Análisis físico-químico de la sal sódica de la prostaciclina obtenida en Cuba

RESUMEN

Descriptores DeCS: EPOPROSTENOL/química.

La sal sódica de la prostaciclina (ácido 6,9-epoxi-11,15-dihidroxiprosta-5,13-dienoico sal sódica; PGI₂Na) pertenece a la familia de los prostanoides y es utilizada para el tratamiento de la hipertensión pulmonar, como inhibidor de la agregación plaquetaria, lavado de órganos para trasplantes y plaquetas, así como para el tratamiento de otras afecciones del sistema cardiovascular, respiratorio, etcétera.¹

El descubrimiento, la síntesis y la determinación estructural de la prostaciclina (PGI₂), fueron precedidas por varias observaciones relevantes; la más importante de éstas fue la caracterización y síntesis de la molécula de 6-ceto prostaglandina F_1a (6CPGF). El aislamiento de este compuesto de fuentes biológicas y no de la prostaciclina, relativa a su alta reactividad, motivó el estudio de su interconversión.²

La PGI₂ es muy inestable y dada sus propiedades químicas es muy susceptible a una rápida hidrólisis a 6CPGF y consecuentemente su inactivación.³ El descubrimiento de que la PGI₂ es (a) el paso biosintético intermedio entre la PGH₂ y la 6CPGF y (b) la rápida hidrólisis a 6CPGF dio una explicación a la existencia de esta molécula en varios sitios biológicos.¹ Esta hidrólisis rápida se debe a la proximidad del grupo 1-carboxilo al sistema enol cíclico estéricamente torcido de la PGI₂, provocando la adición de agua por vía de la migración de enlaces y ruptura del anillo a 6-ceto. Este mecanismo es soportado por el incremento de la estabilidad hidrolítica de ésteres de PGI₂.⁴

Tal inusual alta reactividad de PGI₂ debida al vinil éter es atribuida a factores estéricos que incrementa la velocidad de protonación del carbono 5, cuya constante de velocidad de primer orden es independiente del pH para la hidrólisis espontánea, catalizada por agua como un ácido general.^5,6

Se señala en un artículo de De B y otros⁷ que la identificación de la PGI₂ obtenida, se basó en la inhibición de la agregación plaquetaria de los trombocitos humanos con esta sal y su inestabilidad a un pH ácido del medio, conjuntamente con la demostración química posterior de este metabolito, lo que le permitió concluir sobre la compatibilidad de la configuración de la PGINa. Igual señalamiento realizan Johnson y otros² al plantear que la estructura asignada a la PGI₂ depende de la comparación de las propiedades biológicas y químicas de la PGI₂ natural con la de la sal sódica de la síntesis.¹

Un estudio colaborativo entre los laboratorios de las firmas Upjohn y Wellcome Research estableció la estructura de la PGI₂ al señalar que es un enol éter bicíclico que descompone por hidrólisis a valores de pH fisiológico para dar 6CPGF.⁴

La PGINa es higroscópica.⁸ Se señala que muestras de PGINa contienen trazas de agua y bicarbonato de sodio que son excesivamente difícil de eliminar, por lo cual no ha sido posible obtener muestras puras del ácido libre ya que siempre la 6CPGF está presente.³ Cuando se aplicó a placas de cromatografía de capa delgada (CCD) sobre silicagel y se desarrolló en sistemas de solventes acídicos la PGINa de curso se transformó inmediatamente al ácido libre y por tanto a la 6CPGF.³ Por igual motivo tampoco es posible utilizar columnas cromatográficas para su purificación. Debido a alta sensibilidad el análisis por CCD se realiza al éster metílico por conversión en el derivado p-fenilfenacilo por reacción con a-bromo-p-fenilacetofenona en exceso en presencia de una amina;³ mientras que el análisis por CCD de la PGINa se realiza por transformación a 6CPGF utilizando como control una muestra de referencia.

En el análisis por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) fue inmediatamente revelado que la PGI₂ se descompone espontáneamente a 6CPGF durante la resolución en una columna CLAR de fase normal con una fase móvil anhidra, así como en una columna de fase reversa con fase móvil a pH 8,5. Este fenómeno es atribuido al poder catalítico de los sitios de adsorción acídicos en las columnas em-pleadas,⁵ de ahí la necesidad de trabajar con fases móviles a pH superiores a 9 con vistas a preservar su estabilidad química. ]]> En el análisis por espectrometría de masa se reporta la realización de espectros a derivados silanizados de 6CPGF, señalando que es el método de identificación de este compuesto.⁹

Para realizar el estudio por resonancia magnética nuclear protónica y de carbono-13 y medir sus constantes de acoplamiento, la literatura señala el empleo del éster metílico de PGI₂, en el que se realizó un tratamiento complejo con empleo de disolventes deuterados (CD₃OD, CDCl₃ y D₂O), de soluciones buffer y temperaturas muy bajas, como vía de minimizar la hidrólisis de la PGI.¹⁰ Por lo anteriormente expuesto se justifica que el análisis físico-químico de la sal sódica de la prostaciclina con vistas a corroborar la estructura química puede hacerse mediante la conjunción de los estudios de su acción antiagregante plaquetario y de las propiedades que presenta la 6-cetoprostaglandina F_1a como su principal producto de hidrólisis el cual se obtiene por transformación del producto sintetizado.

Es objetivo de este trabajo mostrar los resultados del análisis físico-químico de la sal sódica de la prostaciclina por espectroscopia infrarroja, resonancia magnética nuclear protónica y de carbono-13. Como corroboración de la estructura de la molécula estudiada, se realiza también el estudio espectroscópico al producto de su hidrólisis, la 6-ceto prostaglandina F_1a , mediante la espectroscopia infrarroja, resonancia magnética nuclear protónica y de carbono-13 con ayuda de las técnicas COSY y el análisis de su composición elemental; así como, el estudio de la transformación hidrolítica de la sal sódica de la prostaciclina I₂ en 6-ceto prostaglandina F_1a y su detección por CLAR.

MÉTODOS

El análisis elemental se realizó en un equipo de microanálisis elemental desarrollado en el laborarorio de la Universidad de Zurich, Suiza.

La temperatura de fusión fue determinada en un equipo Electrothermal (Reino Unido).

Los espectros infrarrojos se registraron en un equipo Bruker y en un espectrofotómetro PU9512.

Los espectros de RMN¹-H,¹³C, COSY HH Y HC, se registraron en un equipo Bruker de 200 MHz en dimetilsulfóxido-d₆ para la PGINa y en CDCl₃ para la 6CPGF y TMS como referencia interna.

El espectro de masa se realizó en un equipo TRIO-1000, de FISONS Intruments por el método de introducción directa, modo ionización (EI+) 70 e V y temperatura de la fuente de 270 °C.

Los estudios cromatográficos se realizaron en los equipos de HPLC-KNAUER con detector UV-Knauer de longitud de onda variable y microprocesadora Shimadzu CR--3A y LaChrom (Merck-Hitachi) con una bomba L-7100 y detector UV de longitud de onda variable acoplado a una microcomputadora personal con programa Biochrom (CIGB-Cuba). Se emplearon las condiciones crotamográficas siguientes: columna Lichrospher 100 RP-18, 5m (250 x 4 mm), detección a 205 nm, flujo 1,2 mL/min; fase móvil: acetonitrilo: agua (20:80; v:v) llevada a pH=9,3 con buffer ácido bórico (0,009 mol/L)- -tetraborato de sodio (0,04 mol/L). Para el análisis de pureza de 6CPGF la fase móvil estuvo compuesta de acetonitrilo: buffer de ácido fosfórico (0,017 mol/L) en proporción 32,8:67,2; v:v) con detección a 194 nm y flujo 1 mL/min.

RESULTADOS

Temperatura de fusión. El valor obtenido de la temperatura de fusión para la 6CPGF fue de 105-108 °C, lo que está en correspondencia con lo reportado de 101- -108 ?C.³ ]]> Análisis elemental. El análisis elemental para la 6-ceto prostaglandina F_2a reportó los valores siguientes: carbono = 64,53 %; hidrógeno = 9,69 %, resultados permisibles de acuerdo con los teóricos: carbono = 64,86 %; hidrógeno = 9,19 %.

Espectroscopia infrarroja. En el espectro infrarrojo obtenido para la PGINa se observan las bandas características a 3 350 (OH), 1 690 (O-C=C), 1 555 y 1 470 (CO₂) y 970 (C₁₃=C₁₄) cm^-1. En los espectros infrarrojos obtenidos para la 6CPGF se observan las bandas características a 3 400 (OH), 2 600 (OH, ácido), 1 690 (C=O) y 970 (C₁₃=C₁₄) cm^-1.

Espectrometría de masas. En el espectro de masa para la 6CPGF, obtenido por introducción directa de la muestra sin derivatizar, no aparece el pico de ion molecular; sin embargo, sí se observa un pico característico con un valor de m/z de 352 correspondiente a la pérdida de una molécula de agua y otros picos de diferentes intensidades correspondientes a este compuesto, como: 335, 279, 251, 208, 181 (100 %), 121, 99, etc. En la literatura los espectros de masas referidos a este compuesto se encuentran registrados como derivados.⁹

Espectroscopia de resonancia magn-tica nuclear protónica. La asignación de las señales correspondientes dados los corri-mientos químicos (d ) en p.p.m. y multiplicidad (s= singlete, t= triplete, m= multiplete) para la PGINa y 6CPGF, son las siguientes:

PGINa: 5,42 (m, 2H,C_13,14vinil); 4,48 (m,1H, CHO); 4,05 (m, 1H,OC=CH); 3,85 (m,1H, C₁₅H); 3,64 (m,1H,CHO); 3,40 (s), 2H, OH); 0,85 (t, 3H,CH₃).

6CPGF: 5,5-5,6 (m, 2H, C_13,14 vinil); 5,0 (s,3H, 3OH); 3,5-4,6 (m,6H,CH); 1,9-2,7 (m,6H,CH); 1,0-1,8 (m,14H); 0,90 (t,3H, CH₃).

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbono-13. La asignación de las señales correspondientes dados los corrimientos químicos (d ) en p.p.m. para la PGINa y 6CPGF, son las siguientes:

Con vistas a corroborar lo planteado en la literatura,^3,6,8 de que la transformación de PGINa a 6CPGF ocurre rápidamente y como producto exclusivo, lo cual permitiera la confirmación de la estructura de la PGINa, fue que se realizó la transformación de ésta en 6CPGF. ]]> En los cromatogramas por CLAR del material de referencia químico y el del producto sintetizado, en el tiempo cero presenta un pico mayoritario correspondiente a la PGINa con un tiempo de retención de alrededor de 5,6 min y un pico minoritario con tiempo de retención de alrededor de 1,5 min correspondiente a la 6CPGF, que se corresponde con el pico del material de referencia químico de 6CPGF. La transformación paulatina puede observarse en los cromatogramas al transcurrir el tiempo (3 y 24 h); mientras que a las 72 h no se observa la presencia de PGINa. En los cromatogramas no aparece otro pico adicional que no sean los correspondientes a estos compuestos, lo cual permanece invariable hasta las 96 h.

Todo ello nos permite realizar el análisis físico-químico conjunto de la PGINa sintetizada y de la 6CPGF obtenida, como vía de corroborar la identidad química de estos productos.

Los espectros IR de PGINa y 6CPGF concuerdan con lo reportado en la literatura.³

Es necesario señalar que al registrar un espectro de masa de la PGINa, se pudo observar que la muestra descompone intensamente y la cantidad de señales es numerosa, por lo que no se pudo determinar ninguna posible fragmentación. Por otro lado, dicho espectro no se encuentra reportado en la literatura ampliamente consultada.

Los espectros de RMN-¹H para la PGINa y la 6CPGF coinciden con lo reportado en la literatura para ambos compuestos. Es necesario señalar que los espectros COSY HH permitieron dar una mejor interpretación de los resultados y asignar las señales correspondientes para la 6CPGF.

En los espectros de RMN-¹³C desacoplados a banda ancha coincide el número de señales con el número de átomos de carbono de las estructuras, no aparece en el registro la señal correspondiente al carbono carboxílico de alrededor de 174 p.p.m. por usarse una escala amplia con vistas a separar las señales más importantes.

Con vistas a la mejor asignación de los corrimientos químicos para la 6CPGF se utilizaron técnicas bidimensionales, no reportadas anteriormente en la literatura para este compuesto.

El estudio sobre la agregación plaquetaria de la PGINa obtenida en Cuba se encuentra publicado, cuyos resultados demuestran el comportamiento biológico de ésta de acuerdo con la estructura asignada.¹¹

Se concluye en este estudio, que mediante CLAR la hidrólisis de la sal sódica de la prostaciclina I₂ sólo produce 6-ceto prostaglandina F_1a , de acuerdo con nuestras condiciones de trabajo. Además, se demostró que la estructura de la sal sódica de la prostaciclina I₂ mediante diversas técnicas físico-químicas de elucidación estructural concuerda con lo esperado y lo reportado en la literatura, tanto por análisis de sus propias características espectroscópicas como la de su producto de hidrólisis, la 6-ceto prostaglandina F_1a .

SUMMARY

Subject headings: EPOPROSTENOL/chemistry.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 17 de abril de 1999. Aprobado: 21 de mayo de 1999.
Lic. José A. González Lavaut. Centro de Química Farmacéutica. Calle 200 y Ave. 21, Atabey, Playa, Ciudad de La Habana 11600, Cuba.
 
  ¹ Licenciado en Química. Investigador Auxiliar.
² Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Investigadora Titular. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos.
³ Técnico Medio en Química. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos.
⁴ Técnico Medio en Química. ]]>   ]]> 1989 29 ed 1371 1985 14 131-54 1978 100 21 21 7690-705 1977 32 2805-8 1978 15 6 6 943-54 1987 20 364-70 1980 19 2 2 221-47 1989 11 ed 120 1988 15 143-51 1985 63 1143-9 1990 3 2!3 2!3 130-2