Carcinogenicidad del D-004 en ratas Sprague Dawley. Reporte parcial a los 18 meses
Carcinogenicity of D-004 in Sprague Dawley rats. A partial report at 18 months
Dra. C. Ariadne Gutiérrez Martínez, Dr. C. Rafael Gámez Menéndez, Dra. C. Rosa Mas Ferreiro, Dra. C. Miriam Noa Puig, MsC. Maikel Valle Clara, Lic. Carlos Nodal Flores. ]]>
Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: el D-004, un extracto lipídico del fruto de la palma real, Roystonea regia, constituido por una mezcla reproducible de ácidos grasos, principalmente oleico, palmítico, láurico y mirístico, ha mostrado prevenir la hiperplasia prostática (HP) inducida con T en roedores y actúa mediante un mecanismo multifactorial que implica la inhibición de 5a-reductasa prostática, el antagonismo de las respuestas mediadas por los a1-ADR, efectos anti-inflamatorios y antioxidantes.
Objetivo: el presente trabajo tiene como propósito resumir los resultados parciales (18 meses) del estudio de carcinogenicidad a largo plazo del D-004 en ratas, el cual culminará con el tiempo establecido de 24 meses.
Métodos: se distribuyeron ratas Sprague Dawley (SD) de ambos sexos aleatoriamente, en cuatro grupos (50 ratas/sexo/grupo): un grupo como control de vehículo, y tres tratados con D-004 (500, 1 000 y 1 500 mg/kg, respectivamente). Los tratamientos se administraron por intubación gástrica. Este reporte incluye los resultados de peso corporal, observaciones clínicas, mortalidad y frecuencia de aparición de tumores hasta ese momento.
Resultados: la frecuencia de mortalidad es baja, en los grupos tratados fue de un 8.3 % por un 9 % en los controles, no se evidencia disminución en el tiempo de supervivencia y las observaciones diarias no revelaron signos indicativos de toxicidad atribuibles al tratamiento. Además, el momento de aparición y la frecuencia de tumores en animales tratados y controles fueron estadísticamente similares en ambos sexos. ]]>
Conclusiones: en conclusión, la administración de D-004 (5001500 mg/kg) a ratas durante los primeros 18 meses del estudio, no mostró evidencias de toxicidad o carcinogenicidad temprana relacionadas con el tratamiento.
Palabras clave: D-004, Roystonea regia, ácidos grasos libres, hiperplasia prostática benigna (HPB), ratas Sprague Dawley, carcinogénesis.
ABSTRACT
Introduction: D-004, a lipid extract from royal palm (Roystonea regia) fruit made up of a reproducible mixture of fatty acids, mainly oleic, palmitic, lauric and myristic, has shown to prevent prostate hyperplasia (PH) induced by T in rodents. It acts through a multifactorial mechanism involving prostatic 5a-reductase inhibition, antagonism of a1-ADR-mediated responses, and antiinflammatory and antioxidant effects.
Objective: the paper is aimed at summarizing the partial results (18 months) of the long-term carcinogenicity study of D-004 in rats, which is set to conclude in the established 24-month period.
Method: Sprague Dawley (SD) rats of both sexes were randomly distributed into four groups (50 rats/sex/group): one group as vehicle control and three treated with D-004 (500, 1 000 and 1 500 mg/kg, respectively). Treatments were administered by gastric intubation. This report presents the results obtained so far concerning body weight, clinical observations, mortality and frequency of appearance of tumors.
Results: mortality rate is low: 8.3% in the treated groups and 9% among controls. No evidence was found of survival time reduction, and daily observations did not reveal any signs of toxicity attributable to the treatment. The time of appearance and the frequency of tumors in treated animals and controls were statistically similar in both sexes.
Conclusions: administration of D-004 (5001 500 mg/kg) to rats during the first 18 months of the study did not show any evidence of early carcinogenicity or toxicity associated with the treatment.
Key words: D-004, Roystonea regia, free fatty acids, benign prostatic hyperplasia (HPB), Sprague Dawley rats, carcinogenesis.
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INTRODUCCIÓN
La hiperplasia prostática benigna (HPB) es una patología de alta incidencia en hombres mayores de 50 años que causa eventos adversos considerables para la salud, cuya frecuencia aumenta con la edad.1 Consiste en un crecimiento incontrolado del tejido prostático que involucra los elementos estromales y epiteliales de la glándula y su etiología es multifactorial. Una de las causas fundamentales del incremento del tamaño de la próstata con la edad es el aumento de la actividad de la 5a-reductasa prostática, enzima que transforma la testosterona (T) en su metabolito más activo, la dihidrotestosterona (DHT), la cual al unirse a los receptores androgénicos, promueve la proliferación de factores de crecimiento celular1. Por otra parte, los síntomas de la enfermedad se encuentran influidos por el aumento del tono de la musculatura lisa de la vejiga y la próstata, regulado por los a1-adrenoreceptores (a1-ADR).2
El tratamiento de la enfermedad abarca, según su severidad, desde la vigilancia atenta hasta la cirugía, pero la terapia farmacológica es la más utilizada. Esta terapia se basa fundamentalmente en el empleo de dos clases terapéuticas: los inhibidores de la 5a-reductasa prostática (finasteride, dutasteride),3 y los antagonistas de los ADR-a1 (alfuzosin doxazosin, prazosin, terazosin, tamsulosin).2
El manejo de la HPB también incluye la fitoterapia, y el agente más conocido y estudiado es el extracto lipídico de los frutos de Saw palmetto, Serenoa repens.4 El modo de acción de Saw palmetto incluye diversos mecanismos, ya que inhibe la actividad de la enzima 5a- reductasa prostática, bloquea los receptores a-adrenérgicos,5 y además posee efectos anti-inflamatorios y anti-proliferativos.6, 7
La palma real, Roystonea regia, es la palmácea más abundante en Cuba y presenta similitudes taxonómicas con Saw palmetto.
El D-004 es un extracto lipídico del fruto de la palma real, constituido por una mezcla de ácidos grasos, principalmente oleico, palmítico, láurico y mirístico,8 que ha mostrado prevenir la hiperplasia prostática (HP) inducida con T en roedores y que, como el Saw palmetto, actúa mediante un mecanismo multifactorial que implica la inhibición de 5a-reductasa prostática,9-11 el antagonismo de las respuestas mediadas por los a1-ADR,12, 13 efectos anti-inflamatorios y antioxidantes.14, 15 Tal similitud es consistente con la de las composiciones de los extractos lipídicos de los frutos de Roystonea regia y Serenoa repens. Tales antecedentes, unidos a los resultados obtenidos en los primeros estudios clínicos del D-004 que mostraron sus efectos antioxidantes en voluntarios sanos,16 sustentan la necesidad de desarrollar la evaluación toxicológica de esta sustancia.
El D-004, a dosis de hasta 2 000 mg/kg no reveló toxicidad en los estudios de dosis únicas y repetidas a corto y largo plazo, por vía oral.17-21 Tampoco mostró potencial citotóxico o mutagénico en ninguno de los sistemas empleados, dentro de los cuales se incluye el ensayo de Ames, el ensayo cometa, ensayo de micronúcleos en medula ósea de roedores, aberraciones cromosómicas in vitro e in vivo y el ensayo de morfología de la cabeza del espermatozoide. 22-27 Por otra parte, otros estudios han demostrado que el D-004 no posee efectos estrogénicos o antiestrogénicos.9, 28, 29 no modifica la actividad sexual en la rata macho,30 ni diversos patrones conductuales en roedores.31
El tratamiento con D-004 no afectó la fertilidad y la reproducción en ratas,32 ni produjo efectos embriotóxicos o teratogénicos en conejos a dosis de hasta 1 000 mg/kg.33
Teniendo en cuenta que los resultados obtenidos luego de 18 meses de tratamiento, en el estudio de carcinogenicidad inducida a largo plazo (24 meses) por la administración oral de D-004 a ratas SD, son un aporte al conocimiento de la toxicidad por exposición repetida y prolongada a esta sustancia, presentamos el reporte parcial a ese intervalo de tiempo. ]]>
MÉTODOS
Animales
Se utilizaron ratas SD de ambos sexos (75 y 110 g) de 7 semanas de edad, provenientes del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) en La Habana, Cuba, las cuales se colocaron en cajas para roedores (tres ratas/jaula) y se mantuvieron en cuarentena durante 7 días, para su adaptación a las condiciones experimentales, temperatura 25ºC ± 2, 60% ± 10 de humedad relativa y ciclos de luz y oscuridad de 12 h, que se mantuvieron durante el estudio. Los animales tuvieron acceso libre al agua. Como alimento se suministró pienso convencional para roedores proveniente del CENPALAB, el cual se administró en función del peso corporal promedio (10 % del peso) durante las primeras 13 semanas. A partir de la semana 14 la cantidad administrada a los animales se restringió, suministrándoles el 80 % del consumo promedio hasta el final del estudio.
La manipulación y cuidado de los animales se realizó de acuerdo a los principios éticos para el uso de animales de laboratorio, establecidos internacionalmente y en nuestro país, a las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio y los Procedimientos Normalizados de Trabajo del Centro de Productos Naturales.
Administración y dosificación
El D-004 utilizado en los estudios fue suministrado por el departamento de Química Farmacéutica del Centro de Productos Naturales, y se utilizó tras corroborar sus especificaciones de calidad, determinándose su composición y pureza mediante un método validado de cromatografía gaseosa.34
Para su administración en el D-004 se preparó diariamente como emulsión en un vehículo Tween 65/H2O al 2 %. Las emulsiones a emplear se prepararon 2 horas antes de su utilización, tras corroborar su estabilidad y homogeneidad mediante cromatografía gaseosa.35 Se realizaron los ajustes de la dosis según el peso corporal calculado semanalmente.
El D-004 se administró una vez al día (entre 9:00 y 11:30 a.m., 5 días/semana), frecuencia aceptada para estos estudios. Los resultados aquí reportados corresponden a los de la administración realizada durante 18 meses consecutivos.
Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos (50 ratas/sexo/grupo): un grupo como control de vehículo y tres tratados con D-004 (500, 1 000 y 1 500 mg/kg, respectivamente). Los tratamientos se administraron por intubación gástrica (2 mL/kg). La dosis mayor estudiada, es 300 veces superior que la dosis propuesta para su uso en humanos (320 mg/día H» 4,6 mg/kg). ]]>
Exámenes realizadosPeso corporal. El peso corporal se controló al inicio (día previo al comienzo del tratamiento), semanalmente hasta la semana 13, y mensualmente de la semana 14 hasta los 18 meses.
Consumo de alimentos. El consumo de alimentos se controló dos veces a la semana durante las primeras 13 semanas, y una vez al mes a partir de la semana 14.
Observaciones diarias. Los animales se observaron diariamente en tres momentos: en la mañana (de 8:30 a 11:30 a.m.) se realizó una inspección minuciosa de cada animal; y entre las 2:00 y 3:00 p.m. y las 5:00 y 6:00 p.m. en que se registró cualquier cambio en la condición vital de cada animal. Estas observaciones perseguían detectar cualquier signo clínico de toxicidad, así como la posible aparición temprana de tumores palpables, animales moribundos y/o mortalidad.
Eutanasia. La eutanasia se practicó a todos los animales que manifestaron deterioro notable de salud, incluida pérdida de peso mayor de un 10 % durante el estudio, para lo cual fueron anestesiados en atmósfera de éter y posteriormente desangrados. Hasta el corte de 18 meses solo se había practicado la eutanasia de nueve animales (cuatro controles y cinco tratados), todos presentaban pérdida de peso y deterioro general y seis de ellos mostraban tumores evidentes al tacto.
Análisis histopatológico
Se realizó la necropsia a todos los animales muertos por eutanasia o espontáneamente, evaluándose in situ la presencia de lesiones macroscópicas en órganos y cavidades. En este reporte se incluyen las observaciones microscópicas de los animales necropsiados y su diagnóstico. Se utilizó la denominación tumores palpables en los animales vivos con tal manifestación, y la de tumores para los confirmados en la necropsia.
El momento de detección de masas o tumores palpables fue la primera fecha en que se registró su detección.
Evidencia temprana de carcinogenicidad asociada al D-004
En este reporte se consideró como una evidencia temprana de carcinogenicidad relacionada con el tratamiento el aumento significativo de la frecuencia de mortalidad, la reducción del tiempo de supervivencia y/o el incremento frecuencia total de tumores (por sexo o en total) de animales tratados con respecto a los controles hasta 18 meses de tratamiento. ]]>
Análisis estadísticoSegún lo establecido, la esencia de este tipo de estudios es el análisis de supervivencia y aparición de tumores. El análisis de supervivencia del estudio total se hará según el modelo de regresión de Cox.
El análisis de las lesiones incluyó la incidencia total de animales con tumores, la incidencia total de tumores y el período de latencia hasta la aparición de tumores.
Las variables continuas (peso corporal y consumo de alimento) se compararon por la prueba de Levene y las diferencias se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA). Si se encontraron efectos significativos, las diferencias se evaluaron por la prueba de Tukey. De no existir homogeneidad de varianza fueron analizadas por la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis.
Por su parte, las variables categóricas se analizaron mediante la prueba de la Probabilidad Exacta de Fisher. Las pruebas utilizadas fueron de doble cola. Un á = 0,05 se asumió a priori para la significación estadística. Los resultados se analizaron con el paquete de programas Statistica para Windows.
RESULTADOS
Análisis de la mortalidad
En los primeros 18 meses de estudio se produjeron 34 muertes (8,5 %), distribuidas como refleja la tabla 1. La eutanasia se practicó en nueve casos los cuales presentaban signos tales como pérdida de peso, reducción del consumo de alimentos, deterioro general, poca respuesta a estímulos, disnea marcada, de los cuales tres tenían lesiones tumorales evidentes al tacto con sangramiento por lo que presentaban mucosas pálidas y debilidad. ]]>
La mortalidad se comportó de modo similar en los grupos tratados y controles en ambos sexos: nueve muertes (9,0 %) ocurrieron en ratas controles (seis hembras, tres machos), nueve (8,3 %) en ratas tratadas con 500 mg/kg (siete hembras, dos machos), cuatro en las tratadas con 1000 mg/kg (tres hembras, un macho) y 12 en las tratadas con 1 500 mg/kg (siete hembras, cinco machos).La primera muerte ocurrió en un macho control pasados los 10 meses de tratamiento. La comparación entre grupos de las frecuencias de mortalidad hasta los 18 meses de tratamiento por sexo y total no revelaron diferencias significativas entre los grupos tratados y el control.
Un análisis de supervivencia, revela que la mortalidad y el tiempo de supervivencia en los animales tratados y los controles tuvieron un comportamiento similar. Un análisis por sexo reveló un comportamiento similar, sin diferencias entre animales tratados y controles (tabla 1).
Signos de toxicidad
Las observaciones diarias no revelaron signos de toxicidad, esta se evidenció en animales de ambos sexos y de todos los grupos, relacionándose con eventos aislados de lesiones por mordeduras, cambio en las deposiciones, lesiones en las extremidades inferiores, alopecia y tumores evidentes al tacto en los animales que murieron o se sacrificaron antes de los 18 meses, así como en algunos que aún permanecen en estudio.
La tabla 2 resume las lesiones evidentes al tacto presentes al culminar los 18 meses de tratamiento en animales que aún continúan en el estudio.
Se detectaron lesiones nodulares palpables, presumiblemente de tipo tumoral, en 63 animales que continúan en estudio: 51 hembras y 12 machos. En las hembras se observan lesiones nodulares, fundamentalmente en las mamas, en animales de todos los grupos (20 controles, nueve de 500 mg/kg, 11 de 1 000 mg/kg y 11 de 1 500 mg/kg), mientras que en los machos las lesiones nodulares se detectaron fundamentalmente asociadas al tejido celular subcutáneo, y también se localizaron en animales de todos los grupos (seis controles, dos de 500 mg/kg, dos de 1 000 mg/kg y tres de 1 500 mg/kg). El tiempo de aparición de estas lesiones nodulares fue similar entre animales tratados y controles (tabla 2).
Peso corporal y consumo de alimento
La tabla 3 muestra los datos de peso corporal, evidenciándose que no hubo diferencias significativas entre tratados y controles, ni tendencias con las dosis en ninguno de los sexos y un mayor aumento de estas variables en los machos que en las hembras.
Consistente con lo referido sobre la ganancia en peso, el consumo de alimentos en ambos sexos en animales tratados y controles fue similar, si bien el consumo en machos fue mayor que en las hembras. ]]>
Análisis anátomo-patológicoLas tablas 4 y 5 resumen los resultados del análisis microscópico de los animales que murieron antes de los 18 meses de tratamiento, bien espontáneamente o por eutanasia.
Las lesiones histopatológicas observadas fueron muy escasas y en ninguna de las comparaciones realizadas se encontraron diferencias significativas entre tratados y controles.
Entre las lesiones no neoplásicas más frecuentemente observadas durante 18 meses de tratamiento se encuentran la glomerulonefrosis y la hemorragia pulmonar.
La glomerulonefrosis fue diagnosticada en cuatro animales, dos controles (un macho y una hembra) y dos tratados (una hembra de la dosis de 1 000 mg/kg, y un macho de la dosis máxima).
La hemorragia pulmonar solo ocurrió en hembras y, en su mayoría en animales que amanecieron muertos, donde puede aparecer esta lesión debido a autolisis (tabla 4).
Tabla 4. Lesiones histopatológicas no neoplásicas más observadas a los 18 meses de estudio
| ]]> Machos | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ]]> n=50 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ]]> 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| ]]> Adrenales. Peliosis | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |||||||||||||||||||||||||||
| ]]> Hiperplasia cortical | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |||||||||||||||||||||||||||
| Quiste | ]]> 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 1 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||||||||
| ]]> 1 | 0 | 0 | 0 | - | - | - | - | ||||||||||||||||||||||||||||
| 1 | ]]> 0 | 0 | 0 | - | - | - | - | ||||||||||||||||||||||||||||
| - | - | ]]> - | - | 0 | 1 | 1 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| - | - | - | ]]> - | 1 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Pulmones. Inflamación | 1 | ]]> 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| Edema | 0 | 2 | ]]> 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | |||||||||||||||||||||||||||
| Congestión | 0 | 1 | 0 | ]]> 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 1 | 3 | 1 | 1 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 1 | 1 | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 0 | 0 | 0 | 1 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 1 | 0 | 0 | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Total de animales con lesiones | 4 | 6 | 1 | 3 | 1 | ]]> 2 | 1 | 2 | |||||||||||||||||||||||||||
El número de animales con lesiones tumorales que fueron determinantes para la vida de los animales a los 18 meses de tratamiento se puede clasificar como bajo (28/400, 7,0 %), de los cuales ocho (8,0 %) fueron en animales controles. El tumor de mayor prevalencia diagnosticado en los animales que murieron en 18 meses de tratamiento fue el adenoma de hipófisis (lesión benigna) en 12 hembras (tres controles y nueve tratados con D-004: cinco (500 mg/kg), uno (1 000 mg/kg) y tres (1 500 mg/kg) y dos machos (control y 1 000 mg/kg). Ocurrieron en muy baja frecuencia otras lesiones neoplásicas benignas como: fibroma de tejido celular subcutáneo, fibroadenoma de glándulas mamarias, pólipo endometrial y angioma hepático (tabla 5).
Tabla 5. Lesiones histopatológicas neoplásicas observadas a los 18 meses de estudio
| ]]> Control | |||||||||
| ]]> n=50 | |||||||||
| Tejido Celular Subcutáneo | |||||||||
| Histiocitoma fibroso | ]]> 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Fibroma | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |||
| Glándula Pituitaria. Adenoma | 3 | 5 | ]]> 1 | 3 | 1 | 0 | 1 | 0 | |
| Glándulas Mamarias Fibroadenoma | 2 | ]]> 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| Útero. Pólipo Endometrial | 0 | 0 | 0 | ]]> 1 | - | - | - | - | |
| Hígado. Angioma | 1 | 0 | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Total de animales con lesiones | 3 | 5 | 3 | 6 | ]]> 1 | 0 | 1 | 1 | |
| Malignas | |||||||||
| Sarcoma quístico | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | |||
| Glándulas Mamarias. Adenocarcinoma | 0 | ]]> 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 0 | ]]> 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | ||||
| Linfosarcoma | 1 | 0 | 0 | 0 | ]]> 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Total de animales con lesiones | 2 | 3 | 0 | 2 | 2 | ]]> 0 | 0 | 3 | |
Dentro de las lesiones neoplásicas malignas observadas, la de mayor frecuencia fue el adenocarcinoma de glándulas mamarias que fue diagnosticado en seis hembras: un control y cinco tratados (tres hembras de la dosis de 500 mg/kg, y dos de la dosis máxima). También se observó en menor frecuencia el histiocitoma maligno, el sarcoma quístico y el linfosarcoma (tabla 5).
DISCUSIÓN
Este constituye el primer reporte de la administración del D-004 a ratas SD por un período superior a los 12 meses. Durante 18 meses de tratamiento no existen evidencias de carcinogenicidad y/o toxicidad asociada al D-004 en ratas SD. Teniendo en cuenta que la dosis más alta evaluada (1 500 mg/kg) es la dosis límite propuesta para estos estudios, 36 y que esta dosis es mucho mayor de la mínima a la cual se observan efectos farmacológicos, debe descartarse la inadecuada selección de las dosis de D-004 empleadas como la causa de la falta de de toxicidad/carcinogenicidad aquí reportada.
Los resultados recopilados hasta este momento de la investigación, muestran que la frecuencia de mortalidad ha sido baja (8,5 %), lo que es una evidencia indirecta de que las condiciones de desarrollo del estudio han sido adecuadas. Además corroboran la baja toxicidad tras dosis repetidas por largo plazo (18 meses) del D-004, ya que no se produjeron muertes atribuibles al tratamiento, resultados que son consistentes con los obtenidos en el estudio crónico de 1 año en ratas tratadas con dosis de hasta 2 000 mg/kg, y con otros estudios toxicológicos previos en roedores y no roedores.18-21 ]]>
Las primeras muertes ocurrieron en animales con presencia de lesiones tumorales, en una etapa muy próxima al año de iniciado el estudio donde es normal que aumente la mortalidad y también comiencen a manifestarse espontáneamente la aparición de lesiones neoplásicas (benignas y malignas) en esta especie y línea.37,38El análisis de supervivencia no mostró diferencias significativas entre los grupos, demostrando que el tratamiento con D-004 no induce mortalidad temprana con respecto al grupo control, y la frecuencia de lesiones tumorales resultó baja y consistente con esta especie y línea, de acuerdo con los resultados de estudios toxicológicos previos, de otros autores y de los propios reportes históricos.39-42
Así, luego de 18 meses de estudio, no se han observado signos de toxicidad atribuibles al tratamiento, incluyendo la ganancia de peso corporal y el consumo de alimentos en ambos sexos, y ningún grupo mostró reducciones de peso corporal e»10 % al compararse con el grupo control, descartando que el D-004 afecte el peso corporal. El hecho de que el incremento en el peso corporal fue mayor en los machos que en las hembras, es consistente con resultados previos de nuestro grupo en esta especie,40-42 evidenciando también que las condiciones del estudio han sido adecuadas.
Este estudio hasta el momento, demuestra que el D-004 no aumenta la frecuencia o acelera la ocurrencia de tumores benignos o malignos, comportándose muy similar la frecuencia de tumores entre los grupos tratados y control.
El adenoma de hipófisis que fue el tumor más diagnosticado, es una lesión benigna muy común en ratas de esta especie y edad, siendo más frecuente en hembras que en machos.37, 38, 43
Otras lesiones neoplásicas benignas como: fibroma de tejido celular subcutáneo, fibroadenoma de glándulas mamarias, pólipo endometrial y angioma hepático que han sido descritas como espontáneas,37, 38 ocurrieron en muy baja frecuencia.
La lesión neoplásica maligna de mayor frecuencia fue el adenocarcinoma de glándulas mamarias, consistente con otros reportes.37, 38, 44,45 También se observó en menor frecuencia el histiocitoma maligno, el sarcoma quístico y el linfosarcoma.
Estos hallazgos no son sorprendentes ya que el histiocitoma maligno es un tumor del tejido celular subcutáneo que aparece espontáneamente en ratas Sprague Dawley de esta edad, y ha sido reportado con una frecuencia similar a la obtenida en este estudio, entre un 0,9-5 % en machos y entre un 1,4-2 % en hembras, igual ha sido descrito para el linfosarcoma y el sarcoma indiferenciado (quístico) en ratas SD de esta edad los cuales han sido reportados con una baja frecuencia.38, 46
Llama la atención que no se presentaron tumores malignos en el grupo tratado con la dosis de 1 000 mg/kg y en los machos tratados con 500 mg/kg, lo que no resultó significativo debido a la baja frecuencia ocurrida en el grupo control. Tampoco se observaron en animales tratados lesiones poco comunes en esta especie y línea.
Todas las neoplasias encontradas en animales tratados han sido descritas en esta especie y línea38, 46, y en ningún caso su aparición ha sido asociada con la acción de agentes inductores específicos. ]]>
Se puede afirmar que según los resultados obtenidos en este primer corte, la administración de D-004 en dosis de 500 1500 mg/kg, a ratas SD durante 18 meses, no mostró evidencias de toxicidad o carcinogenicidad temprana relacionadas con el tratamiento. Se continúa el estudio con buenas perspectivas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Abdollah F, Briganti A, Suardi N, Castiglione F, Gallina A, Capitanio U, et al. Metabolic syndrome and Benign Prostatic Hyperplasia: Evidence of a potential relationship, hypothesized etiology, and prevention. Korean J Urol. 2011;52:507-16.
2. Schwinn DA, Roehrborn CG. Alpha1-adrenoceptor subtypes and lower urinary tract symptoms. Int J Urol. 2008;15:193-9.
3. Schmidt LJ, Tindall DJ. Steroid 5á-reductase inhibitors targeting BPH and prostate cancer. J Steroid Biochem Mol Biol. 2011;125:32-8. ]]>
4. Azimi H, Khakshur AA, Aghdasi I, Fallah-Tafti M, Abdollahi M. A review of animal and human studies for management of benign prostatic hyperplasia with natural products;:perspective of new pharmacological agents. Inflammation & Allergy-Drug Targets. 2012;11:207-21.
5. Abe M, Ito Y, Oyunzul L, Oki-Fujino T, Yamada S. Pharmacologicall Pharmacologically Relevant receptor Binding Characteristcs and 5a- reductasa reductase inhibitory activity of free fatty acids contained in Saw Palmetto Extract. Biol Pharm Bull. 2009,32(4):646-50.
6. Raman P, David L, DeWitt G, Muraleedharan G. Lipid peroxidation and cyclooxygenase enzyme inhibitory activities of acidic aqueous extracts of some dietary supplements. Phytotherapy Res. 2007;22(2):204-12.
7. Baron A, Mancini M, Caldwell E, Cabrelle A, Bernardi P, Pagano F. Serenoa repens extract targets mitochondria and activates the intrinsic apoptotic pathway in human prostate cancer cells. BJU Int. 2009;103(9):1275-83.
8. Arruzazabala ML, Molina V, Carbajal D, et al. Composition changes of lipid extract of Roystonea regia fruits of different ripening stages influence their effects on testosterone-induced prostate enlargement in rats. Lat. Am. J. Pharm. 2008, 27(1): 41-5. ]]>
9. Arruzazabala ML, Carbajal D, Mas R, et al. Preventive effects of D-004, a lipid extract from Cuban royal palm (Roystonea regia) fruits, on prostate hyperplasia induced with testosterone on intact and castrated rodents. Drugs Exptl Clin Res. 2004;30:227-34.
10. Carbajal D, Arruzazabala ML, Mas R. y otros. et al. Effect of D-004, a lipid extract from Cuban royal palm fruit, on inhibiting prostate hyperplasia induced with testosterone and dihydrotestosterone in rats. Curr Ther Res Clin & Exptl. 2004;65: 505-14.
11. Noa M. Arruzazabala ML, Carbajal, D, et al. Effect of D-004, a lipid extract from Cuban royal palm fruit, on histological changes of prostate hyperplasia induced with testosterone in rats. Int J Tiss React. 2005;27:20312.
12. Arruzazabala ML, Mas R, Carbajal D, Molina V. Effect of D-004, a lipid extract from Cuban royal palm fruit, on in vitro and in vivo effects mediated by á adrenoceptors in rat. s. Drugs R & D. 2005;6:281-289.
13. Arruzazabala ML, Mas R, Molina V, Noa M, Carbajal D, Mendoza N. Effects of D-004, a lipid extract from the Cuban royal palm fruit on atypical prostate hyperplasia induced by phenylephrine in rats. Drugs R &D. 2006;7:233-241.
14. Ravelo Y, Molina V, Jiménez S, Oyarzábal A, Pérez Y, Mas R. Effect of oral administration of D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, on xylene-induced ear oedema in mice, Lat Am J Phar. 2011;30(9):1744-8.
15. Pérez Y, Molina V, Mas R, Menéndez R, González RM, Oyarzábal A, et al. Ex vivo antioxidant effects of D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, on rat prostate tissue. Asian J Androl. 2008;10:659-66.
16. Lopez E, Molina V, Illnait J, Oyarzábal A, Fernández L, Mas R, et al. Antioxidant effects of D-004, a lipid extract from the Roystonea regia fruits, on the plasma of healthy men. Asian J Androl. 2007;11:385-92.
17. Gutiérrez A, Gámez R, Más R, Noa M, Pardo B, Goicochea E, Curveco D, García H. Toxicología aguda del D-004 en conejos. Rev. CENIC Cien. Biol. 2007;38(2): 99-102.
18. Gámez R, Mas R, Noa M, Menéndez R, García H, Rodríguez Y, et al. Oral acute and subchronic toxicity of D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, in rats. Drugs Exp Clin Res. 2005;31(3):101-8.
19. Gutiérrez A, Gámez R, Mas R, Noa M, Pardo B, Marrero G, et al. Oral subchronic toxicity of a lipid extract from Roystonea regia fruits, in mice. Drug Chem Toxicol. 2008;31:217-228.
20. Gutiérrez A, Gámez R, Mas R, Noa M, Pardo B, Marrero G, et al. Six-Month oral Toxicity of D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, in Sprague Dawley rats: a preliminary study. Rev CNIC Cien Biol. 2009;40(3): 161-165.
21. Gutiérrez A, Gámez R, Noa M, Mas R, Arencibia D, Pardo B, et al. One year oral Toxicity of D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, in Sprague Dawley rats. Food Chem Tox. 2011;49: 28552861.
22. Gutiérrez A, Marrero G, Gámez R, Fernández I, Curveco D y García H. Evaluación del D-004 en el Ensayo de Ames por incorporación directa a placa. Rev CENIC Cien Biol. 2005;36 (Especial).
23. Marrero G, Gutiérrez A, Pardo B, Gámez R y Curveco D. Evaluación del efecto genotóxico del D-004 en ratones NMRI empleando la electroforesis alcalina de células individuales en gel (Ensayo cometa). Rev. CNIC Cien. Biol. 2007;38 (3) 200-203.
24. Fernández I, Gámez R, Gutiérrez A y García H. Evaluación Genotóxica in vivo del D-004 en el Ensayo de Micronúcleos en Médula Ósea en Ratones. Rev CENIC Cien Biol. 2005;36 (Especial). ]]>
25. Gutiérrez A, Gámez R, Arencibia D, Pardo B y García H. Evaluación del potencial genotóxico del D-004, para inducir aberraciones cromosómicas en médula ósea de ratones. Rev CENIC Cien Biol. 2010;41 (Especial).
26. Arencibia DF, Gámez R, Gutiérrez A, Pardo B, Curveco D, García H y otros., et al. Evaluación Genotóxica del D-004 en el ensayo de la morfología de la cabeza del espermatozoide en ratas Sprague Dawley. Rev Toxicol. 2009;26:127-130.
27. Arencibia D, Gámez R, Gutiérrez A, Pardo B, Noa M, Mas R, y otros. et al. Evaluación Genotóxica del D-004 en el Ensayo de la Morfología de la Cabeza del Espermatozoide en Ratones OF-1. Rev. CNIC Cien Biol. 2009;40(1):29-32.
28. Pardo B, Gutiérrez A, Gámez R, Mendoza S, Noa M, Mas R, y otros. et al. Estudio de los posibles efectos estrogénicos del D-004. Rev CENIC Cien Biol. 2007;38 (2):103-6.
29. Gutiérrez A, Gámez R, Noa M, Mas R , Pardo B, Valle M, y otros. et al. Evaluation of D-004 in Mature Ovariectomized Rat Uterotrophic Assays. Lat Am J Pharm. 2008;27(5):710-5.
30. Fernández L, Mas R, Fernández J.C, Mendoza S, Gámez R y Pardo B. Effects of D-004, a Lipid Extract of the Fruit of the Cuban Royal Palm (Roystonea regia) or the Lipidosterolic Extract of Saw Palmetto (Serenoa repens) on the Sexual Activity in Male Rats: a controlled, experimental study. Curr Ther. 2009;69:65-74.
31. Carbajal D, Molina V, Mas R and Arruzazabala M.L. Efecto del D-004 sobre patrones conductuales en roedores. Rev CNIC. 2007;38:12-7.
32. Gutiérrez A, Pardo B, Gámez R, Mas R, Noa M, Marrero G, y otros. et al. Effects of in utero exposure to D-004, a lipid extract from Roystonea regia fruits, in the male rat. Comparison with Finasteride. J Med Food. 2011;14(12):16639.
33. Gutiérrez A, Gámez R, Mas R, García H, Bucarano I, Goicochea E. Estudio teratogénico del D-004 en conejos. Rev Cub Toxicol. 2012;1(2). (es digital)
34. Sierra R, Rodríguez E, González V, Marrero D, Vicente R. Estudios preliminares de estabilidad de un extracto lipídico de frutos de Roystonea regia (D-004) en frascos de vidrio ámbar. Rev Cub Farm. 2010;44(3):360-6.
35. Sierra R, Rodríguez EA, Vicente R, Marrero D, González VL, Morales CL. Metodología analítica y estudio de estabilidad de las emulsiones empleadas en los estudios de toxicología preclínica del D-004, sustancia de naturaleza oleosa. Rev Cub Toxicol. [Consultado: 15 de abril de 2012] ;1(2). Disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/anu/vol1_2_12/tox03212.htm
36. US Department of Health and Human Services, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guideline for Industry: S1C(R) Addendum to Dose Selection for carcinogenicity studies of pharmaceuticals. Addition of a limit dose and related notes. ICH. 1997,S1A.
37. Nakazawa M, Tawaratani T, Uchimoto H, y colaboradores. Spontaneous neoplastic lesions in aged Sprague-Dawley rats. Exp Anim. 2001;50:99-103.
38. Giknis MLA, Clifford Ch B. Compilation of spontaneous neoplastic lesions in survival in Crl:CD (SD) rats from control groups. Charles River Laboratories. 2004.
39. Keenan K.P., Smith P.F., Hertzog P., et al. The effects of overfeeding and dietary restriction on Sprague-Dawley rat survival and early pathology biomarkers of aging. Toxicol Pathol. 1994;22:300-15.
40. Alemán CL, Mas RM, Rodeiro I, Noa M, Hernández C, Menéndez R y colaboradores. Reference database of the main physiological parameters in SpragueDawley rats from 6 to 32 months. Lab Anim. 1998;32:457-66.
41. Alemán CL, Mas R, Noa M, Rodeiro I, Hernández C, Capote A. Carcinogenicity of policosanol in Sprague Dawley rats: a 24 months study. Teratogenesis, Carcinogenesis and Mutagenesis. 1994;14:239-49.
42. Gámez R, Noa M, Mas R, Mendoza N, Pardo B, Menéndez R y colaboradores. Long-term carcinogenicity of D-003, a mixture of high molecular weight acids from sugarcane wax, in Sprague Dawley rats: a 24 months study. Food Chem Tox. 2007;45:2352-8.
43. Johnson MD, Gad SC. The rat. In: Gad SC, ed. Animal models in toxicology. Boca Raton, FL: CRC Press. 2007;147-275.
44. Durbin PW, Williams MH, Jeung N, Arnold JS. Development of spontaneous mammary tumors over the life-span of the female Charles River (Sprague-Dawley) rat: the influence of ovariectomy, thyroidectomy, and adrenalectomy-ovariectomy. Cancer Res. 1966;26(3):400-11.
45. Chandra M, Frith CF. Spontaneous neoplasms in aged control Fischer 344 rats. Cancer Lett. 1992;62(1):49-56.
46. Peckham JC. Animal Histopathology. In: Derelanko MJ, Hollinger MA, editors. Handbook of Toxicology. Boca Raton, FL: CRC Press. 2002;640-732.
Recibido: 17 de mayo de 2012.
Aprobado: 18 de julio de 2012.
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Dra C. Ariadne Gutiérrez Martínez. Departamento de Toxicología. Centro de Productos Naturales. Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Apartado Postal 6990, Ave 198 entre 19 y 21. Cubanacán, Playa, Cuba. Correo elctrónico: ariadne.gutierrez@cnic.edu.cu ]]>
