Evaluación de la capacidad protectora de 3 biomoléculas en un sistema in vitro de daño al ADN

El daño al ADN es una de las consecuencias más nocivas de estrés oxidativo y se considera responsable de la aparición de diversas enfermedades de alta incidencia en países con larga expectativa de vida; asimismo, desempeña un papel central en los procesos de envejecimiento.

En consonancia con lo expresado, hemos puesto a punto en nuestro laboratorio un sistema de ensayo de daño al ADN plasmidial que permite evaluar en condiciones ideales la interacción de la molécula de ADN con diversos agentes protectores en condiciones controladas, lo que brinda una aproximación inicial al posible empleo de éstos en la protección del ADN contra agentes genotóxicos.

El sistema consiste en el empleo del peróxido de hidrógeno H₂O₂ (1-4 mM) en presencia de Fe₂SO₄ (10 mM) a varias temperaturas y pHs.

El ADN empleado como blanco es el del plásmido bluescribe k/s+ a una concentración de 50 ng/mL. La incubación del ADN se realiza a 37 ^oC en la oscuridad, luego se corre en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se evalúan las proporciones de las bandas de ADN plasmidial de tipo I,II y III (ADN superenrollado, lineal o circular).

La transición de las formas I a III y luego a la II es resultado de roturas de simple y doble cadena en el plásmido; de ahí que la capacidad protectora de las biomoléculas que estudiamos se determine por su habilidad de impedir o disminuir la transición conformacional del ADN. Los geles se fotografían y se hace una lectura de la intensidad de las bandas en los negativos empleando un densitómetro láser.

Para evaluar la repercusión biológica del daño se determina la capacidad del ADN plasmidial de transformar o no la E. coli. HB 101 que no puede reparar las lesiones en el plásmido por ser rec- y también se prueban las posibilidades de alfa complementación en el gen Lac Z. Los protocolos de transformación y de alfa complementación en presencia de IPTG y x gal fueron según Maniatis.¹

Después de determinar las características de la cinética de relajación del ADN plasmidial, establecimos condiciones fijas de temperatura (37 ^oC) y pH (7,8); la duración de los experimentos fue de 60 min.

Al estudiar las propiedades protectoras de la espermidina (una poliamina), del inhibidor de proteasas aprotinina y de la enzima antioxidante catalasa obtuvimos los resultados siguientes: la poliamina espermidina protege al ADN plasmidial a concentraciones desde 0,02M y es capaz de prolongar en un 10 % el tiempo en el que se logra eliminar por completo la banda de tipo I. La aprotinina no con-fiere protección al ADN, mientras que la enzima catalasa lo hace desde 43,3 mU/Ml hasta más de 86,6.

La transformación bacteriana y la alfa complementación disminuyen en dependencia del tiempo de exposición al peróxido y al hierro. No obstante, cuando se emplean la espermidina y la catalasa la tendencia a disminuir desaparece de manera significativa (p < 0,01). ]]> Estos resultados muestran que la espermidina, una poliamina que se ha reportado recientemente como mediadora de mecanismos de protección contra el estrés oxidativo y cuya depleción favorece la aparición de roturas de doble hebra en el ADN cromosomal de células en cultivo, puede proteger en un sistema libre de células,^2,3 es posible que por su forma alargada, y su capacidad de unirse al ADN bicatenario pueda disminuir la capacidad del OH (generado en la reacción del peróxido y el Fe) de atacar los grupos nucleofílicos del ADN.

La definición de las mejores condiciones para su acción protectora y de la naturaleza de ésta, requiere de un mayor número de experimentos. La catalasa produce la rotura del H₂O₂ y en consecuencia era de esperar que disminuyera el daño por esta especie.⁴

Por el contrario la aprotinina, sustancia con una marcada actividad antioxidante y que se emplea en la clínica, no protegió, lo que indica una vez más que su mecanismo de protección no es el de secuestrador de radicales y que está basado en su inhibición de la transformación a su forma activa de proteínas generadoras de radicales como la xantina oxidasa.⁵

Los resultados indican que contamos con un sistema útil en la evaluación inicial de agentes con posibles propiedades protectoras sobre el ADN.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Dr. Elio Prieto González. Centro de Investigaciones Biomédicas (CIBIOMED) Laboratorio de Biología Celular y Molecular. ]]> 1989 1994 153 11 11 4880-9 1994 102 ^sSuppl ^sSuppl Suppl 51-5 1993 26 351-7 1988 96 314-20