Streptococcus agalactiae, medios de conservación accesibles a laboratorios de diagnóstico de baja y mediana complejidad

Bqca. Margarita Ester Laczeski, Lic. Esp. Eduardo Raúl Pegels, MSc. Patricia Noemí Oviedo, Dra. C. Marina Inés Quiroga, MSc. Marta Inés Vergara

Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones (FCEQyN UnaM). Misiones, Argentina.

RESUMEN

Introducción: si bien Streptococcus agalactiae es comensal del tracto gastrointestinal y genitourinario, es la principal causa de enfermedades invasivas y de mortalidad en niños recién nacidos. La infección puede adquirirse a través de la aspiración de líquido amniótico infectado o durante el paso por el canal de parto. ]]> Objetivos: comparar la utilidad de diversos métodos de conservación de cepas de Streptococcus agalactiae que resulten reproducibles, accesibles a laboratorios de baja y mediana complejidad, y asegurar su estabilidad fenotípica y genotípica mediante el método de preservación llamado subcultivo continuo, para el mantenimiento del cultivo en medio adecuado con transferencias a medio fresco a intervalos variables.
Métodos: se seleccionaron al azar 40 cepas de Streptococcus agalactiae, las que se sometieron a verificación de viabilidad, pureza y caracterización fenotípica y genotípica antes y después de ser sometidas a conservación, utilizando idénticos medios, reactivos y metodología en ambas circunstancias. Se probaron diferentes medios de preservación de las cepas, que permitieran a laboratorios de baja y mediana complejidad su traslado a centros especializados para la vigilancia adecuada del organismo. Las cepas se conservaron durante nueve meses con subcultivos que mostraron las características originales.
Resultados: los medios más efectivos fueron ATS-TA y LD 4 %-SO-20 ºC, ya que garantizaron viabilidad, pureza y estabilidad fenotípica y genotípica de las cepas. Se demostró que el uso de este medio es una alternativa adecuada para la conservación de Streptococcus agalactiae en laboratorios donde la liofilización y la desecación no están disponibles y que son de bajo costo, rápidos y muy fáciles de usar en la práctica habitual.
Conclusiones: los medios ATS-TA y LD 4 %-SO-20 ºC constituyen una buena alternativa para cortos períodos de preservación y transporte de cepas de Streptococcus agalactiae en laboratorios de baja y mediana complejidad.

Palabras clave: Streptococcus agalactiae, conservación.

Introduction: although Streptococcus agalactiae is commensal of the gastrointestinal and genitourinary tract, it is the main cause of invasive diseases and mortality in newborns. The infection can be acquired through the aspiration of infected amniotic fluid or during the passage through the birth canal.
Objectives: to compare the effectiveness of various methods for the conservation of Streptococcus agalactiae strains that can be reproducible and accessible to laboratories of low and medium complexity and guarantee their phenotypic and genotypic stability through a preservation method called continuous subculture, for the maintenance of the culture in an adequate environment with fresh medium transfers at variable interval periods.
Methods: 40 strains of Streptococcus agalactiae were randomly selected, which were subjected to verification of viability, purity and genotypic and phenotypic characterization before and after being subjected to conservation, using identical environments, reactive and methodologies in both circumstances. Different means of preservation of strains were tested, which allowed laboratories of low and medium complexity their transfer to specialized centers for the proper surveillance of the organism. The strains were kept for nine months with subcultures that showed original characteristics.
Results: the most effective environments were ATS-TA and LD-4 % -SO-20 ºC because they guaranteed viability, purity and genotypic and phenotypic stability of the strains. It was shown that the use of this environment is an adequate alternative for the conservation of Streptococcus agalactiae in laboratories where lyophilization and dessication are not available and are low cost, fast and very easy to use in regular practice. ]]> Conclusions: the ATS-TA and LD-4 % -SO-20 ºC environments are a good alternative for short periods of preservation and transportation of Streptococcus agalactiae strains in laboratories of low and medium complexity.

Key words: Streptococcus agalactiae, conservation.

INTRODUCCIÓN

Streptococcus beta hemolítico del grupo B de Lancefield, Streptococcus agalactiae, constituye parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal y urogenital humano, el cual adquiere relevancia en las gestantes a término, por la posibilidad de transmisión vertical al recién nacido, siendo una importante fuente de morbimortalidad perinatal.

En Argentina, desde abril del año 2008 "la obligatoriedad de la realización de la búsqueda de Streptococcus agalactiae en todas las embarazadas con edad gestacional entre las semanas 35 y 37, presenten o no condiciones de riesgo, está reglamentada por la Ley No. 26.369 para todo el Territorio Nacional".⁴ Esto condujo a su búsqueda sistematizada en los centros de salud.

Una característica de las cepas de Streptococcus agalactiae es que la mayoría de los genes asociados a la virulencia codifican proteínas necesarias para la interacción celular huésped bacteria. Se han descripto variaciones geográficas, temporales y étnicas en la distribución de dichos genes.³

La penicilina es la droga de elección para la PIP. Se describieron cepas resistentes a eritromicina (ERI) y clindamicina (CLI), drogas recomendadas en gestantes alérgicas a ß-lactámicos. Existen variaciones regionales en la resistencia a ERI y CLI, en diversos países, aún fronterizos y dentro de un mismo país, variaciones asociadas a las políticas en el uso de antimicrobianos.^5-7 Es necesario mantener la vigilancia de biotipos, fenotipos y genotipos, con sus variaciones geográficas, temporales y étnicas, con el fin de colaborar en diversas estrategias como PIP y construcciones vacunales.

Por lo expuesto, en general los diversos comportamientos de muchos microorganismos hacia y en el hombre en distintos tiempos y regiones geográficas, hacen necesarios estudios cada vez más complejos para mejorar diagnósticos que sean útiles en tiempo y forma y aportar a la prevención.

Por todo esto es necesario mejorar los medios a utilizar para la conservación y transporte de cepas de Streptococcus agalactiae que aseguren viabilidad y estabilidad fenotípica y genotípica y que sean además accesibles a laboratorios de diagnóstico clínico, con el fin de posibilitar estudios ulteriores.

Este estudio estuvo dirigido a comparar la utilidad de diversos métodos de conservación de cepas de Streptococcus agalactiae que resulten reproducibles, accesibles a laboratorios de baja y mediana complejidad, y asegurar estabilidad fenotípica y genotípica de estas mediante el método de preservación llamado subcultivos continuos, consistente en el mantenimiento del cultivo en medio adecuado con transferencias a medio fresco a intervalos variables.

MÉTODOS

Se seleccionaron al azar 40 cepas de Streptococcus agalactiae, las que se sometieron a verificación de viabilidad, pureza y caracterización fenotípica y genotípica antes y después de ser sometidas a conservación, con el uso de idénticos medios, reactivos y metodología en ambas circunstancias. Antes de ser inoculadas se realizaron las siguientes pre-pruebas:

- Pureza, viabilidad y cuantificación de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC): se investigó sembrando un inóculo representativo de cada cepa en placas de agar sangre ovina.

- Caracterización fenotípica: se realizaron determinaciones bioquímicas convencionales y serológicas de grupo y serotipo utilizando el kit comercial (Phadebact Strep B Test- ETC internacional-Bactus AB Sweden) y el test de aglutinación provisto por Statens Serum Institut (Strep- B.Latex. Copenhagen S. Denmark), que contiene 10 serotipos (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX).

- Caracterización genotípica: se efectúo la extracción de ADN procariota a partir de cultivo bacteriano en medio líquido y detección de los genes utilizando PCR según técnica de J. Sambrook.^9,10 Se estudiaron los genes de virulencia: bac (5´TGTAAAGGACGATAGTGTGAAGAC3´) Gene Bank AB221536, rib (5´ CAGGAAGTGCTGTTACGTTAAAC3´) Gene Bank U58333 y lmb (5´ GACGCAACACACGGCAT3´) Gene Bank AF062533, sintetizados por Operon Molecules for Life (EE.UU.).

]]> MEDIOS Y CONDICIONES DE USO

Caldo tripticasa soya (Laboratorios Britania-Argentina) con glicerina al 15 % a -20 ºC (CTS +15 % Glic-20 ºC), agar columbia (Laboratorios Britania) semisólido (0,7 % de agar) a temperatura ambiente y resguardo de luz (AC TA), agar columbia semisólido (0,7 % de agar) a 4 ºC (AC 4 ºC , agar tripticasa soya semisólido a temperatura ambiente y resguardo de luz (ATS TA), agar tripticasa soya semisólido a 4 ºC (ATS 4 ºC ), caldo Todd-Hewitt (Laboratorios Britania) semisólido (0,7 % de agar) a temperatura ambiente y resguardo de luz (CTH TA), caldo Todd-Hewitt semisólido a 4 ºC (CTH 4 ºC), leche descremada al 4 % con 300 UL de sangre ovina origen comercial (HEMO-G, Argentina), a -20 ºC (LD 4 % - SO 20 ºC).

Se distribuyó un volumen de 5 mL medidos con pipeta de doble aforo en frascos de vidrio de igual tamaño y capacidad (7 mL). Luego de las pre-pruebas a las que se sometieron las cepas se sembraron en los medios de conservación antes mencionados. Para esto, manteniendo el inóculo constante, se preparó una suspensión equivalente al No. 1 de la escala de MacFarland, y se transfirieron 100 µL a cada medio a estudiar.

A los 3, 6 y 9 meses de la siembra inicial, se transfirió una ansada de cada uno de los distintos medios de conservación a placas de agar sangre ovina para evaluar viabilidad y pureza y cuantificación de las UFC.

POS-PRUEBAS

Viabilidad, pureza, cuantificación y caracterización fenotípica: se tomó de cada frasco un inóculo de 5 µL de cultivo microbiano, el cual se transfirió a placas de agar sangre ovina mediante siembra cuantitativa y se realizó la caracterización fenotípica. Las placas se incubaron durante 24 hs a 37 ºC en atmósfera de CO₂ y se realizó la cuantificación de las UFC obtenidas, las que se reinscubaron por otras 24 hs con el fin de proceder a un nuevo recuento. Para la cuantificación se consideró solo a las colonias de Streptococcus agalactiae obtenidas en estado de pureza, en cada medio, temperatura y atmósfera estudiado.

Caracterización genotípica: se seleccionaron al azar 20 cepas de las 40 estudiadas en la pre-prueba. Se investigaron nuevamente los genes: bac, lmb y rib.


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RESULTADOS

PRE-PRUEBA

POS-PRUEBA

Se obtuvieron idénticos resultados en pureza, viabilidad, cuantificación de las UFC y caracterización fenotípica de las 40 cepas. No se produjo contaminación ni cambios morfológicos de las bacterias ni de las colonias.

La caracterización genotípica en las 20 cepas seleccionadas fue exitosa con la detección de los genes estudiados, manteniéndose la expresión genética. La figura muestra el rendimiento de los medios ensayados:

DISCUSIÓN

Si bien el método de preservación de cepas llamado «de subcultivos continuos» varía según composición de los medios de conservación, condiciones de temperaturas, ambientes y tiempos de mantenimiento de cultivos, es condición fundamental que las cepas a preservar se encuentren en condiciones óptimas de crecimiento, ya sea en fase exponencial tardía o en fase estacionaria temprana como forma de asegurar títulos adecuados de los microorganismos y su viabilidad. De hecho, la elección de un medio de preservación a usar es tan importante como las condiciones en las cuales se mantendrá dicha preservación.

Es conocido el concepto de que para la conservación de una cepa de Streptococcus, las bajas temperaturas (-20 ºC) y el agregado de suero hacen un excelente medio, pero son numerosos los laboratorios de diagnóstico clínico a los que les resulta onerosa esa posibilidad. Por eso decidimos ensayar diversos medios con la modificación de temperaturas y condiciones de mantenimiento, para una adecuada conservación de las cepas de Streptococcus agalactiae, que posibilite a laboratorios de baja y mediana complejidad un transporte ágil, adecuado y exitoso a los centros especializados.

El método de conservación a elegir, cualquiera que sea la cepa microbiana en cuestión, debe garantizar no solo la supervivencia en un buen porcentaje de esta, sino también que la población mantenga sus características fenotípicas y genotípicas.

Es de esperar que al menos las propiedades que los hacen importantes se mantengan inalterables, considerando las posibilidades técnicas y económicas disponibles y el tiempo necesario para el mantenimiento de las cepas para su transporte entre laboratorios o para ser utilizadas con fines educacionales. De todo esto surge la necesidad de mantener un registro sistematizado de los medios y métodos de preservación de Streptococcus agalactiae.

Del análisis de estos resultados, el mayor rendimiento en la conservación de las cepas de Streptococcus agalactiae se obtuvo con los medios de ATS TA y LD 4 % - SO -20 ºC, lo que concuerda con otros autores, quienes consideran que la conservación a temperatura ambiente y -20 ºC¹¹ resulta satisfactoria.¹²

Investigadores como George Siberry KN y otros,²² quienes trabajan con microorganismos del género Streptococcus (S. pneumoniae), sugieren que, independientemente del medio utilizado, los cultivos mantenidos a -20 ºC dejan de ser viables al cuarto mes, lo que discrepa con los resultados mostrados en este estudio.

La recuperación de microorganismos viables fue del 100 % para ambos medios de conservación, ATS TA y LD 4 % - SO -20 ºC, a los tres meses, con lo que se logró una recuperación del 85 % a los nueve meses del estudio, por lo que se recomiendan ambos para el mantenimiento de cepas de Streptococcus agalactiae y se aconseja un repique cada tres meses para asegurar el 100 % de viabilidad y pureza de cepas.

No se incluyó la conservación a 70 ºC, que demostró ser la mejor alternativa de conservación en trabajos realizados por R Borrero Maura,¹⁸ KN George Siberry,²² entre otros, y por nuestro grupo de trabajo de la Cátedra de Bacteriología (realizado en estudios con otros fines), por tratarse de una metodología no accesible a laboratorios de baja y mediana complejidad.

Los otros medios de conservación estudiados evidencian una pérdida importante de viabilidad, ya en los tres primeros meses, y una marcada disminución de esta hacia los nueve meses de estudio, por lo que, según nuestra experiencia, no son apropiados para la conservación de este microorganismo.

Autores, como C. Dauval Borges,¹¹ concuerdan en que el caldo Todd Hewitt semisólido con agregado de levadura puede ser una alternativa de conservación hasta los cien días con el 90 % de probabilidad de supervivencia.

En el presente estudio la evaluación a los tres meses de CTH TA muestra una recuperación del 82,5 % de viabilidad. Todos los medios de preservación estudiados, excepto los dos recomendados (ATS TA y LD 4 % -SO -20 ºC), tienen una recuperación menor del 50 % a los nueve meses de estudio.

Al evaluar el parámetro temperatura, se observa que Streptococcus agalactiae se conserva mejor a temperatura ambiente que a 4 ºC, independientemente del medio estudiado, y a 20 ºC en leche descremada al 4 % con agregado de 300 µL de sangre ovina.

De acuerdo con nuestra experiencia no se recomienda la conservación en heladera, conclusión esta que concuerda con otros estudios que sugieren la conservación de estreptococos a temperatura ambiente y resguardo de la luz,¹⁷ pero discrepa con otras publicaciones que refieren a la conservación a 4 ºC como una alternativa viable.¹⁵

La congelación es un proceso que, si bien genera estrés a las células vivas, estado este transitorio, se convierte en una alternativa útil para la conservación de microorganismos bacterianos, como ocurriera en nuestro caso con las temperaturas de 20 ºC.¹⁴

La recomendación de dos medios de conservación diferentes concuerda con lo establecido por la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC), en sus guías generales, la cual enuncia que, por seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos dos procedimientos diferentes.²⁴

Si bien generalmente los métodos de conservación más recomendados para períodos prolongados de tiempo son la criopreservación y la liofilización,^8,15 los resultados de esta investigación sugieren que ATS TA y LD 4 % - SO -20 ºC resultan apropiados para la conservación y transporte de cepas de Streptococcus agalactiae, ya que a las ventajas de su sencilla elaboración se suman el manejo y las condiciones de almacenamiento de fácil implementación en laboratorios de limitados recursos.

Se concluye que, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto y la relación costo-beneficio, los medios ATS TA y LD 4 % - SO -20 ºC pueden ser recomendados como una buena alternativa a ser usada para cortos periodos de preservación y transporte de cepas de Streptococcus agalactiae en laboratorios de baja y mediana complejidad.

]]> REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 15 de mayo de 2012. ]]> Aprobado: 20 de agosto de 2012.

Lic. Margarita Ester Laczeski. Universidad Nacional de Misiones (FCEQyN UnaM). Mariano Moreno 1375, Posadas, Misiones Argentina. C.P. 3300LQH. Correo electrónico: mlaczeski@gmail.com