Estrategia de verificación de calidad de las cepas de Escherichia coli conservadas en la Colección del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
Strategy to verify quality of Escherichia coli strains kept in the collection of the Center of Genetic Engineering and Biotechnology.
Diliana Celeste Pérez-Reytor*, Iveldris Domínguez-Vázquez, Evelyn Olano-Ruiz, Angela Estela Sosa-Espinosa**
Laboratorio Colección de Microorganismos de Interés Biotecnológico. Departamento de Seguridad y Ambiente. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB). A.P. 6162, Cubanacán, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.
* Licenciada en Microbiología; Master en Ciencias Bioquímicas en la mención de Biología Molecular; Aspirante a investigador.
** Licenciada en Ciencias Biológicas; Master en Microbiología; Investigador auxiliar. Profesor adjunto. ]]>
email: angela.sosa@cigb.edu.cu
RESUMEN
La colección de microorganismos de interés biotecnológico del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología incluye diferentes cepas de bacterias y levaduras utilizables en la manipulación de genes mediante el empleo de la ingeniería genética y para la producción de proteínas recombinantes por métodos biotecnológicos. La colección de hospederos de Escherichia coli centraliza todas las cepas que se utilizan en los proyectos de investigación-desarrollo de la institución. Este microorganismo constituye una de las herramientas biológicas imprescindibles para el trabajo en ingeniería genética y la investigación molecular. La fidelidad de los resultados experimentales depende en parte de la calidad de los bancos de estas cepas, que está determinada por las condiciones de almacenamiento y las estrategias de evaluación de los mismos. La complejidad del manejo de esta colección está influida en gran medida por el hecho de que en los medios de propagación pueden crecer un gran número de contaminantes ambientales de difícil identificación. Mientras más similar es el contaminante a la cepa de interés, más difícil es lograr bancos puros con una estabilidad confiable para la conservación. En este trabajo se describe cómo se garantiza el control de calidad de los bancos de Escherichia coli. Los métodos y estrategias de verificación que se describen han sido desarrollados en nuestro laboratorio.
Palabras claves: Colección de cultivos, cepas de Escherichia coli, chequeo de pureza, ingeniería genética, investigación molecular.
ABSTRACT ]]>
The Collection of Biotechnological-Interest Microorganisms of the CIGB includes several bacteria and yeast strains used in gene manipulation by means of genetic engineering and the production of recombinant proteins. The E. coli host collection contains all the strains used in the research projects of the institution. This microorganism is an important tool for genetic engineering and molecular research. Accuracy of results depends on the quality of the microorganism banks, which it is determined by the storage conditions and the evaluation strategies of these microorganisms. The complexity of the management of this collection is influenced by the fact that a great number of contaminants may grow in the propagation media and they are difficult to identify. The more similar is the pollutant to the strain of interest, the harder it is to obtain pure banks with reliable stability and conservation. This work describes how quality control is ensured in the E. coli banks. The verification methods and strategies described here have been developed in our laboratory.Keywords: Culture collection, E. coli strains, purity assay, Genetic Engineering, Molecular Research.
INTRODUCCIÓN
Los institutos que se dedican a la manipulación de genes mantienen colecciones de cepas mutantes de Escherichia coli (E. coli) relativamente grandes, que se utilizan en el estudio molecular y como hospederos en la expresión de proteínas recombinantes. Diferentes casas comerciales y colecciones comercializan estos microorganismos, o se obtienen mutantes en el propio laboratorio a partir de cepas de diferentes orígenes. Esta bacteria está ampliamente caracterizada y constituye una de las herramientas biológicas imprescindibles para el trabajo en Ingeniería Genética y la investigación molecular (1).
Adicionalmente, las cepas derivadas de E. coli K12 están clasificadas, desde el punto de vista de la bioseguridad, como el vehículo más seguro para la clonación eficiente y la expresión de proteínas recombinantes. Debido a esto los mutantes que se generan en los laboratorios son comercializados y utilizados en todo el mundo para la expresión de ADN recombinante (2, 3).
Desde la creación del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) en 1986, se establece una colección de cepas de E. coli de diversas procedencias y en las diferentes áreas de trabajo cada investigador mantenía pequeños bancos de las cepas con las que realizaba su investigación. Como consecuencia no había una colección única, por lo que era común que bajo la misma denominación existieran cepas de diferentes orígenes, fuera difícil determinar el número de pases que se habían realizado y existieran diferentes criterios de evaluación de calidad de los bancos.
En el 1999 se centralizaron todas las cepas de E. coli como parte de la Colección Central de Microorganismos de Interés Biotecnológico (CMIB) del CIGB. La complejidad del manejo de esta colección depende en gran medida del hecho de que un gran número de contaminantes ambientales crecen en los medios de propagación de E. coli. Los coliformes contaminantes, provenientes de un fallo en la manipulación son muchas veces indistinguibles de la cepa de interés en los medios convencionales y, por tanto, es más difícil lograr bancos puros (4). Por otra parte, el hecho de que las cepas sean mutantes hace que establecer los requerimientos de conservación y las estrategias de verificación según lo reportado para las cepas de referencia de este microorganismo no sean confiables (5).
En este trabajo nos propusimos implementar una estrategia general para la confección y chequeo de bancos de E. coli que permitiera la caracterización completa de los mismos, estableciéndose los parámetros de calidad específicos según las particularidades del trabajo con estas cepas. ]]>
MATERIALES y MÉTODOSCepas de E. coli
La colección de hospederos de E. coli para el uso en biotecnología incluyó 38 cepas mutantes, de las cuales 33 pertenecen al serotipo K12, cuatro al serotipo B y una al serotipo C. Algunas cepas fueron adquiridas de colecciones reconocidas como: ATCC, New England Biolabs, Promega, Invitrogen, Stratagene y otras depositadas por diferentes investigadores. Las cepas de E. coli con su descripción se muestran en la Tabla 1.
Confección de los bancos primarios y de trabajo
Las bacterias se cultivaron en placas de medio Luria-Bertani (LB) (Triptona 10 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Cloruro de Sodio 10 g/L). De las placas se tomó una colonia y se inoculó en precultivos con 5 mL de LB líquido. Los precultivos se crecieron a 37 ºC con una agitación de 250 r.p.m., durante 12 h. De este cultivo se añadió 1 mL como inóculo a un Erlenmeyer que contenía 100 mL de medio LB y se cultivaron a 37 ºC, con una agitación de 250 r.p.m., durante 6 h.
La biomasa se colectó por centrifugación del cultivo a 3000 r.p.m. durante 10 min. El precipitado de células se disolvió en LB con 15% de glicerol (Caledón) y se distribuyó en alícuotas de 1 mL que se almacenaron a -70 ºC hasta su uso. Este procedimiento se siguió para la confección de todos los Bancos de Células Primarios (BCP). Para la confección de los Bancos de Células de Trabajo (BCT) se tomó un vial del BCP del que se inoculó 100 µL en un precultivo con 5 mL de medio LB y se procedió como se describe para la confección del BCP.
Verificación de la viabilidad de los bancos
Para la verificación de la viabilidad de los bancos se hicieron diluciones seriadas de 10-1 hasta 10-6 en solución salina (NaCl 0,9%) y se sembraron en medio LB, según el método descrito por Pérez-Reytor y colaboradores (6).
Las placas se incubaron a 37 ºC durante 18 h; después de este tiempo se contaron las colonias y se calculó la viabilidad de los bancos. El número de viables se definió como la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC), contadas en cada traza multiplicada por 100 y por dilución para definirlas como UFC/mL. Las especificaciones de calidad de los bancos se definieron para una viabilidad entre 107 y 109 UFC/mL.
Verificación de la estabilidad a la conservación de los mutantes del sistema de reparación SOS ]]>
Para verificar la estabilidad de la cepa HB101 de genotipo recA, con relación al método de conservación, se sembraron 100 µL del BCP en tubos de ensayo que contenían 5 mL de medio LB y se incubaron a 37 ºC, con agitación durante 6 h. Después de este tiempo se hicieron BCT en medio LB con glicerol al 15% y se conservaron a -70 ºC.Un vial de cada banco se descongeló en hielo durante 20 min y, luego de tomar 100 µL de muestra se congeló nuevamente a la temperatura de conservación inicial. De la muestra se hicieron diluciones seriadas hasta 10-6 y se sembraron por el método de traza de dilución (6) en placas que contenían medio LB. Las placas se incubaron a 37 ºC por 16 h. Luego se determinó la viabilidad por conteo directo de las colonias. Estos ciclos de descongelaciones se realizaron ocho veces con un intervalo de 1 h entre ellos. Como control del experimento se empleó la cepa RRI que es isógena para todos los marcadores genéticos y no contiene la mutación recA a la cual se le realizó el mismo procedimiento que se describe para la cepa HB101.
Verificación de la pureza microbiológica mediante crecimiento en placa de medios indicadores
La pureza de los bancos de células se confirmó por siembra en placas Petri sobre superficie de medios agarizados. De cada banco se hicieron diluciones seriadas de 10-1 hasta 106 en solución salina (NaCl 0,9%) y se sembraron por el método trazas de dilución sobre los medios siguientes: LB, Agar Mac Conkey, Agar Eosina Azul de Metileno, Agar Citrato de Simmons y Agar Triptona Soya (7).
Como criterio de pureza microbiológica se tomó la morfología de las colonias y sus habilidades de crecimiento en los diferentes medios de cultivo, así como la homogeneidad de las células por tinción de Gram (4).
Verificación de la identidad de las cepas por confirmación de los fenotipos de vías sintéticas, degradativas y resistencia a antibióticos
A partir de los bancos de cepas se hicieron diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-6 en solución salina (NaCl 0,9 %) y se sembraron por el método traza de dilución en medio LB, al cual se adicionó antibiótico a 25 µg/mL, según el fenotipo de la cepa (6).
En el caso de la verificación de los mutantes auxotróficos se empleó el medio M9 (8), al cual se le adicionó glucosa al 0,2% y el aminoácido o las combinaciones de aminoácidos, según el genotipo de la cepa a verificar.
Para la verificación de los marcadores catabólicos se utilizó el medio M9 suplementado con los aminoácidos de auxotrofía, según la cepa. En una concentración de 0,2% se añadieron los azúcares correspondientes a la mutación catabólica señalada en la descripción de la cepa. En todos los casos se empleó como control positivo de crecimiento medios suplementados con glucosa al 0,2%.
Para la verificación particular de los mutantes catabólicos de las vías degradativas de galactosa y lactosa se utilizó el medio Mac Conkey No. 3 de la casa comercial Biocen. ]]>
Verificación de la identidad de las cepas mediante reacción en cadena de la polimerasaEl ADN cromosomal se purificó según Sambrook (7). Para la cuantificación del ADN se hicieron diluciones seriadas 1/10 de la muestra en agua destilada estéril hasta 10-2. La muestra se evaluó por electroforesis sumergida en un gel de agarosa al 0,8% y se usó un sistema Tampón Tris Borato, con un voltaje constante de 120 V y se reveló con Bromuro de Etidio (10 µg/mL).
El serotipo K12 de E. coli se verificó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Como sonda se emplearon dos oligonucleótidos que son complementarios a una región del orf264 que presenta una secuencia característica de E. coli K12. Un segundo par de oligonucleótidos fueron utilizados, los cuales eran complementarios a una zona típica del serotipo K12 de E. coli, correspondiente al elemento de inserción IS5. Como control positivo se utilizó un tercer par de oligonucleótidos complementario al gen pal que codifica para una lipoproteína asociada al peptidoglicano de la pared celular de la bacteria, el cual es conservado en las enterobacterias (9).
Las reacciones de amplificación fueron diseñadas con los siguientes parámetros: incubación inicial a 94 ºC durante 3 min, seguidas por 35 ciclos a la misma temperatura de incubación, pero de una duración de 30 segundos y una incubación final de 72 ºC durante 1,5 min. Los productos de la RCP se analizaron por electroforesis sumergida en un gel de agarosa al 0,8%; se usó un sistema Tampón Tris Borato, se mantuvo a voltaje constante de 120 V y se visualizó por inmersión del gel, después de la corrida en una solución Tampón que contenía Bromuro de Etidio (10 µg/mL).
RESULTADOS y DISCUSIÓN
La colección de hospederos de E. coli cuenta actualmente con 46 bancos de cepas mutantes que incluyen tanto las que se encontraban conservadas en el Cepario en el momento de creada la colección como otras de nueva incorporación procedentes de los proyectos de investigación desarrollo (Tabla 1). Los bancos de cepas tienen una alta viabilidad (108-109 UFC/mL). Cada banco cuenta con tres réplicas, una de las cuales se mantiene a -20 ºC y otra a -70 ºC. La comparación de la estabilidad de los bancos a dos temperaturas de almacenamiento permite acumular criterios de la influencia de la temperatura de conservación sobre la estabilidad de cada cepa en tiempo real.
Después de la centralización de las colecciones de E. coli de interés biotecnológico se establecieron procedimientos de trabajo únicos para lograr la caracterización de todas las cepas que circulaban en la entidad. Con vistas a homogeneizar los criterios de calidad de los bancos de cepas y su completa caracterización se estableció una estrategia de trabajo única que incluye la verificación de todas las propiedades de las cepas, así como chequeos de pureza, estabilidad genética y viabilidad en tiempo real.
Los bancos se confeccionan y se determina la viabilidad por el método traza de dilución (6). En todos los casos la viabilidad inicial estuvo entre 108 y 109 UFC/mL, lo que cumple con los parámetros de aceptación establecidos según las especificaciones de calidad para el caso de bancos de bacterias.
La diferencia encontrada en cuanto a los valores de viabilidad entre las distintas cepas puede estar determinada por afectaciones en el sistema de reparación SOS, lo que puede disminuir en estos mutantes la capacidad de reparar el daño provocado por la congelación. ]]>
La determinación de la viabilidad de las cepas como un criterio de la estabilidad a la conservación en tiempo real forma parte de los chequeos periódicos que se realizan dentro de la colección. Sin embargo, debido a las diferencias genotípicas que presentan el tiempo mínimo de chequeo debe ser establecido de forma individual.Verificación rápida de la estabilidad a la conservación
Una gran parte de los daños que puede ocasionar el método de conservación a las cepas que son de interés para los experimentos de clonaje y expresión de genes, puede medirse mediante el chequeo periódico del número de viables de los bancos después de conservados.
La periodicidad de estas pruebas depende de la resistencia de las cepas y de su capacidad de reparar el daño mediante su maquinaria genética. Otros autores han encontrado que la conservación por congelación a -70 ºC de las cepas de E. coli puede ser de muchos años, sin que se afecte su viabilidad ni se pierdan las características genotípicas de interés por las cuales las cepas son valiosas (5). Sin embargo, como parte del establecimiento de la colección se determinó de forma rápida el daño sobre dos cepas que solo se diferencian en la mutación recA, lo que imposibilita a una de ellas reparar el daño en el ADN en caso de que este se produzca.
Tabla 1. Cepas de Escherichia coli de la Colección de Microorganismos de interés biotecnológico del CIGB.
La presencia de la mutación recA en la cepa HB101 diferenció la velocidad de recuperación de las cepas en medio sólido después de cada descongelación. Para la cepa RRI se obtuvo crecimiento después de 14 h de incubación a 37 ºC en todos los pases, mientras que la cepa HB101 creció a las 14 h sólo en el primer pase y este tiempo de visualización de las colonias fue haciéndose mayor hasta llegar a ser de 30 h en el octavo ciclo.
Si una condición de almacenamiento no es adecuada o si una cepa es sensible a una condición predeterminada entonces debe esperarse que la disminución de las células viables en el tiempo sea mayor. Al final de los ocho ciclos de descongelaciones sucesivas no encontramos pérdida de la viabilidad con relación al número inicial de viables del banco en las dos cepas comprobadas.
Debido a estas evidencias y de acuerdo con lo reportado en la literatura en cuanto a la resistencia de E. coli a la congelación (10), se estableció que el intervalo de tiempo para el chequeo de la viabilidad en tiempo real se realizara cada dos años a partir de la fecha de confección de los bancos de la colección y de un año para las cepas recA. Como criterio de calidad del banco se tiene en cuenta no solo la comparación de la viabilidad sino también que el tiempo de visualización de las colonias sobre medio sólido no sea mayor de 16 h.
Verificación de la pureza microbiológica de los bancos
Uno de los problemas fundamentales en la conservación está relacionado con la contaminación de los cultivos con microorganismos que tienen características morfológicas y tintoriales similares a la cepa a conservar. Es por ello que el empleo de una estrategia que permita descartar la presencia de contaminantes a bajas concentraciones en el medio de crecimiento permite la obtención de un cultivo puro del microorganismo de interés. ]]>
Tal es el caso de las especies del género Pseudomonas que se encuentran comúnmente en los cultivos cuando hay fallos en la esterilización de los medios. En nuestra estrategia de verificación de pureza estos contaminantes solo se observaron en el medio Citrato de Simmons, donde la E. coli no tiene la habilidad de crecer (4).Las cepas de E. coli de nuestra colección son mutantes que difieren en varios marcadores de sus genotipos, por lo que sus características en los medios de cultivo son diferentes a las reportadas para E. coli salvaje. Teniendo en cuenta esto y la evaluación de los contaminantes frecuentes en el ambiente de laboratorio se diseñó una estrategia de chequeo que incluye: el empleo de los medios indicadores Agar Mac Conkey, Agar Citrato de Simmons, Agar Triptona Soya y Agar Eosina Azul de Metileno y el método de siembra en placa trazas de dilución (6). Esta estrategia dio un criterio de pureza y permitió hacer una diferenciación entre los contaminantes más frecuentes y las cepas de E. coli en una proporción de un contaminante por 109 UFC del microorganismo de interés (4).
La presencia en el cultivo de contaminantes no detectados por el método de verificación de pureza, anteriormente descrito, puede variar los resultados de las investigaciones, tal es el caso de contaminaciones con especies de bacilos que esporulan y se mantienen viables en el medio de cultivo aún en condiciones en que los nutrientes han disminuido pero no proliferan en los medios con concentraciones altas de sales o a temperaturas de 37 ºC. Debido a esto, otro criterio de pureza es el crecimiento en medios de propósito general como el Agar Triptona Soya y a temperatura de crecimiento de 25 ºC durante 24 h, que propicia el crecimiento de bacilos ambientales.
Verificación de fenotipos de vías sintéticas, degradativas y resistencia a antibióticos
En las cepas mutantes de E. coli la verificación de los genotipos descritos es fundamental para garantizar el mantenimiento de los marcadores listados y poder detectar posibles reversiones que puedan afectar los resultados en el proceso investigativo. Todas las cepas de la colección mostraron el resultado esperado en el análisis fenotípico de acuerdo con su genotipo, no encontrándose pérdida de las mutaciones en ninguna de ellas durante la conservación. Esta verificación valida que cada mutante mantiene los marcadores por los cuales ha sido almacenado y que lo hace útil en el trabajo en Biología Molecular.
Reacción en cadena de la polimerasa
Según Pérez-Reytor y colaboradores (4), otros contaminantes reportados son cepas de E. coli salvajes, provenientes del entorno ambiental que pueden ser frecuentemente introducidas como contaminantes en los cultivos y son el resultado de alguna mala manipulación en el momento de la confección de los bancos. Ya que una de las prácticas habituales para la obtención de cultivos puros es partir de una colonia, se corre el riesgo si el cultivo está contaminado con una cepa ambiental de E. coli, de seleccionarla como la cepa de interés.
En el caso de cepas protótrofas son indistinguibles de estos contaminantes por todos los métodos convencionales de verificación de pureza. Debido a esto se emplea la RCP para autentificar el serotipo K12 al cual pertenece la mayor cantidad de cepas de la colección.
Todas las cepas que pertenecen al serotipo K12 amplificaron las tres bandas pertenecientes al gen pal, al elemento de inserción IS5 y al grupo de genes orf24 (Figura 1). Las cepas pertenecientes a los serotipos B y C amplificaron la banda correspondiente al gen pal, característico de las enterobacterias, como muestra la figura donde se comparan los patrones de bandas observados en un gel de electroforesis para E. coli K12, E. coli C, E. coli B y la cepa control E. coli 0157:H7.
La verificación de la mutación típica de las cepas de interés biotecnológicos da un criterio de bioseguridad, ya que garantiza la no patogenicidad de las mismas. El hecho de que la técnica de RCP sea muy sensible no da por sí sola un criterio de pureza pero complementa los criterios de calidad obtenidos por el crecimiento en medios indicadores. ]]>
Estrategia de verificaciónUna vez realizadas las diferentes pruebas a todos los bancos de la colección se estableció una estrategia única de verificación de los bancos que se muestra en la Figura 2. La misma se adoptó para la confección tanto de los BCP como de los BCT que se realizan en el Cepario del CIGB.
Los métodos de chequeo para la verificación de la pureza y la estabilidad genética de las cepas de E. coli de interés biotecnológico posibilitan la caracterización y el chequeo de un gran número de bancos con el empleo de un mínimo de tiempo, manipulación y con criterios únicos de autenticación.
El diseño de estrategias propias desarrolladas en nuestro laboratorio garantiza que las cepas de la colección mantengan los marcadores moleculares que las hacen útil para el trabajo biotecnológico y posibilita que los resultados interlaboratorios sean comparables.
Figura 1. RCP que identifica la presencia de E. coli K12. (1) Patrón de peso molecular HindIII. (2, 3,4) E. coli 0157:H7. (5, 6, 7) E. coli C1A. (8, 9,10) E. coli W3110. (11, 12,13) E. coli BL-21(DE3) La banda de 0,28 kb pertenece al gen pal, la de 0,97 kb pertenece al elemento de inserción IS5 y la de 1,69 kb pertenece a una región del orf24 con una secuencia característica de E. coli K12.
Figura 2. Estrategia general para el chequeo y aprobación de los bancos de cepas de E. coli de la Colección de Microorganismos de interés biotecnológico del CIGB.
REFERENCIAS
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Recibido: Octubre de 2009 ]]>
Aceptado: Diciembre de 2009
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