Palabras clave: SUPEROXIDO DISMUTASA/química. RADICALES LIBRES. SUPEROXIDO/aislamiento y purificación. IN VITRO.
Las superóxido dismutasas (SODs, superóxido -superóxido oxidorreductasas, 1.15.1.1), son un grupo de metaloenzimas presentes frecuentemente en organismos aeróbicos, aerotolerantes y algunos anaerobios obligados. Son esenciales para su defensa contra la toxicidad producida por los metabolitos parcialmente reducidos, generados du- rante la reducción biológica normal del oxígeno molecular.
Se conocen 3 formas de SODs según el metal que utilizan como cofactor. Estas a su vez pueden dividirse en 2 familias filogenéticas diferentes: CuZn-SODs y Fe/Mn-SODs.
Entre ellas no existe homología de secuencias ni de estructuras de orden superior, lo que indica que evolucionaron independientemente en respuesta a una presión evolutiva común: la presencia del oxígeno y la amenaza de su toxicidad.1
Estas enzimas catalizan la conversión del radical superóxido (O2-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno molecular (O2), en una de las reacciones catalizadas por enzimas más rápida que se conoce (K= 2 x x109 M-1S-1 para la CuZn-SOD).2
O2- + O2 - 2H+ ----> H2O2 + O2
Como las concentraciones del O2- son normalmente bajas, la reacción depende de su difusión. Sin embargo, la asociación de la enzima con su sustrato no es una simple cuestión de difusión y colisión. La estructura submolecular de la enzima, la distribución de carga electrostática, interacciones de apantallamiento por solventes inter e intramoleculares, y las interacciones hidrodinámicas, pueden afectar tanto la difusión del O2- como su asociación con la enzima. Se ha encontrado que el campo eléctrico de la SOD favorece 30 veces la velocidad de asociación del anión.3
La SOD fue la primera enzima de la cual se conoció que actuaba sobre un radical libre. Su descubrimiento en 1968 por McCord y Fridovich, constituyó una prueba de la existencia de estos radicales en los organismos vivos.2,4 ]]>
También propició el surgimiento de un nuevo campo científico en el que el oxígeno, la molécula que hizo posible la vida en nuestro planeta, tenía que ser considerada también en términos de su toxicidad.5 A esto se le denominó la paradoja del oxígeno.PAPEL DE LA SOD
Los estudios con mutantes deficientes de la SOD evidencian que la enzima, dentro de este sistema de defensa, tiene una función fundamental.6 Esta consiste en eliminar el radical superóxido antes de que éste reaccione con moléculas biológicas susceptibles u origine otros agentes tóxicos. El peróxido de hidrógeno generado por la acción de la enzima, es eliminado por la catalasa y/o la glutatión peroxidasa.7 En eucariotas existen 3 tipos de SODs de diferente localización, que en su conjunto contribuyen a la regulación de las concentraciones de este radical. Ellas son: Mn-SOD mitocondrial, CuZn-SOD citosólica y CuZn-SOD extracelular.7,8
En estudios realizados en hepatocitos de rata se encontró que el 20 % de los O2- formados en la mitocondria pueden pasar al citosol, mientras el 80 % restante puede ser neutralizado por la enzima mitocondrial.8
En el citoplasma, la eficiencia de la protección que la CuZn-SOD puede proporcionar a las proteínas citosólicas depende de:
El gen que codifica a esta enzima, se encuentra ubicado en el cromosoma 21 y más específicamente en el segmento extra (21q22) que aparece en el síndrome de Down, de ahí que los niveles de SOD se encuentren elevados en la generalidad de estos casos.6,13 ]]>
La CuZn-SOD humana, presenta escasas diferencias de estructura, tal y como se evidencia al comparar su secuencia aminoacídica, comportamiento electroforético y espectrofotométrico con respecto a la bovina.14 Ambas ejercen igual acción, por lo que en estudios experimentales con animales u órganos aislados, pueden utilizarse indistintamente.CARACTERISTICAS FISICOQUIMICAS
Esta enzima citosólica, fue la primera SOD que se conoció.2 En su forma nativa, está constituida por 2 subunidades idénticas, de peso molecular aproximado igual a 16 kd y de 151 a 153 aminoácidos, unidas por puentes disulfuro.14,15 El peso molecular reportado para el dímero es de 31,2 kd.
En su composición aminoacídica se destaca la existencia de 25 residuos de glicina por cada subunidad, que constituyen casi 1/6 del total de aminoácidos y se distribuyen uniformemente a lo largo de la secuencia. Esto hace que la hoja ß sea una característica prominente de la estructura secundaria de esta enzima. También son característicos los numerosos cambios de dirección del esqueleto peptídico. El contenido de aminoácidos aromáticos se distingue por la presencia de 8 residuos de fenilalanina, la escasez de tirosina (2 residuos) y la ausencia de triptófano [García O, García B, Guerrero C. Evaluación de la superóxido dismutasa purificada en el laboratorio, antes y después del experimento de reconstitución con metales. Jornada Científica del ICB "Victoria de Girón", 1992] (figura 1).
COMPOSICION DE METALES
Cada subunidad tiene unido un átomo de Cu+2, esencial para su acción catalítica y uno de Zn+2 que desempeña un papel estructural.15 Estos se sitúan en el extremo de un largo canal entre 2 asas de cadena polipeptídica, de forma tal que el cobre queda parcialmente expuesto al solvente.
El ion cúprico se encuentra coordinado a los nitrógenos imidazólicos de 4 residuos de histidina localizados en el sitio activo y a una molécula de agua. Uno de los imidazoles unidos al cobre está desprotonado y coordinado también al ion Zn2+, sirviendo como puente entre los 2 iones.
En estudios de reconstitución del contenido de metales con la apoproteína, utilizando diferentes concentraciones de Cu2+, Zn2+ o ambos, se encontró que las propiedades enzimáticas de la 4Cu2+, la 2Cu2+-2Zn2+ y la 3Cu2+-1Zn2+ fueron esencialmente iguales. Considerando que la 4Zn2+ resultó inactiva y que la 2Cu2+-1Zn2+ fue casi totalmente activa, se concluyó que 2Cu+2 eran responsables de la transferencia de electrones, mientras que otros 2Cu2+ o 2Zn2+ actuaban como cofactores estructurales esenciales.15 Actualmente se cree, en general, que el puente imidazólico se rompe y se protona en el sitio del cobre cuando éste es reducido de +2 a +1. El imidazol queda unido al zinc en esta forma reducida de la enzima.
El Zn+2 se encuentra también coordinado a otros 2 imidazoles histidínicos y a un grupo carboxílico de un residuo de ácido aspártico. La estructura obtenida por difracción de rayos X a 2 A de resolución indica, que el sitio de unión del cobre tiene simetría piramidal cuadrada mientras que el sitio del zinc es casi tetraédrico.
La pérdida de los metales total o parcialmente, provoca ausencia o disminución de la actividad de la enzima. Este es un factor importante a tener en cuenta en el proceso de purificación. ]]>
En aras de recuperar o minimizar la disminución de la actividad de la enzima, desarrollamos un esquema que permite la reconstitución de la enzima con metales.16 Los resultados mostraron un aumento tanto en la actividad específica de la enzima (1,5 veces) como en la relación ABS 258/280 nm (1,3 veces), con variaciones no significativas en la concentración de proteínas.ABSORCION DE LA LUZ ULTRAVIOLETA
El espectro de absorción ultravioleta de la enzima, muestra características inusuales con respecto al resto de las proteínas. Presenta mayor absorbancia (ABS) a 258 que a 280 nm con la aparición de pequeños picos a 254, 260 y 266 nm.2,15 Esto se atribuye al efecto combinado de la composición de aminoácidos aromáticos peculiar de la proteína y el efecto hipercrómico de los átomos de Cu y Zn2 (figura 2).
PATRON ELECTROFORETICO
El comportamiento electroforético de la enzima también tiene sus particularidades. En electroforesis en gel de poliacrilamida se reporta la aparición de 2 bandas en el gel teñido: un componente principal y un componente menor que no aparece en todas las preparaciones y tiene una movilidad ligeramente superior. No obstante, en cromatografía de tamiz molecular se obtiene un solo pico y en el electroenfoque se obtiene una banda única a pH=4,95, que corresponde al punto isoeléctrico de la proteína15 (figura 3).
PURIFICACION
Se han descrito varios métodos para aislar la CuZn-SOD.2 El utilizado por McCord y Fridovich en 1968 para aislar la SOD de eritrocito bovino, es un método engorroso aunque factible de implementar en nuestros laboratorios.2 No obstante resulta imposible su utilización en producción a gran escala.
Conociendo las ventajas del sistema FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas, péptidos y polinucleótidos), nos planteamos la tarea de probar su utilización en sustitución de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa referida por McCord y Fridovich.
A la vez, hemos evaluado la cromatografía de afinidad por metales.16,17 En ésta, las proteínas interactúan con los metales pesados al formar la histidina y cisteína complejos estables con los iones Zn++ y Cu++. Por lo tanto, un gel cargado con estos iones, fijados fuertemente al gel de soporte, y con una alta capacidad de unión, puede interactuar con los grupos imidazoles y tioles de las proteínas expuestos en la superficie. Por consiguiente los geles hidrofílicos que contienen cobre y zinc, pudieran ser absorbentes selectivos para péptidos y proteínas que contengan histidina y cisteína.
M---L Men+ + XP ]]>
M---L Men+ --- XPTeniendo en cuenta lo antes expuesto y en virtud de las características estructurales de la SOD, implementamos su purificación utilizando geles de producción nacional (figuras 4 y 5).
Actualmente se utiliza de forma sistemática como parte del esquema de purificación desarrollado en nuestro laboratorio donde solamente resulta necesario ejecutar 7 operaciones unitarias con relación a las 17 de los métodos clásicos.
Se abre de esta forma el camino de crear las condiciones para implementar el uso experimental de la CuZn-SOD en nuestro medio.