Implementación de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para la detección de Mycoplasmagenitalium
Implementation of a quantitative-polymerase chain reaction for the detection of Mycoplasma genitalium
Brian Arturo Mondeja-Rodríguez,1* Jørgen Skov-Jensen,2 Nadia María Rodríguez-Preval,1Islay Rodríguez-González,3 Carmen Fernández-Molina1
1Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones sobre Micoplasmas. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”; Avenida Novia del Mediodía Km 6½. P.O. Box: 601. Marianao 13. La Lisa. La Habana. Cuba.
]]> 2Mycoplasma Laboratory, StatensSerumInstitut, DK-2300. Copenhagen S, Denmark.3Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones sobre Espiroquetas. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, Avenida Novia del Mediodía Km 6½. P.O. Box: 601. Marianao 13. La Lisa,La Habana, Cuba.
email:bmondeja@ipk.sld.cu
*Licenciado en Microbiología; MSc Bacteriología-Micología; Aspirante a Investigador.
RESUMEN
El diagnóstico de las infecciones por Mycoplasmagenitalium mediante métodos bacteriológicos tradicionales resulta laborioso y poco práctico. Es por ello que los métodos moleculares basados en la amplificación del ADN se utilizan con fines diagnósticos de infecciones causadas por este microorganismo. En Cuba no existen informes de la implementación y utilización de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para la detección y cuantificación de este patógeno. En este trabajo se implementó una qPCR para la detección y cuantificación de M. genitalium mediante la amplificación de un fragmento del gen mgpB que codifica para la proteína adhesina celular, mediante la tecnología LightCycler®(Roche), utilizando los métodos de qPCRSYBR Green I y TaqMan. Se evaluó la especificidad y sensibilidad de dicha PCR utilizando ADN de M. genitalium y de otros micoplasmas de origen humanos. Se logró la implementación de ambos métodos de qPCR con un límite de detección de 3,6 geq/µL, siendo la plataforma TaqManla que mostró mejor eficiencia. Ambos métodos mostraron una alta especificidad para la detección de M. genitalium y no se detectaron reacciones cruzadas con otros micoplasmas de origen humano. Se implementó por primera vez en Cuba una qPCR para la detección de M. genitalium. El método TaqMan mostró mejor desempeño parala futura aplicación de esta metodología en muestras clínicas. El presente trabajo permitirá realizar estudios de caracterización genética y antigénica de las cepas circulantes en Cuba, útiles para conformar un inmunógenovacunal.
Palabras clave:Mycoplasmagenitalium, qPCR, PCR en Tiempo Real, TaqMan, SYBR Green I, LightCycler®.
ABSTRACT
The diagnosis of M. genitalium infections by bacteriological culture is not feasible due to slow growth and that is time-consuming. Consequently, molecular methods using DNA amplification are widely used in the infection diagnosis procedure. There are no reports in Cuba of the implementation and use of quantitative Polymerase Chain Reaction methods for the detection and quantification of this pathogen. The aim of this study was to implement a qPCR method for the detection of M. genitalium by the amplification of the mgpBadhesin gene using two LightCycler® (Roche) protocols, SYBR Green I and TaqMan. The specifity and sensitivity were evaluated by using DNA of M. genitalium as well as other mycoplasms of human origin. In both qPCR-protocols, a limit of detection of 3.6 genome equivalents per µL template (geq/µL) was reached. The TaqMan protocol showed better efficiency than the SYBR Green assay. Both protocols showed a high specificity for the detection of M. genitalium, without cross-reactions with other mycoplasmas of human origin. For the first time in Cuba, a qPCR for detection of M. genitalium was implemented. The TaqMan method showed a better performance than the SYBR method and should be used for future applications in clinical samples. The present work will allow performing future studies of genetic and antigenic characterization of the circulating strains in Cuba, useful as vaccine immunogen.
Keys words:Mycoplasma genitalium, qPCR, Real-Time PCR, TaqMan, SYBR Green I, LightCycler®.
INTRODUCCIÓN
Mycoplasmagenitalium es una de las especies de micoplasmas de origen humano, reconocido como el organismo de vida libre más pequeño capaz de autorreplicarse. Su genoma de 580 kb está compuesto por unos 500 genes, que contiene el número mínimo de estos involucrados en la síntesis de elementos estructurales, vías metabólicas y componentes de la maquinaria de síntesis proteica, lo que implica que esta especie sea denominada como modelo del concepto de células mínimas o básicas (1).
El diagnóstico de las infecciones por M. genitalium mediante los métodos bacteriológicos tradicionales resulta laborioso y poco práctico, pues el crecimiento de los aislamientos primarios es extremadamente lento con el empleo de un medio de cultivo específico para micoplasmas, debido a su limitado metabolismo. Por otra parte, debido a la homología antigénica y la consecuente reactividad cruzada entre M. genitalium y M. pneumoniae, las herramientas serológicas carecen de especificidad en la práctica diaria. Es por ello que los métodos moleculares basados en la amplificación del ácido desoxirribonucleico (ADN), son ampliamente utilizados para el diagnóstico de infecciones causadas por este microorganismo (2,3).
Los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, del inglésquantitativepolymerasechainreaction), constituyen herramientas sensibles, específicas y rápidas para la detección y cuantificación de M. genitalium a partir de muestras clínicas (2,4).
En Cuba, la presencia de M. genitalium en muestras de pacientes masculinos con infecciones urogenitales se demostró previamente mediante PCR cualitativa (5). Sin embargo, no existen informes de la implementación y utilización de métodos de qPCR para la detección y cuantificación de este microorganismo.
El presente trabajotuvo como objetivo implementar un método de qPCR para la detección y cuantificación de M. genitalium en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Micoplasmas del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (LNRIM-IPK).
El mismo contribuye a la implementación de métodos diagnósticos rápidos y confiables para la detección de M. genitalium en muestras clínicas, lo que permitirá realizar estudios de caracterización genética y antigénica de las cepas circulantes en Cuba, útiles para conformar un inmunógenovacunal.
]]> MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de los patrones de ADN de M. genitalium
La cepa tipo de M. genitalium G37T (ATCC 33530) se cultivó en 50 mL de medio de cultivo Friis (6) durante 7 días a 37 oC. El cultivo se centrifugó a 10 000 g durante 30 min y a partir del sedimento celular obtenido se procedió a la extracción del ADNutilizando el estuchecomercial High Pure DNA TemplatePreparationKit (Roche, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El extracto de ADN concentrado se cuantificó mediante análisis espectofotométrico (7) y se realizaron diluciones seriadas desde 107 copias de equivalentes de genomas (geq) hasta 0,1 geq.
Preparación de los controles de ADN de M. genitalium y de las especies de micoplasmas de origen humano
Se utilizaron las cepas de M. genitalium M-30, M2288, M2300, M2321, M2341, así como las del resto de las especies de micoplasmas de origen humano: M. amphoriformeA39T (ATCC BAA-992), M. buccaleCH 20247T (ATCC 23636), M. fauciumDC 333T (ATCC 25293), M. fermentansPG 18T (ATCC 19989), M. hominisPG 21T (ATCC 23114), M. oralePatt (ATCC 15544), M. penetransGTU-54-6A1T (ATCC 55252), M. pirumZEUS (AMRC-C1555), M. pneumoniaeMac (ATCC 15492), M. primatumNavel (ATCC 15497), M. salivariumPG 20T (ATCC 23064), UreaplasmaparvumSerotype 3T (ATCC 27815) y U. urealyticumSerotype 8T (ATCC 27618).
Las mismas fueron donadas amablemente por el Laboratorio de Micoplasmas, Instituto Estatal del Suero, Copenhague - Dinamarca a la colección de cepas del LNRIM-IPK.
Las cepas del género Mycoplasma se subcultivaron en 50 mL de medio Friis hasta 7 días a 37 oC, mientras que las del género Ureaplasmase cultivaron en 50 mL de medio de cultivo UN (8) durante 48 h a 37 oC. A partir de estos cultivos en medio líquido se procedió a la extracción del ADN mediante el estuche comercial High Pure DNA TemplatePreparationKit (Roche, Alemania) como se describió anteriormente para la cepa G37T de M. genitalium.
Implementación de la qPCR para M. genitalium
Una qPCR se implementó para la detección y cuantificación de M. genitalium utilizando la tecnología LightCycler®(Roche, Alemania) en dos plataformas, SYBR Green I y TaqMan. Para ello se utilizó el juego de cebadores MgPa-355F: 5’- GAG AAA TAC CTT GAT GGT CAG CAA-3’ y MgPa-432R: 5’- GTT AAT ATC ATA TAA AGC TCT ACC GTT GTT ATC-3’, descritos por Jensen y cols.en el 2004 (9),los que amplificaron un fragmento de 78 pares de bases del gen mgpB, así como los estuches comerciales LightCycler®FastStart DNA Master SYBR Green I y LightCycler®TaqMan® Master (Roche, Alemania).
En el caso de la plataforma SYBR Green I, se evaluaron tres mezclas de reacción con variaciones en las concentraciones finales de los cebadores, cloruro de magnesio y la adición o no de seroalbúmina bovina (BSA).
]]> En este sentido, experiencias previas en nuestro laboratorio evidenciaron que la adición de BSA solo eliminaba la aparición de dímeros de cebadores, sin modificar ningún otro parámetro estadístico del ensayo de qPCR.En la Tabla 1 se muestran las mezclas de cada reacción para un volumen final de 20 µL (18 µL de mezcla más 2 µL de muestra).
En la estandarización de la qPCR en la plataforma TaqMan se evaluaron tres mezclas de reacción con variaciones en las concentraciones finales de los cebadores. En la Tabla 2 se muestran las mezclas de cada reacción para un volumen final de 20 µL (18 µL de mezcla más 2 µL de muestra).
Se utilizó como sonda la MgPa-380 TaqMan MGB: FAM - ACT TTG CAA TCA GAA GGT-MGB publicada por Jensen y cols (9). Las mezclas obtenidas para ambas plataformas se dispensaron en volúmenes de 18 µL en capilares de vidrio (Roche) y se añadieron 2 µL de ADN a cada capilar.
La amplificación y detección de los productos amplificados se realizó en un equipo LightCycler® 1,5 (Roche, Alemania). Para la plataforma SYBR Green I se utilizó un programa de un ciclo de desnaturalización inicial a 95 oC 15 min, seguido de 42 ciclos de 95 oC 10 s, 62 oC 10 s y 72 oC 5 s; le continuó un ciclo de análisis o curva melting de 95 oC 1 s, 65 oC 10 s y luego se aumentó la temperatura
0,1 oC/s hasta 95 oC. Como ciclo final se realizó un enfriamiento a 40 oC 30 s. Mientras que para la plataforma TaqMan se utilizó un programa de un ciclo de desnaturalización inicial a 95 oC 15 min, seguido de 45 ciclos a 95 oC 10 s, 62 oC 10 s y 72 oC 5 s, y se finalizó con un ciclo de enfriamiento a 40 oC por
30 s.
Los resultados de la qPCR se analizaron a través del programa LightCycler® 3,5 (Roche). Se realizó el análisis de las temperaturas melting para la plataforma SYBR Green I, así como la elaboración de una curva estándar y el cálculo de la eficiencia del ensayo para ambas plataformas.
Ensayos de sensibilidad y especificidad de la qPCR
Dos µL de cada uno de los patrones de ADN de M. genitalium se utilizó como muestra para la elaboración de la curva estándar y el cálculo del límite de detección del ensayo de cada plataforma de qPCR.Para los ensayos de especificidad, 2 µL de cada una de los extractos de ADN de cepas de M. genitalium, así como del resto de las cepas de micoplasmas de origen humano, se utilizaron como muestra en cada plataforma de qPCR.
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RESULTADOS
En la plataforma SYBR Geen I, el límite de detección para este ensayo fue 3,6geq/µL, lo que se traduce en 7,2 geq por reacción. La mezcla de reacción número 3 se seleccionó dada la escasa formación de dímeros, así como la obtención de amplicones con temperaturas melting homogéneas de 77 oC en la amplificación mediante qPCR de los estándares de ADN de M. genitalium. En el caso de las restantes mezclas (1 y 2), se obtuvo el mismo límite de detección que al utilizar la mezcla 3, aunque se observó la aparición de amplificaciones inespecíficas (dímeros de cebadores).
Al realizar la curva de calibración para el cálculo de la eficiencia de la qPCR se obtuvo una pendiente de -5,133, lo cual se traduce en una eficiencia de 56,6% (Fig. 1).
Al emplear la plataforma TaqMan se obtuvieron los mejores resultados al utilizar la mezcla de reacción número 3. Al realizar la amplificación de los estándares de ADN y la curva de calibración de la qPCR, se logró un límite de detección de 3,6 geq/µL (7,2 geq por reacción) y se obtuvo una pendiente de -3,275, con una eficiencia de la PCR del 100% (Fig. 2)
Ambas plataformas de qPCR mostraron una elevada especificidad al ser evaluadas con los ADN de las cepas de referencia de M. genitalium y de los otros micoplasmas de origen humano. Solo se observó amplificación a partir de los ADN de M. genitalium.
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DISCUSION
M. genitalium está presente en muy baja concentración en las muestras clínicas, por lo que para su detección molecular se prefieren métodos con un bajo límite de detección, antecedidos por uno de extracción que garantice la menor pérdida posible de ADN (2,10).
Pfaffl en 2010 (11), planteó que una qPCR en la que se genera un único producto de amplificación al utilizar cebadores bien diseñados, los agentes intercalantes como SYBR Green I funcionan perfectamente, aumentan la sensibilidad del ensayo sin que aparezcan fluorescencias generadas por amplificaciones inespecíficas, las cuales solos son detectadas cuando se utilizan un número alto de ciclos.
Además, en ensayos bien estandarizados la plataforma SYBR Green I y TaqMan producen resultados similares de sensibilidad, aunque la detección y cuantificación mediante SYBR Green I es mucho más sensible y menos específica que los ensayos basados en sondas (11,12).
En la presente investigación se redujo la formación de dímeros con la incorporación de seroalbúmina bovina a la mezcla de reacción de la PCR, lo que garantiza el aumento de las condiciones de astringencia en la misma (13).
La utilización del ensayo de qPCR para M. genitalium, basado en SYBR Green I constituye una novedad de esta investigación. Hasta el momento se han reportado varios ensayos de qPCR para este microorganismo en los que se utiliza como diana de amplificación los genes que codifican para el ARNr 16S, proteína de adhesión MgPa, gap y gyrA. Todos ellos tienen en común el empleo de plataformas TaqMan y sondas de hibridación (2,6,10,14-16); sin embargo, dada la sensibilidad y abaratamiento de los costos, la plataforma SYBR Green Ise emplea en la detección e identificación de otras especies de micoplasmas como M. gallisepticum y M. synoviae, en los que se ha logrado un límite de detección de 30 copias por reacción y una eficiencia de un 100% (17).
El valor de la eficiencia obtenido en la presente investigación para el caso de la plataforma SYBR Green I resulta relativamente bajo; sin embargo, dado que el fragmento del gen mgpB utilizado como diana posee un porcentaje bajo de guanina-citosina, así como un tamaño inferior a lo recomendado para los ensayos que utilizan SYBR Green I, la temperatura melting del amplicón resultante es muy similar a la de los dímeros de cebadores, lo cual no permite el aumento de la concentración de estos últimos en la mezcla de reacción con el objetivo de incrementar la sensibilidad general del ensayo (2,18,19).
Estos resultados coinciden con lo planteado por Jensen y cols. en el 2004 (9) al desarrollar una qPCR basada en la plataforma TaqMan para la detección y cuantificación de M. genitalium en muestras urogenitales, en las que utilizó los mismos cebadores y sonda empleados en esta investigación. En este sentido, el límite de detección no se vio afectado por la disminución del volumen de la muestra de ADN de 5 µL (9) a 2 µL, lo que permite la racionalización de la muestra clínica y el aumento del número de determinaciones o ensayos a realizar. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la cuantificación de los patrones de ADN de M. genitaliumse realizó mediante espectrofotometría, lo que causa que la cuantificación noes absoluta y se puede estar subestimando la concentración real del ADN. Por otro lado, Twin y cols. en el 2011 (20) realizaron una comparación entre dos metodologías de qPCR para M. genitalium, en las que obtuvieron también un límite de detección inferior a 6 geq y una eficiencia de 100% para el caso de la plataforma TaqMan del gen mgpB.
Para el empleo de métodos moleculares con fines diagnósticos, aún cuando se utilicen cebadores reportados, debe evaluarse la especificidad de los mismos en nuestras condiciones, puesto que la robustez del método debe ser evaluada, dada por la diferencia de equipos, reactivos, analistas, en comparación con la publicación anterior. La alta especificidad de la qPCR obtenida coincide con lo planteado por Jensen y cols. (9) al diseñar y evaluar el juego de cebadores y la sonda seleccionados para la presente investigación (9), lo que reafirma la robustez del método normalizado.
]]> De forma general, se logró la implementación en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Micoplasmas del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, de una qPCR para la detección y cuantificación de M. genitalium, lo que permitirá, después de la validación en muestras clínicas, la ampliación de las capacidades diagnósticas de las infecciones causadas por este patógeno en la población cubana.
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Recibido: Agosto de 2013
Aceptado:Septiembre de 2013
