¹ Investigador Tirular. Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia.
² Aspirante a Investigador. Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia.
³ Investigador Titular. Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
⁴ Investigadora Auxiliar. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos.

RESUMEN

Palabras clave: ACEITES VOLATILES; PLANTAS MEDICINALES; MEDICAMENTO HOMEOPATICO.

INTRODUCCION

Es importante destacar dentro de esta vegetación, la presencia de numerosas plantas aromáticas, endémicas o introducidas, que se han adaptado a nuestra geografía y clima. Algunas de ellas se utilizan como fuente de aceites esenciales, pero, sin embargo, existen otras aún no explotadas, cuyos extractos o aceites podrían ocasionar la creación de nuevos productos para sustituir importaciones o generar nuevos renglones exportables.

La Lippia alba (Mill.) N.E. Br. es una de las plantas que puede ser de interés fitoterapéutico, conocida en Cuba como quitadolor y anís de España, posee propiedades sudoríficas, antiespasmódicas, estomáquicas y emenagogas,¹ y además, se conoce que su aceite esencial posee actividad antimicrobiana.²

El presente trabajo tiene como objetivo iniciar el estudio de los componentes volátiles del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br., así como evaluar de forma preliminar su actividad antibacteriana.

MATERIAL Y METODO

Las plantas se cosecharon en septiembre de 1993 (8 meses de plantadas) y se secaron en estufa a 40 o C con recirculación de aire y un tiempo promedio de 10 h. El material fue molido en un molino de martillo de laboratorio, con el cuidado de evitar su calentamiento excesivo, hasta un tamaño de partículas promedio de 0,31 mm. ]]> El aceite esencial se obtuvo por hidrodestilación con un aparato del tipo Clevenger a partir de 600 g de material molido. El tiempo de destilación fue de 3 h. El aceite esencial se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se guardó en frío hasta su análisis.

Al aceite esencial se le determinaron las características físicas y químicas establecidas.³ Además se efectuó una separación a partir de 0,5 g de muestra por cromatografía de columna con 25 g de silicagel 60 Extrapura (70 a 230 mallas) de actividad 2 a 3. La columna se mantuvo a 20 o C durante el proceso y se recogieron 2 fracciones: una apolar (hidrocarburos) con 150 mL de n-pentano y otra polar (compuestos oxigenados) con 350 mL de éter etílico. A ambas fracciones se les eliminó el solvente por destilación fraccionada y se pesaron.

El análisis por cromatografía de gases (CG) se efectuó en un equipo Pye Unicam 204 con detector de ionización por llama de hidrógeno. Se utilizó una columna capilar de cuarzo (25 m x 0,32 mm) del tipo BP-1 (SGE, Australia). Las condiciones de operación fueron: temperatura del horno, 70 o C (4 min) hasta 220 o C (15 min) a una velocidad de 4 o C/min; gas portador, hidrógeno; temperatura del inyec- tor, 220 o C; temperatura del detector, 250 o C.

El análisis por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (CG- -EM) se realizó en un equipo Jeol JMS-DX 300 con una columna capilar de cuarzo (25 m x 0,25 mm) del tipo SPB-1 (Supelco, EE.UU). Las condiciones de operación fueron: temperatura del horno, 60 o C (4 min) hasta 220 o C (20 min) a una velocidad de 4 o C/min; gas portador, helio; temperatura de la fuente iónica, 250 o C; energía de ionización, 70 eV.

La identificación de los componentes se llevó a cabo con ayuda de una IBM-AT mediante una base de datos denominada IDENT, creada con el programa FOXPRO (Fox Holdings, EE.UU). La base de datos contiene índices de Kovats para 2 fases cromatográficas distintas, así como el peso molecular y los 6 iones más abundantes del espectro de masas de sustancias volátiles.

El análisis cuantitativo se realizó por normalización interna, mediante medición automatizada de la señal del cromatograma iónico reconstruido.

El análisis por espectroscopia infrarroja se efectuó en un equipo modelo PU-9512 de la Phillips-Unicam acoplado a una IBM-PC por medio del programa BIRD que permite la obtención, procesamiento y almacenamiento del espectro, así como su comparación con espectros registrados anteriormente. Se registró en cubeta de KBr de 0,2 mm de espesor o como película.

El estudio de la actividad antibacteriana se llevó a cabo mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (MCI) con el empleo del método de las diluciones seriadas dobles en medio líquido. Se utilizó una bateria de microorganismos controles integrada por: Pesudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Serratia marcescens ATCC 8100, Enterobacter aerogenes ATCC 13088, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus subtilis ATCC 7001 y Streptococcus faecalis ATCC 19433. A partir de cada una de ellas se prepararon suspensiones en medio triptona-soya-caldo y se incubaron a 37 o C hasta alcanzar la fase de desarrollo logarítmica, ajustándoseles la concentración por comparación visual al patrón 0,5 de la escala de Mc Farland. El inóculo utilizado fue de 10⁵ ufc/mL. Los tubos que contenían las diluciones del aceite esencial, después de expuestos a las bacterias controles, fueron incubados a 37 o C durante 24 h, determinándose entonces el valor de la MCI para cada microorganismo, la cual es definida como la menor concentración del agente antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento; en aquellos casos donde se observó inhibición se tomaron alícuotas y se sembraron en medios agarizados libres del agente, para ello se empleó el agar Mc Conkey No. 3 agar Voger-Johnson o agar leche en dependencia del microorganismo en cuestión. La menor concentración de las sustancias capaz de inhibir totalmente el crecimiento microbiano fue definida como la concentración bactericida mínima (MBC). Dada la insolubilidad del aceite en agua, se utilizó etanol 95 % como solvente, por lo que fue necesario realizar paralelamente con la serie problema una serie blanco a fin de conocer el efecto del solvente. En ningún caso se encontró efecto del solvente sobre las células microbianas. En todos los casos se evaluó un rango de concentraciones desde 0,04 hasta 10 mg/mL. Los controles positivos empleados fueron la gentamicina y el ketoconazol.

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

El fraccionamiento por cromatografía de columna indicó que el aceite está constituido por 20,7 % de hidrocarburos y 79,3 % de compuestos oxigenados.

Por la importancia de esta última fracción se procedió a su estudio por espectroscopia IR. Los espectros del aceite esencial y de la fracción oxigenada tienen un alto grado de similitud y coinciden con el espectro de la carvona. Esto se pudo comprobar mediante la comparación de los espectros de los 3 productos (figura). Las bandas principales de la carvona, así como su asignación, se detallan en la tabla 1. ]]> TABLA 1. Bandas típicas del espectro IR de la carvona

TABLA 2. Componentes volátiles identificados en el aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br.

Desde el punto de vista cuantitativo, se resalta la presencia mayoritaria de la carvona (pico 19). A partir de estos resultados, parece obvio que la especie evaluada posee diferencias químicas infraespecíficas que permiten afirmar que está en presencia de un nuevo quimiotipo, del tipo carvona, diferente a los cuatro anteriormente informados:^2,4-8 dihidrocarvona, piperitona-óxido de piperitenona, citral y citral-1,8-cineol.

Los resultados de la actividad antibacteriana del aceite de Lippia alba sobre gérmenes de interés clínico humano (tabla 3) pusieron de manifiesto que de las especies estudiadas sólo la Pseudomonas aeruginosa mostró resistencia a las diferentes concentraciones evaluadas de dicho agente. El resto de las bacterias, específicamente las grampositivas y S. marcescens, presentaron susceptibilidad frente al aceite esencial, con valores de MCL entre 0,31 y 0,63 mg/mL. El S. aureus fue de todas las bacterias la que resultó inhibida con la menor dosis del agente antibacteriano. ]]> TABLA 3. Actividad antibacteriana del aceite esencial

ND: No detectable a las concentraciones evaluadas.

Las concentraciones mínimas bactericidas fueron en la mayoría de los casos diferentes en una dilución de las mínimas inhibitorias, lo cual evidencia que la inhibición del crecimiento microbiano fue debida a una sección bacteriostática ocasionada por el aceite sobre las células. En el caso de la E. coli, K. pneumoniae y E. aerogenes se observó un efecto bactericida, siendo para ella los valores MBC similares a los MCI.

CONCLUSIONES

Este aceite esencial presenta actividad antibacteriana, siendo mayor, en general, sobre los gérmenes grampositivos, con valores de las MCI entre 0,31 y 0,63 mg/mL.

SUMMARY

Key words: OILS, VOLATILE; PLANTS, MEDICINAL; HOMEOPATHIC DRUG.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Roig JT. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. La Habana: Editorial Ciencia y Técnica, 1974.
2. Fun CE, Svendsen AB. The essential oil of Lippia alba (Mill.) N. E. Br. J. Essential Oil Res 1990;2:265-7.
3. Helrick K, ed. AOAC. Official Methods of Analysis. 15ed. Arlington: Association of Official Analytical Chemist, 1990:898.
4. Fester GA, Romero L, Riccardi A, Burgos J, Cassano A. Algunas esencias XV. The oil of Lippia alba from Puente Pezoa and Loreto. Rev Fac Ing Química 1961;30:11-4.
5. Hegnauer R. Chemotaxonomie der pflanzen. Basel: Birkhoäuse Verlag, 1973;vol. 6: 668-9.
6. Fujita Y. Cubic system for classification of the genus Lippia (Verbenaceae) by the constituents of essential oils. 3. Rep Gov Ind Res Inst Osaka 1965;306:21-5.
7. Catalan C, Merep DJ, Retamar JA. El aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br. de la provincia de Tucumán. Rev Italiana 1977;59:513-8.
8. Lawrence B. The botanical and chemical aspects of oregano. Perf Flav 1984;9:41-51.

Dr. Jorge A. Pino Alea. Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia. Carretera del Guatao Km 1/2, Ciudad de La Habana 19200, Cuba. ]]> 1974 1990 2 265-7 1990 898 1961 30 11-4 1973 vol. 6 668-9 1965 306 21-5 1977 59 513-8 1984 9 41-51