Reacción en cadena de la polimerasa
Chain reaction of Polymerase
Dr. Andrés Pedrosa Amado
Instituto Superior de Ciencias Médicas de Camagüey. Dpto. de Bioquímica.Camagüey,Cuba.
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RESUMEN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una novedad técnica que permite la síntesis in vitro de millones de copias de un segmento específico del ADN. Su alta especificidad y sensibilidad han hecho de esta sencilla, pero ingeniosa metodología una herramienta que ha evolucionado el análisis y la manipulación del material genético. Actualmente la aplicación de artículos científicos donde se refiere la utilización de esta técnica es exponencial, por ello se hace esta revisión con el objetivo de informar al lector sobre los principios de este procedimiento, los requerimientos de laboratorio para su realización, sus posibles aplicaciones y sus ventajas. Para ello se revisaron 46 documentos. Una poderosa herramienta de investigación ha surgido, su aplicación en diferentes campos del conocimiento científico sitúan a la Reacción en Cadenas de la Polimerasa como el factor fundamental que explica el actual desarrollo alcanzado en el análisis y manipulación del material genético en animales y plantas.
DeCS: REACCIÓN EN CADENA POR POLIMERASA.
ABSTRACT
The chain reaction of polymerase is a new technique which allows the in vitro synthesis of million of copies of one specific segment of DNA. Its high specificity and sensitivity have made of this simple but ingenious methodology a tool that has improved the analysis and handling of the genetic material. At present, the emergence of scientific works has increased? they refer to the use of this technique, that's why this review is made with the objective of informing the reader about the principles of this procedure, laboratory requirements for its use, its possible applications and its adventages. For this, 46 bibliographic citations were reviewed. A powerful research tool has been created, its use in different fields of the scientific knowledge places the chain reaction of polymerase as the main factor that explains the current development reached in the analysis and handling of the genetic material in animals and plants.
DeCS: POLYMERASE CHAIN REACTION.
INTRODUCCIÓN
]]> Desde la aparición de la técnica de Southern Blot en 19751 se han experimentado notables progresos en la detección de fragmentos específicos de ácidos nucleicos. La identificación y caracterización de estos fragmentos constituyen un procedimiento central en una gran cantidad de experimentos relacionados con la biología molecular.2,3 Sin embargo? estas técnicas, utilizadas hasta el momento, carecían de la especificidad y la sensibilidad que requieren estos procesos de identificación y caracterización, haciéndose difícil la detección de copias únicas de genes presentes en una muestra o la discriminación entre un gen salvaje y uno mutante.La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Polymerase Chain Reaction), creada y desarrollada por Millis y col. de la Cetus Corporation,4 ha devenido una poderosa herramienta que cumple con los requisitos de especificidad y sensibilidad que exigen la caracterización de los ácidos nucleicos, pudiendo detectar con ella de forma fácil la presencia de estas biomoléculas en una muestra, aún cuando sus cantidades se enmarcan en el orden de los picogramos.5,6 La PCR es un método enzimático in vitro que permite la amplificación de una secuencia específica del ADN.
Esta técnica se basa en el uso de dos oligonucleótidos que luego de reconocer la secuencia complementaria en la molécula de ADN, son alargados cíclicamente mediado por la acción de la ADN Polimerasa. Cada ciclo de la técnica generalmente 20 ó 30 en total, implica la desnaturalización del ADN, el apareamiento de los oligonucleóticos y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir del oligonucleótido, lo que resulta en un crecimiento exponencial de millones de copias del fragmento seleccionado.7 La reacción de síntesis es catalizada por una ADN Polimerasa termoestable, obtenida del Thermus aquaticus.8
En menos de una hora de actividades enzimáticas se generan microgramos del fragmento de ADN de interés, a partir de una copia única existente en la muestra. La especificidad de esta reacción se mantiene aún cuando en la muestra original existe una mezcla compleja de ácidos nucleicos, permitiendo así manipular en el laboratorio cantidades muy limitadas de material genético.
Esta técnica ha disminuido el tiempo de trabajo requerido para producir suficiente material de experimentación, comparado con el tiempo empleado cuando se utilizan los métodos tradicionales de amplificación biológica. En todos aquellos procedimientos donde se necesita el aislamiento y purificación del ácido nucleico, se hace más fácil el trabajo cuando aplicamos la técnica de PCR, ya que el fragmento de interés es el que prevalece en la muestra.
La existencia del Proyecto Genoma 2000 permitirá al mundo científico del nuevo siglo tener un mapa genético del hombre. Tanto en la ejecución de este proyecto como en su aplicación práctica es fundamental la técnica de PCR.
La aparición de un número cada vez mayor de artículos científicos donde se refiere la técnica de PCR motivó la realización de esta revisión con el objetivo de informar al lector sobre los principios de la misma, sus múltiples aplicaciones en diferentes campos del conocimiento científico, así como informar sobre otros aspectos que permiten comprender y aplicar este procedimiento con mayor facilidad.
ORIGEN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Este novedoso y revolucionario proceso fue ideado en 1985 por Karry B. Mullis, un investigador de la Cetus Corporation, en Emerville, California. Ese mismo año otros investigadores del grupo de Mullis perfeccionaron la técnica y la aplicaron al diagnóstico clínico de la anemia de células falciformes.9 Desde entonces la aparición de artículos que tratan sobre aplicaciones de esta metodología en diferentes áreas de la biomedicina ha sido exponencial, también la nueva tecnología ha tenido su efecto en bola de nieve sobre el avance del conocimiento científico de otras disciplinas como la criminalística y la paleontología, así como en el estudio de la evolución y de las plantas.10
Los primeros ensayos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realizaron en forma manual, utilizando para la amplificación al fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de la bacteria E. coli, los cambios de temperatura que exigen cada paso en los diferentes ciclos se lograban utilizando varios baños de agua a la temperatura deseada. Luego de cada paso de desnaturalización era necesario añadir nueva cantidad de enzimas que reemplazara a la incluida inicialmente, ya que la alta temperatura requerida en este paso la inactivaba, con la nueva adición de enzimas. También se incluían en la muestra otras sustancias que acompañaban a la preparación enzimática (Glicerol) y que al final terminaban inhibiendo la enzima lo que limitaba la eficiencia catalítica de la ADN polimerasa I.4 Todo esto hacía el proceso costoso, muy laborioso y complejo además de ser poco eficiente.
]]> INTRODUCCIÓN DE LA Taq POLIMERASALos problemas que se presentan con el uso del fragemento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, se superaron cuando aparece la ADN polimerasa termoestable Taq. Esta enzima fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus, que habita en aguas termales y que tienen una temperatura óptima alrededor de los 90°C. Esta enzima al igual que la ADN polimerasa de E. coli, tiene tres centros activos en su cadena polipeptídica única, cada uno claramente separado del otro. Existe un centro con actividad ADN Polimerasa 5´ a 3´, otro con actividad exonucleasa (correctora de prueba) 3´ a 5´ y que desempeña una importante función en la polimerización al eliminar bases no complementarias.
Por último muestra actividad exonucleasa 5´ a 3´ que completa la actividad 3´ a 5´ exonucleasa, pero que es totalmente diferente a ésta y se produce por ruptura de un enlace fosfodiester terminal o en un enlace alejado del extremo 5´ que se encuentre o no en una zona de doble hélices. Su índice de error de incorporación es de 1 en 4 x 10 bases y amplifica segmentos de hasta 3000 pb.
PROTOCOLO DE REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA
No podemos referir un protocolo único que permita el montaje de esta técnica en el laboratorio, ya que diferentes compañías anuncian en sus revistas especializadas estuches comerciales de aplicación en el diagnóstico o la investigación, donde se describe la técnica con especificaciones de tiempo, temperatura y número de ciclos.
Como puede verse todos los parámetros cambian según el fabricante, pero de forma general todos los protocolos descritos cumplen con un procedimiento de tres pasos en cada ciclo, estos son: Desnaturalización, Alineamiento y extensión.
A continuación se describe en qué consiste cada uno de ellos.
Desnaturalización: Aquí se separan o desnaturalizan las dos cadenas complementarias del ADN blanco, esto se logra aumentando la temperatura de la reacción 9298°C durante un tiempo que va de 30 a 90 segundos.
Alineamiento: Consiste en el apareamiento específico entre los fragmentos iniciadores (oligonucleótidos) y las cadenas simples del ADN desnaturalizado, para ello se disminuye la temperatura de la reacción hasta 50 ó 60ºC. Este paso tiene una duración de 30 a 60 segundos.
Extensión: En este paso la ADN polimerasa extiende la longitud de los fragmentos iniciadores que se encuentran unidos al ADN blanco, originando nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas del ADN desnaturalizado presente al inicio de la reacción debe aumentarse hasta 70 ó 74°C. Esta etapa tiene una duración promedio de 30 a 90 segundos.
]]> El próximo ciclo se inicia en el mismo tubo, con los mismos componentes de la mezcla de reacción que se han puesto en cantidad suficiente desde el primer ciclo, solo que ahora existe el doble de cadenas sencillas de ADN blanco a copiar.REQUERIMIENTOS PARA EL MONTAJE DE LA TÉCNICA.
Si se desea poner en marcha esta tecnología, el laboratorio debe contar con los equipos que se relacionan en el ANEXO III, donde no solo se incluyen los equipos y materiales necesarios para realizar la PCR, sino también los necesarios para el análisis del producto amplificado.
Generalmente estos equipos, materiales y reactivos que se citan, se encuentran disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Algunos son específicos para la PCR, como lo es el termociclador. Este equipo se introduce luego que aparece la ADN polimerasa Taq? que es un equipo automatizado, programable donde se ajusta la temperatura y el tiempo que exige el protocolo para cada ciclo. Esto permite realizar el proceso en un solo tubo al que no hay que adicionar ningún reactivo durante el tiempo que dure la PCR. Su introducción ha significado la técnica que en sus inicios requería de la utilización de diferentes baños de agua a diferentes temperaturas, se ha acortado el tiempo a utilizar en la misma y se logra una alta especificidad.
ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LA PCR
La PCR es altamente específica. Solo las secuencias de ADN que se amplifican son aquellas que se encuentran entre los dos fragmentos iniciadores que han hibridizado. Un gen presente en una muestra donde el mismo constituya una parte de millón del total del material genético que se analiza, es accesible por PCR. La PCR es exquisitamente sensitiva. Una única molécula de ADN en una muestra puede ser detectada y amplificada.4-7
APLICACIONES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
La secuenciación y clonaje del ADN han sido grandemente simplificados con la introducción de esta técnica, lo que a su vez ha favorecido la tecnología del ADN recombinante.
En medicina su valor diagnóstico es amplio. La detección de bacterias y virus es posible si se utilizan los segmentos iniciadores necesarios. Mediante PCR se puede revelar la presencia del HIV1 en individuos que no muestran una respuesta inmunológica eficiente ante este agente y que pueden pasar como no infectados cuando se utilizan las técnicas de inmunodiagnóstico rutinarias. La búsqueda del Mycobacterium tuberculosis en tejidos es lenta y laboriosa, con la PCR la presencia de tan solo 10 bacilos por millón de células humanas, puede ser detectada.
El PCR constituye un método promisorio en el diagnóstico precoz de determinados tipos de cáncer. Esta técnica permite determinar la mutación de determinado gen controlador del crecimiento celular, por ejemplo los RAS, genes involucrados en la transformación cancerosa. Monitorear la quimioterapia del cáncer es otra posibilidad que nos da la técnica, resultando ideal detener el tratamiento cuando las células cancerosas han desaparecido o reiniciarlo cuando aparecen las recidivas.
]]> En el diagnóstico prenatal, la aparición de nuevos métodos diagnósticos que utilizan la PCR permiten identificar individuos enfermos. El transplante de órganos se facilita cuando por la PCR se hace un estudio del HLA (Human Leucocit Antigen) del donante y del receptor.En medicina legal su aplicación es amplia. El repertorio genético de un individuo es altamente distintivo. La amplificación de múltiples genes puede esclarecer el grado de parentesco entre dos individuos o su procedencia racial.
El análisis de la sangre o semen de un individuo por PCR puede ser valioso en caso de asaltos y violaciones. Los restos celulares presentes en una colilla o un cabello presente en la escena del crimen, pueden donar suficiente material genético como para llegar al autor.
La técnica ha tenido gran impacto en la reconstrucción del material genético fósil. Se ha podido amplificar material genético proveniente de momias con más de 2 400 años, así como otros restos fósiles de hasta 7 500 años. El más antiguo de los ADN analizados por PCR es el correspondiente a una termita fósil, embalsamada en ámbar que tiene una edad entre 25 y 30 millones de años. El estudio de plantas fósiles también es posible con esta técnica.
CONCLUSIONES
La Reacción en Cadenas de la Polimerasa, como nueva tecnología, ha revolucionado el avance del conocimiento científico en los últimos años. Su efecto "bola de nieve" se hace notar en diferentes áreas de la biología, la medicina, la criminalística, la paleontología, la botánica, el estudio de la evolución, entre otras. En todas estas, la manipulación del material genético ha permitido notables avances en la obtención de nuevos conocimientos y el surgimiento de métodos investigativos y de diagnóstico sin precedentes por su especificidad y sensibilidad que han permitido al hombre conocer y explicar de forma más precisa el funcionamiento celular y por tanto conocer y controlar las causas de los trastornos que a este nivel se experimentan.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. Maxam AM. A new method for sequencing DNA. Natl Acad Sci 1977;74:560564.
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9. Saiki RK. Enzymatic amplification of Bglobin genomic sequence and restriction site analisis for sickle cell anemia. Science 1985;230:13501354.
10. Eisenstein BI. The Polymerase Chain Reaction. A new method for using molecular genetics for medical diagnosis. New Engl Med 1990;322:178183.
]]> Dr.Andrés Pedrosa Amado. Lic en Bioquímica Clínica. Profesor Asistente del Dpto de Bioquímica. Instituto Superior de Ciencias Médicas de Camagüey. Camagüey, Cuba.