentarse varios años después de la cura. Ocurre por diseminación hematógena o linfática de los parásitos desde la piel hasta la mucosa oronasofaríngea³⁵ y se hace evidente por los síntomas nasales crónicos, que pueden continuar con la destrucción progresiva de la cavidad bucal y nasofaríngea, en el contexto de una respuesta inmune hiperactiva³⁷. Los reportes son escasos fuera de América Latina, y en ellos el agente etiológico típico es L. aethiopica¹⁰. Es una enfermedad mutilante que deja secuelas físicas y psíquicas, las cuales dificultan la reinserción social de las personas que la padecen.

Se considera que en el Viejo Mundo, las especies que prevalecen pueden producir manifestaciones clínicas limitadas, en comparación con aquellas que predominan en el Nuevo Mundo. Es decir, L. major, L. tropica y L. aethiopica pueden causar, en 86 a 98 % de los casos, lesiones ulcerativas localizadas que en su mayoría curan tras un periodo de evolución de hasta 2 años. L. tropica produce la forma recidiva cutis, que se caracteriza por la aparición simultánea de lesiones papulares o vesiculares alrededor de la úlcera, o posterior a la cura³⁸ y puntualmente se ha relacionado con la leishmaniasis mucosa,³⁹ mientras L. aethiopica produce las formas localizada y mucocutánea y también se relaciona con la enfermedad cutáneo difusa^38,40. L. donovani, usualmente viscerotrópica, puede producir una forma cutánea posterior a la enfermedad visceral, conocida como leishmaniasis cutánea pos-kala-azar.⁴¹

La diferenciación de estas infecciones cutáneas es imprescindible, porque otras enfermedades como la lepra, el cáncer de piel, la tuberculosis, las micosis cutáneas, así como las picaduras de insectos infectadas, el impétigo, la sarcoidosis y los neoplasmas pueden producir lesiones similares.⁴² Entre los hongos pueden encontrarse Paracoccidioides braziliensis, Histoplasma capsulatum y Sporothrix schenkii, así como bacterias piogénicas tipo Staphylococcus y Streptococcus o también Mycobaterium.⁴³

En relación con los casos de leishmaniasis visceral, los pacientes presentan síntomas y signos de una infección sistémica persistente como fiebre, fatiga, debilidad, pérdida de apetito y de peso. La invasión de parásitos a la sangre y el sistema retículo endotelial, provoca inflamación de nódulos, bazo e hígado. La hiperpigmentación de la piel que se presenta en pacientes del subcontinente indio y antes dio nombre a la enfermedad, es un síntoma poco común, el cual se produce por una insuficiencia suprarrenal y, al parecer, guardaba relación con la duración prolongada de la enfermedad en tiempos en que el tratamiento efectivo no era posible.⁴⁴

Esta forma clínica debe diferenciarse de la malaria, el síndrome de esplenomegalia tropical, esquistosomiasis, cirrosis, tripanosomiasis africana, tuberculosis, brucelosis, fiebre tifoidea, endocarditis bacteriana, histoplasmosis, malnutrición, linfoma y leucemia.⁴⁵ Sin embargo, en la mayoría de las ocasiones no existen condiciones o recursos en las zonas endémicas para discriminar estas enfermedades. ]]>

Diagnóstico de laboratorio de las leishmaniasis

Los métodos que se pueden utilizar para realizar el diagnóstico son diversos y su utilidad depende, por lo general, de la forma clínica de presentación (tabla 2). A continuación se comentan los más importantes.

Tabla 2. Principales formas de diagnóstico recomendadas en relación con la forma clínica

* Se presentan algunas características de los métodos que pueden resultar de utilidad en la toma de decisiones.

Método parasitológico

]]> Los métodos de diagnóstico parasitológico son muy específicos⁴² y se aplican en todas las formas clínicas de la enfermedad. Estos incluyen el examen microscópico de extendidos, raspados, biopsias o aspirados, tomados por lo general del borde de las lesiones y teñidos con Giemsa,⁴⁵ pero la sensibilidad es baja, aproximadamente de 50 a 70 % en el Viejo Mundo⁴⁶ y puede llegar a ser aún menor en el Nuevo Mundo, con valores de 15 a 30 %.^47,48 También se realiza el examen histopatológico para hacer la búsqueda de amastigotes en distintos tejidos.

En la forma visceral la muestra para el examen parasitológico directo se toma del aspirado de bazo, nódulos linfáticos o médula ósea,⁴² proceso muy invasivo para el paciente y durante el cual pueden ocurrir complicaciones derivadas de hemorragias, por lo que se requiere alta pericia en estos procederes y otras condiciones técnicas.⁴⁹

Cultivo

El cultivo de esas mismas muestras biológicas, por lo general en medio bifásico, (Novy, Mc Neal, Nicolle) resulta más informativo; puede facilitar la identificación y caracterización de especies por métodos isoenzimáticos o moleculares, pero requiere de mayores condiciones técnicas en el laboratorio y se necesita tiempo para ofrecer el resultado.³³ La observación de promastigotes móviles fácilmente identificables en la fase líquida del medio cultivo, producto de la transformación de los posibles amastigotes presentes en la muestra sembrada, constituye el resultado positivo. Una reciente modificación el cultivo microcapilar en medio monofásico, parece más promisorio, porque se demostró que la utilización de una mezcla del aspirado de lesión y medio de cultivo a partes iguales, sembrada en pequeños volúmenes de 50 µL en tubos microcapilares no heparinizados, ocasiona a un incremento de la sensibilidad y requiere menor tiempo de incubación para obtener los resultados, lo que implica un avance en términos de costo y tiempo;⁵⁰ pero ese resultado no se ha extendido a los servicios de salud.

Prueba cutánea de Montenegro

La medición de la respuesta de hipersensibilidad tardía, como manifestación de la respuesta inmune mediada por células, también se utiliza como complemento diagnóstico (prueba cutánea de Montenegro). Consiste en la inyección de 0,1 mL de antígeno de Leishmania en el antebrazo. Si la induración local que produce tras 2 o 3 d es igual o mayor que 5 mm, la reacción se considera positiva²⁹ y la observación de la reacción epidérmica que se genera a consecuencia de la estimulación celular. Sin embargo, se aplica fundamentalmente como método complementario en casos de sospecha de enfermedad cutánea y mucocutánea, en estudios epidemiológicos de todas las formas de la enfermedad y en ensayos de vacunas, debido a que no diferencia infecciones pasadas o recientes.⁵¹ ]]> Los métodos que se mencionaron con anterioridad son los más utilizados en los distintos niveles de salud en las áreas endémicas, que generalmente disponen de bajos recursos, y en muchos casos el éxito depende de la experiencia del observador y de las condiciones de las instalaciones. En algunos laboratorios se toman varias muestras del propio paciente, ya sea de una misma lesión o de lesiones diferentes, como forma de incrementar las posibilidades de éxito en la detección. Sin embargo, la sensibilidad varía en dependencia de numerosos factores: el número y la dispersión de los parásitos, fundamentalmente en los casos del Nuevo Mundo, donde su abundancia en las lesiones puede variar según la especie,^52,53 de la contaminación frecuente del cultivo por la presencia de elementos bacterianos o fúngicos en la muestra biológica; y el hecho de que distintas especies de Leishmania pueden tener diferentes requerimientos para su cultivo.⁵⁴

Métodos indirectos serológicos

Los métodos serológicos se pueden aplicar al diagnóstico de casos de enfermedad cutánea, pero no hay acuerdo sobre la mayor utilidad de uno u otro, y a veces las recomendaciones de los autores son contradictorias. También se comunica una eficacia diferente entre el Viejo y el Nuevo Mundo, debido a la variación en la sensibilidad y la aparición de reacciones cruzadas.⁵⁵

Recientemente, se describieron protocolos de ELISA especie-específicos con valores de sensibilidad comparables (84,6 % y 88,5 %) y una especificidad adecuada (96,2 %), que se recomiendan como pruebas complementarias para el diagnóstico de formas cutáneas causadas por L. braziliensis, L. guyanensis y L. amazonensis.⁵⁶ Sin embargo, al ser métodos que detectan anticuerpos contra una especie en particular, su utilidad se reduce en áreas donde coexista más de una especie del parásito.

Por otra parte, un estudio comparativo demostró que la inmunofluorescencia indirecta con antígeno de promastigotes de L. amazonensis y la tira inmunocromatográfica con antígeno recombinante rK39, tuvieron mejor desempeño para el diagnóstico de casos clásicos en áreas endémicas, con valores de sensibilidad de 83,3 y 88,9 %, respectivamente. Por el contrario, la aplicación del ELISA, independientemente del antígeno utilizado, mostró valores de sensibilidad diagnóstica siempre bajos (50 %, 66,7 % y 69,4), y debido a la aparición adicional de reacciones cruzadas, no se recomendó ninguno en particular para las áreas endémicas.⁵⁷

También se utilizan el antígeno soluble o la fracción enriquecida de membrana, con una sensibilidad similar para ambos, del 89,5% y una especificidad variable del 89,5% y 93,4% respectivamente, en dependencia del preparado antigénico de que se trate⁵⁸.

De manera general, debido a que los anticuerpos circulantes en las presentaciones cutáneas tienen niveles muy bajos y la especificidad de los ensayos puede ser también variable, particularmente en áreas donde puedan ocurrir reacciones cruzadas con otros parásitos, como Trypanosoma cruzi,⁵¹ estos métodos permanecen como herramientas complementarias en los casos de leishmaniasis cutáneas.

Por el contrario, en la leishmaniasis visceral la detección de anticuerpos específicos resulta muy útil para el diagnóstico,⁵⁸ y se utilizan ensayos de ELISA, inmunoflurescencia (IF) y electroinmunotransferencia (Western blot), que muestran en ocasiones una alta seguridad diagnóstica, pero que tienen el inconveniente de ser poco adaptables a condiciones de campo.⁵⁹ ]]> El polipéptido recombinante de 39 kDa: rK39 se utilizó en países endémicos en un sistema ELISA de detección de anticuerpos con excelentes valores de sensibilidad (93-100 %) y especificidad (97-98 %).^60,61 Este elemento promovió su transformación en formato de tira inmunocromatográfica, más factible para condiciones de campo. Un análisis de validación que incluyó 13 estudios en áreas de alta endemicidad ofreció valores similares para la sensibilidad (93,9 %) y especificidad (95,3 %) y también se confirmó su valor diagnóstico en la India y Nepal.^62,63 Sin embargo, su validez en el Este africano ha sido variable, puesto que los pacientes sudaneses, por razones no esclarecidas aún, presentan títulos de anticuerpos más bajos contra esta proteína.⁶⁴ Este método, fácil y reproducible, se considera actualmente la mejor herramienta diagnóstica de la leishmaniasis visceral para las áreas remotas del Viejo Mundo.

La prueba de aglutinación directa (DAT siglas en inglés) es un ensayo semicuantitativo donde ocurre aglutinación visible si existen anticuerpos⁶⁵ y se ha evaluado en condiciones de campo en diversos países.⁶⁶ Un metaanálisis que agrupó 30 estudios estimó los valores de sensibilidad y especificidad del ensayo en 94,8 % y 97,1 %, respectivamente.⁶³ Se debe resaltar que aunque se ha desarrollado para condiciones de campo, requiere de incubaciones, disponibilidad de cierto equipamiento, personal bien entrenado y un control de calidad regular.⁶⁴

En el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) se cuenta con el DAT como herramienta investigativa y complemento en el estudio de casos donde exista sospecha de enfermedad visceral, debido a que no se ha realizado la validación del ensayo en áreas endémicas. El antígeno que se utiliza, de L. donovani cepa 1S, se produce en el laboratorio de investigaciones en Leishmania, de acuerdo a las normas establecidas en el Instituto de Medicina Tropical de Amberes, Bélgica.

Diagnóstico molecular

Los métodos moleculares se utilizan ampliamente en el diagnóstico de la leishmaniasis, porque permiten detectar el ADN presente en una biopsia aún en cantidades mínimas (fentogramos) o lo que es igual, hasta un solo parásito.^67,68 Aunque esta técnica ha demostrado ser la más sensible y específica, su uso está restringido al tercer nivel de cuidados hospitalarios, laboratorios de investigación y también se recomienda su empleo en centros de referencia.⁶⁹

La información acerca de secuencias de ADN, y el conocimiento de los genomas completos de algunas especies de Leishmania, disponibles en la actualidad en las redes de información, constituyen un aporte fundamental para desarrollar ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), con aplicaciones que incluyen el diagnóstico. Para este propósito se utilizan varios genes, de preferencia secuencias multicopias, con la finalidad de desarrollar una máxima sensibilidad en la detección. Las dianas genéticas más utilizadas para el diagnóstico y sus características se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Características de algunas de las dianas genéticas más utilizadas para la detección ]]> molecular o la identificación de especies del género Leishmania

S y E: indican la sensibilidad y especificidad diagnóstica de la reacción en cadena de la polimerasa correspondiente, 
en aquellos casos en que se reportó. Se refieren solamente aplicaciones a la detección o identificación en muestras clínicas.

La superioridad de la reacción en cadena de la polimerasa se explica también por el hecho de admitir aplicaciones en un amplio rango de especímenes clínicos, lo que reviste gran importancia debido a la gran variedad de presentaciones de la leishmaniasis. Entre estas muestras se cuentan: biopsia y raspado de piel, aspirados de médula ósea y nódulos, muestras de sangre^90,92,93 e incluso conjuntiva.⁹⁴ Se notifica que es posible obtener ADN a partir de preparaciones de aspirados de médula ósea, teñidas previamente con Giemsa,⁹⁵ y muy recientemente se reportó el uso de papel de filtro impregnado en la lesión,⁹⁶ así como de aplicadores en la mucosa bucal para la detección de parásitos en casos de leishmaniasis visceral.⁹⁷

En las formas cutáneas, la reacción en cadena de la polimerasa es la herramienta diagnóstica de más valor pues presenta valores de sensibilidad y especificidad altos.^71,80,98 La sensibilidad y especificidad varía en dependencia de la diana genética (tabla 3) y de la normalización del ensayo, pero por lo general se reportan numerosos protocolos cuyos resultados no son comparables, puesto que responden a necesidades de países o regiones y a la detección del parásito en una u otra forma de la enfermedad;^90,99,100 sin que exista una validación multicéntrica de estos, o se comparen los distintos protocolos disponibles, para enfrentar el diagnóstico molecular de manera uniforme.

La muestra de la cual se obtiene el ADN a analizar se puede tomar mediante aplicadores con algodón o palillos de dientes estériles, lo que constituye una alternativa no invasiva^91,101 y también con papel de filtro.⁹⁶ Se han desarrollado también reacción en cadena de la polimerasa especie-específicas para la identificación de especies del parásito de importancia médica a nivel local.^99,102 ]]> En la enfermedad mucocutánea, la utilización del ADN del kinetoplasto (kDNA) como diana genética resulta muy sensible para detectar los parásitos, mientras que los genes que codifican los espaciadores internos de la transcripción (ITS), resultan más útiles para discriminar entre las especies que producen esta forma clínica en Brasil.⁷¹ Se describió también la detección de kDNA de parásitos del subgénero L. (Viannia) en tejidos de la mucosa de 81 % (21/26) de pacientes con enfermedad cutánea, lo cual pudiera indicar, paralelamente, que este es un hecho común en infecciones con parásitos de este subgénero.¹⁰³

Por otra parte, se informó de 46 casos de leishmaniasis mucocutánea procedentes del Amazonas, que se detectaron mediante reacción en cadena de la polimerasa usando ADN obtenido de biopsias embebidas en parafina.¹⁰⁴

Para la leishmaniasis visceral, la detección de parásitos por reacción en cadena de la polimerasa es más sensible que el examen microscópico, el cultivo y los exámenes serológicos, en particular en muestras que tienen una baja carga parasitaria.⁵¹ Los valores de sensibilidad varían, y se reporta un rango de 82 a 100 % si se compara con el examen microscópico,^105,106 mientras que la especificidad puede estar entre 71,7 y 100 %.^107,108 Se recomienda realizar la evaluación de pacientes sospechosos en sangre periférica, antes de proceder al examen sobre aspirado o biopsia.¹⁰⁹ También este método puede ser útil para detectar los parásitos cuando hay peligro potencial para la transmisión de kala-azar mediante transfusión, en cuyo caso la serología tiene un papel muy limitado.¹¹⁰

El uso de aplicadores en la zona bucal permitió detectar por primera vez casos de leishmaniasis visceral mediante una reacción en cadena de la polimerasa que mostró 83 % de sensibilidad y 90,5 % de especificidad en grupos controles, usando como blanco una región del gen que codifica el fragmento 18S del rRNA.⁹⁷ También, recientemente, se informó la posibilidad de detectar ADN de Leishmania en el fluido oral de personas con esta forma de la enfermedad, con valores de sensibilidad y especificidad que se consideran aceptables,¹¹¹ al tiempo que continúan nuevas aplicaciones para el diagnóstico en países del Viejo Mundo.¹¹²

La leishmaniasis cutánea posvisceral también se puede diagnosticar mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se describe un protocolo que utiliza cebadores que amplifican kDNA, que por su alta especificidad, resulta muy útil para el diagnóstico de pacientes inmunocomprometidos, donde el diagnóstico serológico falla a menudo.¹¹³

En relación con los casos de coinfección de Leishmania con VIH, la reacción en cadena de la polimerasa parece ser al menos tan sensible como otros métodos aplicados cuando se desea diagnosticar leishmaniasis visceral en muestras de sangre periférica. Un estudio comparativo indicó que la reacción en cadena de la polimerasa en sangre periférica y en muestras de médula ósea es altamente sensible y específica para el diagnóstico de la leishmaniasis visceral tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunocomprometidos, lo cual permite, adicionalmente, identificar la especie del parásito cuando se emplean como blanco cebadores que codifican para el rARN.¹¹⁴

Diagnóstico en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

En el laboratorio de Leishmania del IPK, en paralelo al trabajo investigativo, se procesan las muestras clínicas humanas recibidas del hospital de la institución, cuando existe sospecha de leishmaniasis importada, para lo cual se sigue un algoritmo que responde al tipo clínico de leishmaniasis que se sospeche y las correspondientes herramientas diagnósticas que se aplican (Fig. 2). ]]>  

En primer lugar se realiza el examen parasitológico directo de la muestra de raspado, impronta o biopsia. Esta muestra se fija en metanol, después se tiñe con Giemsa y se observa con cuidado en el microscopio de luz con aceite de inmersión, para realizar la identificación de los amastigotes, que se observan como estructuras redondeadas u ovaladas, de color azuloso, donde se distingue el núcleo, de color más intenso.

En paralelo, se realiza el cultivo del aspirado de la lesión, o de una muestra del tejido en medio Novy, McNeal, Nicolle (NNN) cuya fase líquida es el medio de Schneider y se incuba a 28 ºC.²⁹ La búsqueda de promastigotes móviles del parásito, como resultado de la transformación de los amastigotes presentes en la muestra, se realiza mediante la observación diaria en un microscopio de luz invertido. Para ofrecer un resultado negativo, el cultivo se mantiene hasta 15 d.

Para el diagnóstico molecular se cuenta como método de referencia con la reacción en cadena de la polimerasa-18S, que amplifica un fragmento de 115 pb de la región 18S del gen que codifica el ARN ribosomal, y cuyos valores de sensibilidad y especificidad son adecuados: (S: 92 % en sangre, 92,9 % en médula ósea y E: 99,6 en personas procedentes de áreas no endémicas).⁷⁷ Posteriormente, se informó una sensibilidad de 93,2% en casos de enfermedad cutánea y mucocutánea, y de 86 % en enfermedad visceral, siendo la especificidad de 95 % en personas de área endémica y de 98,3 % para personas procedentes de áreas no endémicas.⁸¹ Por estas razones se normalizó y adaptó a las condiciones del IPK.

En paralelo, se utiliza el gen que codifica la proteína de choque térmico de 70 kDa, como diana para la detección del parásito por reacción en cadena de la polimerasa y la posterior tipificación de la especie infectante, sobre la base del polimorfismo genético identificado en secuencias nucleotídicas de 14 especies de este protozoo, que fueron estudiadas en nuestro grupo de trabajo.¹¹⁵ La identificación de especie se logra mediante la restricción enzimática del producto de amplificación (RCP-RFLP),¹¹⁶ lo cual se aplicó al análisis de una representación de muestras clínicas procedentes de áreas endémicas de Colombia.¹¹⁷

Más recientemente, se desarrollaron 3 nuevas propuestas que permiten la detección y tipificación de distintas especies del parásito, en relación con el fragmento del gen hsp70 que se amplifique, (RCP-F, RCP-N y RCP-C), y la posterior digestión del producto de amplificación obtenido (RFLP-F, N y C) con aplicaciones variables según las distintas áreas geográficas o las formas clínicas de que se trate.¹¹⁸ Estos protocolos se encuentran hoy día en evaluación en áreas endémicas, con muestras clínicas diversas procedentes de países endémicos. ]]> En conclusión, para diagnosticar correctamente la leishmaniasis no se debe despreciar ninguna de las alternativas posibles. Una vez que existan elementos epidemiológicos que indiquen la infección, será útil tanto la clásica observación del estadio intracelular del parásito o amastigote, presente en las células de tejidos infectados, hasta la detección de su ADN. Todos los métodos aportan información de utilidad para la toma de decisiones en el procedimiento clínico, la imposición del tratamiento y el abordaje epidemiológico de esta parasitosis. Entre estos, se propone un algoritmo de trabajo en nuestro laboratorio, con el empleo de los métodos que resultan más útiles de acuerdo a las condiciones y experiencias.

En este trabajo se pretende actualizar de forma rápida algunos aspectos relativos al diagnóstico de esta parasitosis, mostrar la forma en que se ha abordado en nuestro contexto, y ofrecer algunas alternativas que pudieran resultar de utilidad práctica, tanto para laboratorios de referencia en países no endémicos como en Cuba, y para algunas áreas endémicas de leishmaniasis.

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Recibido: 2 de febrero de 2012.
Aprobado: 16 de febrero de 2012.

  ]]> Ana Margarita Montalvo. Departamento de Parasitología. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía Km 6½. Lisa. La Habana, Cuba. Correo electrónico: amontalvo@ipk.sld.cu ]]> 1 2009 31 254-66 2 1993 6 230-50 3 1999 93 488-94 4 2000 16 925-50 5 2004 10 598-607 6 2003 727-9 7 2003 1 29-45 8 2006 19 111-26 9 2006 75 273-7 10 2005 366 1561-77 11 2006 22 552-7 12 1989 69 100-3 13 2001 95 239-43 14 2004 39 1674-80 15 2009 16 123-31 16 2008 24 135-42 17 2011 16 510-3 18 2008 21 334-59 19 1990 4 1-24 20 1950 43 405-17 21 1981 22 1983 35 257-62 23 1988 40 88-94 24 2005 59 1-75 25 2011 240 286-96 26 2004 20 297-31 27 2010 48 1 1 28 2009 160 311-8 29 2010 8 419-33 30 1998 37 846-49 31 2006 45 116-20 32 1993 32 802-5 33 2007 7 581-96 34 2002 186 1829-34 35 1995 53 256-9 36 1986 80 859-76 37 1987 36 489-96 38 2007 46 132-42 39 2003 130 27-30 40 2011 128 391-5 41 2001 95 S27-58 42 1999 354 1191-9 43 1980 89 195-208 44 2007 5 873-82 45 2007 25 203-11 46 2003 16 97-101 47 1989 46 121-30 48 2001 96 987-96 49 1983 35 111-24 50 2007 7 3680-4 51 2007 45 21-5 52 1990 42 36-42 53 2000 38 3768-73 54 2007 83 649-57 55 1995 21 123-5 56 2005 93 49-56 57 2010 24 289-94 58 2006 75 739-43 59 2002 40 475-9 60 1996 173 758-61 61 2002 67 344-8 62 2006 44 251-3 63 2003 8 277-85 64 2006 74 76-80 65 1986 80 583-6 66 2008 102 32-40 67 2006 44 1435-9 68 1989 86 6230-4 69 2010 105 109-12 70 2003 46 115-24 71 2007 102 549-54 72 2002 88 918-25 73 2001 65 902-6 74 2005 51 185-90 75 2009 48 404-8 76 2010 50 e1-6 77 2009 47 2560-3 78 2007 76 896-901 79 2007 115 339-43 80 2008 198 1565-72 81 2008 13 1378-83 82 2009 48 1091-5 83 2005 99 762-8 84 2011 49 2003-5 85 2009 3 115-22 86 2003 97 80-7 87 2004 189 1035-43 88 2010 126 203-8 89 2009 122 61-5 90 2007 101 368-71 91 2004 42 2294-7 92 2008 103 583-6 93 2009 39 227-46 94 2004 189 1729-33 95 2009 136 981-6 96 2011 49 1097-100 97 2010 49 2003-6 98 2011 71 151-5 99 2004 90 31-7 100 2006 44 459-67 101 2002 81 197-202 102 2010 44 571-4 103 2009 200 638-46 104 2011 5 e980 105 1995 73 249-52 106 2004 10 MT1-5 107 2004 3 251-7 108 2006 56 395-400 109 1997 35 454-7 110 2000 62 128-33 111 2011 49 3150-3 112 2011 6 e19304 113 2003 56 840-3 114 2007 44 1602-10 115 2010 10 238-45 116 2010 137 1159-68 117 2010 104 364-67 118 2011