Xiomara Pérez Gutiérrez1 y Vivian Martínez Espinosa2
La levodropropizina es una sustancia sintética que ha demostrado tener eficaz acción antitusígena y actúa a nivel periférico. Se desarrolló y validó un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la cuantificación de levodropropizina en gotas orales al 6 %. Los parámetros de validación analizados fueron: linealidad, especificidad, precisión, exactitud y rango, según lo establecido por la USP 23 para esta categoría de ensayo. El método desarrollado resultó ser lineal, específico, preciso y exacto en el rango de concentraciones estudiado, por lo que su empleo se considera factible para la cuantificación de la levodropropizina en el control de la calidad y en el estudio de estabilidad de las gotas orales.
DeCS: AGENTES ANTITUSIVOS/uso terapéutico; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION/métodos; CONTROL DE CALIDAD.
La levodropropizina (S (-)-3-(4-fenil-1-piperazinil) 1,2-propanodiol) es un antitusígeno no narcótico de acción periférica a nivel traqueobronquial. Constituye el isómero levorrotatorio de la dropropizina, la cual es un derivado de la fenilpiperazina.1,2 Según Melillo y otros ha demostrado tener un índice terapéutico (actividad/efectos adversos) más favorable que la dropropizina y el isómero dextrorrotatorio (XXIII Congreso Nazionale della Societá Italiana di Farmacologia, San Remo, 6-8 ottobre 1986).
En 1988, Zarantin y otros describieron una técnica analítica que combina la cromatografía de gases con la espectrometría de masas para la detección y cuantificación de los niveles de levodropropizina en plasma proveniente de voluntarios sanos quienes recibieron una dosis oral única del fármaco, y lograron medir concentraciones tan bajas como 5 ng/mL.3
Por otra parte, Calatozzolo y otros, en 1993, evaluaron la pureza enantiomérica de la levodropropizina con la utilización de la espectroscopia FT-IR y la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR). Este estudio demostró que el método cromato-gráfico ofrecía mejores resultados, aunque el método espectroscópico era una alternativa en este tipo de análisis.4
En el presente trabajo se describe un método analítico por CLAR para la cuantificación de levodropropizina en gotas orales, el cual ha sido debidamente validado según los requisitos establecidos en la USP 23 para esta categoría de ensayos y las metodologías descritas por otros autores,5-7 a fin de poder ser empleado en el control de la calidad y en los estudios de estabilidad de la formulación nacional en gotas orales de este fármaco.
Se desarrolló un método por CLAR, para cuatificar la levodropropizina en el control de la calidad y el estudio de estabilidad de las gotas orales 6 %, basado en la separación de esta en una columna cromatográfica con detección UV y su cuantificación frente a una muestra de referencia según el método del patrón externo.
El estándar de referencia de levodropropizina fue suministrado por el área de patrones del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). El producto terminado en forma de gotas orales al 6 %, lote 99022, fue elaborado a partir de la materia prima procedente de la Swiss Branch, Suiza, por el Departamento de Formas Terminadas del CIDEM, así como el placebo empleado. Todos los reactivos utilizados fueron de calidad analítica (Merck).
]]> En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 238 nm, un dosificador (loop) de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR6A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna Li Chrospher RP18250 mm ×4 mm, 10 µm. La fase móvil utilizada consistió en una mezcla desgasificada de metanol:ácido fosfórico 0,025 mol/L, ajustado a pH = 3 ± 0,1 con trietilamina, en proporción (98:2) con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.Para el análisis se disolvió una cantidad exacta del estándar de referencia con ácido fosfórico 0,025 mol/L a pH = 3 y posteriormente se realizó una dilución en fase móvil para obtener una solución con una concentración final de 12 µg/mL. Las muestras fueron preparadas de forma similar, disolviendo inicialmente en ácido fosfórico 0,025 mol/L a pH = 3 un volumen exacto de gotas orales.
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones patrón de levodropropizina en un rango de concentraciones de 2,4 hasta 18,0 µg/mL.
Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 7 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas para comprobar la precisión intermedia del método.
En el estudio de la exactitud y linealidad del método analítico se empleó el método de recuperación para muestras con diferentes niveles de levodropropizina que representaban el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en las gotas orales, según la formulación propuesta.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizó una muestra placebo y una muestra sometida a oxidación con peróxido de hidrógeno al 3 %.
La curva de calibración a 238 nm resultó ser lineal en el rango de concentraciones comprendido entre 2,8 y 18,0 µg/mL. La ecuación de la recta se expresa según: y = 74256,9896 x - 7466,2029. El coeficiente de correlación lineal es 0,9994. Al aplicar la prueba de linealidad, utilizando el coeficiente de variación de los factores de respuesta, se obtuvo un CVf = 2,8 %. Mediante la prueba de proporcionalidad se determinaron los límites de confianza del término independiente, los cuales fueron: - 21293,5326 y 6361,1268.
En la tabla 1 y 2 se reportan los resultados del estudio de la precisión y exactitud del método respectivamente.
Tabla 1. Estudio de la precisión del método cromatográfico
| Repetibilidad | ||
| ]]> Muestra | % | |
| 1 | 103,9 | |
| 2 | 102,9 | |
| 3 | 102,8 | |
| 4 | ]]> 103,8 | |
| 5 | 106,6 | |
| 6 | 107,5 | |
| 7 | 104,8 | |
| Media: 104,6 % | S = 1,81 | CV = 1,73 % |
| Precisión intermedia (%) | ||
| Analista I | ]]> Analista II | |
| 104,1 | 104,8 | |
| 104,9 | 103,9 | |
| 104,7 | 106,6 | |
| 105,0 | 103,8 | |
| 106,1 | ]]> 102,9 | |
| Media: 105,0 | Media: 104,4 | |
| S = 0,7266 | S = 1,4018 | |
| SV = 0,69 % | CV = 1,34 % | |
| Fcalc = 3,72 | F5 % = 6,39 | g.l. =4/4 |
| tcal = 0,849 | t5 % = 2,306 | ]]> |
Intervalo de confianza: 104,7 ± 0,7972
Tabla 2. Estudio de la exactitud del método cromatográfico
| Valor | Valor | Cantidad | Media | ||||
| teórico (%) | hallado (%) | de recobro (%) | ]]> (%) ± S | CV (%) | S2 | ||
| 80 | 80,0 | 79,7 | 100,0 | 99,6 | 79,8 ± 0,2 | 0,27 | 0,04 |
| 100 | ]]> 99,2 | 98,9 | 99,2 | 98,9 | 99,0 ± 0,2 | 0,21 | 0,04 |
| 120 | 120,7 | 121,4 | 100,6 | ]]> 101,2 | 121,9 ± 0,5 | 0,41 | 0,24 |
Al aplicar la prueba de G de Cochran la Gexp dio como resultado 0,7318 siendo la Gtab, 0,9669 para p = 0,05. En la tabla 3 se presenta el resultado de la prueba de t de Student.
Tabla 3. Resultados de la prueba t de Student en el estudio de exactitud
| n | Recuperación media | Desviación estándar | Coeficiente de variación | ||
| 6 | ]]> 99,9 | 0,87 | 0,87 % | ||
| texp = 0,028 | |||||
| ]]> | ttab = 2,571 | p = 0,05; g.l. = 5 | |||
Por otra parte, la curva de recuperación en el intervalo de 80 a 120 % fue y = 4976,5625 x – 20808,5833, con un coeficiente de correlación lineal t = 0,9988. La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método.
FIG. Resultados del estudio de especificidad del método (A: cromatograma del estándar de referencia de levodropropizina; B: cromatograma de la muestra; C: cromatograma del placebo; D: cromatograma de la muestra degradada en H2O2 al 3 %).
El coeficiente de variación de los factores de respuesta obtenido demostró una adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido (CVf < 5 %).
Como los límites de confianza del término independiente, determinados en la prueba de proporcionalidad, incluyen el cero, se cumple la condición de proporcionalidad del método.
En el estudio de precisión, en el caso de la repetibilidad, el coeficiente de variabilidad alcanzado demuestra una buena precisión ya que para métodos cromatográficos se permite como límite máximo el 2 %. Los valores expuestos en el estudio de la presición intermedia indican que no existen diferencias significativas entre la precisión alcanzada por los 2 analistas para el 95 % de probabilidad, ya que el valor calculado en la prueba de Fisher es menor que el tabulado. No se observó diferencia significativa entre las medias de ambos analistas, debido a que al realizar la prueba de la t de Student el valor hallado resultó ser menor que el tabulado, para 8 g.l. con el 95 % de probabilidad. Es posible encontrar, con un nivel de significación del 5 %, los valores registrados en el intervalo comprendido entre 103,9 y 105,5 %.
Según el estudio de la exactitud, en todos los niveles el coeficiente de variación resultó ser menor que el 2 % y los porcentajes recuperados se encontraron entre 98,0 y 102,0 %, lo que se considera adecuado para este tipo de análisis. No se observó influencia del factor concentración ya que el valor de la Gexp fue menor que el obtenido para la Gtab. Al aplicarse la prueba de la t de Student, se comprobó que no existen diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 %, lo cual confirma la buena exactitud del método.
El coeficiente de correlación lineal de la curva de recuperación en el intervalo de 80 a 120 % demostró la linealidad del método.
En el estudio de especificidad, como puede observarse en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (C), no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, al ser comparado con la señal obtenida para la solución estándar de referencia (A) y de la muestra de levodropropizina en solución oral (B), lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solución no interfieren con la determinación del principio activo. En cuanto a la muestra sometida a condiciones drásticas de oxidación se observa en el cromatograma (D) la aparición de un pico secundario atribuible a un posible producto de degradación, el cual no interfiere con la determinación del fármaco, lo que demuestra que el método es capaz de detectar, separadamente, al principio activo de su producto de degradación en medio oxidante.
El método analítico para la cuantificación de levodropropizina en gotas orales por CLAR resultó ser lineal, preciso, exacto y específico en el rango de concentraciones estudiado.
Levodropropizine is a synthetic substance, acting at the peripheral level and which has proved to have an efficient antitussive action. An analytic method was developed and validated by high pressure liquid chromatography to quantify levodropropizine in oral drops at 6 %. The following validation parameters were analyzed: lineality, specificity, precision, accuracy and range, according to what is established by the USP 23 for this assay category. The method developed proved to be lineal, specific, accurate and exact in the studied concentration range; therefore, its use is considered as accessible for the quantification of levodropropizine in the quality control and in the stability study of the oral drops.
Subject headings: ANTITUSSIVE AGENTS/therapeutic use; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID/methods; QUALITY CONTROL.
Recibido: 30 de abril de 2002. Aprobado: 3 de junio de 2002.
Lic. Xiomara Pérez Gutiérrez. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: cidem@infomed.sld.cu