Método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de carbamazepina en plasma humano

Narda M. Jiménez Alemán,1 Jorge E. Calero Carbonell,1 y Alejandro S. Padrón Yaquis,2 Julio C. Izquierdo Lozano3

Resumen

Entre los requisitos para desarrollar los estudios de biodisponibilidad y bioequivalencia se encuentra contar con metodologías analíticas validadas para el trabajo con muestras en fluidos biológicos. Se desarrolló un método por cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de carbamazepina en plasma humano, se utilizó como fase móvil una mezcla de hidrógeno fosfato de sodio: acetonitrilo (65:35) ajustada a pH= 3,3 con ácido fosfórico, flujo de 1,2 mL/min y detección ultravioleta a 210 nm. Se empleó propilparabeno como estándar interno. Conforme con las regulaciones establecidas para la validación de métodos en fluidos biológicos se estudiaron los parámetros siguientes: estabilidad de las muestras, linealidad, especificidad, precisión, exactitud y límite de detección y cuantificación. El método resultó específico y sensible con un límite de detección y cuantificación de 0,9 y 1,0 ng, respectivamente. El método fue lineal, preciso y exacto en el rango de concentraciones de 1,07 a 12,67 µg/mL. La recuperación media no fue estadísticamente diferente del 100,0 %. El analito en la matriz biológica propuesta permaneció en el periodo estudiado. La metodología descrita en este trabajo se aplica en nuestro caso al estudio que evalúa la biodisponibilidad y bioequivalencia de una formulación cubana de carbamazepina en voluntarios sanos.

Palabras clave: Carbamazepina, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), validación.

La carbamazepina es un derivado del iminoestilbeno con un grupo carbonilo, el cual es esencial para su efecto antiepiléptico. Tiene relación química con los antidepresivos triciclícos. E s un polvo blanco amarillento cristalino con un punto de fusión entre 189-193 °C. Es prácticamente insoluble en agua y éter, soluble 1 en 10 de alcohol y en 1 en 10 de cloroformo, soluble en acetona. Su fórmula molecular es C15H12N2O . Posee un peso molecular igual a 236,27 g/mol. Posee un valor de pka entre 0,82 y 1,43. Su fórmula estructural es:

Para la determinación de carbamazepina en plasma se han utilizado diversos métodos analíticos entre los que se encuentran diferentes técnicas por cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), de ellos los de mayor frecuencia son los que emplean sistemas en fase reversa con detección ultravioleta.1-4

La CLAR ha sido ampliamente utilizada en el análisis de una gran variedad de principios activos en fluidos biológicos; para la cuantificación de carbamazepina en plasma humano se describen numerosas variantes aplicando extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida y column-switching.5-7 En este trabajo se propone un método por CLAR con extracción líquido-líquido para la determinación de carbamazepina en plasma humano, este fue validado siguiendo las regulaciones vigentes para la validación de métodos en fluidos biológicos.

Métodos

Para la cuantificación de carbamazepina en plasma humano se desarrolló una técnica por CLAR; en la que se utilizó el método de estándar interno. Se empleó un cromatógrafo líquido de alta resolución KNAUER constituido por: desgasificador, bomba de doble pistón reciprocante, detector UV-visible de longitud de onda variable, autoinyector KONTRON e integrador acoplado a interfase con software CHROMGATE 2000 para el procesamiento de los datos. Se utilizó carbamazepina estándar de referencia USP, reactivos y los solventes de calidad puros para análisis (Merck).

Se preparó una solución de estándar de carbamazepina (S1) y una solución de estándar interno de propilparabeno (S2) ambas disueltas en una mezcla metanol:agua a una concentración de 100 µg/mL. A partir de estas 2 soluciones se preparó una curva patrón en el rango de 80 ng/mL a 12,67 µg/mL de carbamazepina.

Las muestras de plasma se prepararon en viales Eppendorf de 1,5 mL, se tomó 500 µL de plasma contaminado con carbamazepina, al cual se le adicionó 1 mL de metanol previamente contaminado con estándar interno (propilparebeno, 0,5 µg/mL), se aplicó vortex y se centrifugó a 12 000 rev/min. Se tomó el sobrenadante y se inyectó.

Las condiciones cromatográficas empleadas fueron c olumna y precolumna LiChrosorb RP-18 de 10 µm de 250 mm y 40 mm de longitud por 4 mm de diámetro interno, respectivamente; la fase móvil consistió en una mezcla homogénea y desgasificada de acetonitrilo: hidrógeno fosfato de sodio (65:35) ajustada a pH= 3,3 con ácido fosfórico, a un flujo de 1,2 mL/min y un volumen de inyección 20 µL. El registro de los cromatogramas se realizó a una longitud de onda de 210 nm.

Para la validación de la técnica se determinaron los parámetros de desempeño al método analítico de con un protocolo de validación elaborado para ese objetivo y que comprende los parámetros siguientes: estabilidad del analito en la muestra biológica, linealidad del sistema y del método, especificidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), exactitud y límites de detección y cuantificación.

Para evaluar la estabilidad del analito en la muestra biológica, se analizaron muestras en varias etapas del estudio sometidas a diferencias de temperatura:

• Estabilidad a corto plazo (un período de congelación/descongelación): preparar 3 muestras de concentración baja y 3 muestras de concentración alta y congelar a -20 ºC, descongelar a temperatura ambiente y mantener esta temperatura desde 4 a 24 h (basado en el tiempo que las muestras permanecerán a temperatura ambiente durante el estudio).
• Ciclos de congelación/descongelación: colocar 3 muestras de concentración baja y 3 muestras de concentración alta por 24 h a -20 ºC, descongelar a temperatura ambiente, volver a congelar por 12 a 24 h a -20 ºC y se repite 2 veces más.
• ]]> Estabilidad a largo plazo (durante el estudio): preparar 9 muestras de concentración baja y 9 muestras de concentración alta y congelar a -20 ºC, analizar al menos 2 veces durante el tiempo de almacenamiento (3 meses) y al finalizar el estudio.

Para evaluar la linealidad del sistema y del método se realizaron los pasos siguientes:

Para la especificidad se analizaron muestras blanco de plasma (usando una mezcla de plasma de diferentes grupos sanguíneos: sin analito, sin estándar interno y contaminado con estos). Cada muestra blanco se analizó para determinar la presencia o no de interferencias (sustancias endógenas), utilizando el método cromatográfico descrito anteriormente.

La precisión se evaluó teniendo en cuenta los criterios de repetibilidad y precisión intermedia; para ello se realizó el análisis repetido (10 veces) de una muestra homogénea (0,5 µg/mL) y el análisis de una misma muestra homogénea (0,5 µg/mL) por diferentes analistas, respectivamente.

• Se preparó una curva donde se adicionaron cantidades conocidas de la sustancia a analizar y del estándar interno. Se utilizaron 5 puntos con concentraciones de 1,07; 3,33; 5,33; 10,67 y 12,67 µg/mL que se analizaron por triplicado.
• Se determinó la concentración real y el porcentaje de recuperación en cada nivel.
• Se graficaron los datos de la concentración teórica en función de la concentración real. Se calculó la recta de regresión lineal utilizando el método de los mínimos cuadrados y= Ax + B.
• Se realizó el análisis estadístico, ensayo del intercepto, de la pendiente y una prueba de la t de Student al porcentaje de recuperación.

Resultados

Estabilidad del analito en la muestra biológica

Los resultados de porcentaje de recobrado para de estabilidad de la carbamazepina en la matriz biológica a las concentraciones de 1,07 y 12,67 µg/mL a los diferentes períodos/ciclos de congelación/descongelación, se encuentran dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos en fluidos biológicos (80-125 %): 1 mes de estabilidad 102,6, varios ciclos de congelación/descongelación 101,9 y 3 meses de estabilidad de 101,2

Linealidad del sistema y del método

Los resultados del estudio de linealidad del sistema y del método aparecen en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad

Especificidad

Fig. 1. Cromatograma de muestra blanco (sin analito y sin estándar interno).

Precisión

Los resultados de repetibilidad y precisión intermedia se muestran en las tablas 2 y 3. Los valores se expresan en % de recobrado.

Tabla 2. Resultados del estudio de precisión (repetibilidad)

Tabla 3 . Resultados del estudio de precisión (precisión intermedia)

Exactitud

Para el estudio de exactitud en el rango de concentraciones seleccionado los valores de porcentaje de recobro estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos en fluidos biológicos (80-125 %) con un valor promedio del 99,8 % , el valor del coeficiente de variación resultó ser del 3,01 %; se obtuvo un coeficiente de correlación de 0,99977 y una desviación estándar relativa de 0,40 %.

Límites de detección y cuantificación

Los resultados de los límites de detección y cuantificación estimados a partir de la recta de regresión, considerando concentraciones bajas de la sustancia a analizar, se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Límites de detección y cuantificación expresados en concentración para un volumen de 20 µL

Discusión

Los resultados del estudio de linealidad del sistema y del método responden a los requisitos establecidos; el coeficiente de variación de los factores de respuesta es menor que el 5 %; el coeficiente de correlación es mayor que 0,99 y la desviación estándar relativa de la pendiente Sbrel es menor que el 2 %. Se cumple con el ensayo de proporcionalidad ya que la tcal < ttab para un nivel de confianza de p = 0;05 con n-2 g.l., por lo que se rechaza la hipótesis nula de no correlación entre la concentración y la señal, y el intervalo de confianza del intercepto incluye al cero (se puede considerar que no se presentaron sesgos).

Al analizar los cromatogramas en el estudio de especificicdad no se observó interferencia entre los componentes endógenos del plasma, el analito de interés, el estándar interno utilizado y sus posibles metabolitos. Por lo que se plantea que el método es específico para la determinación de carbamazepina utilizando como estándar interno propilparabeno.

En los resultados para el estudio de precisión el coeficiente de variación obtenido cumple con lo establecido al ser menor que el 5 %. El ensayo de precisión intermedia mostró que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas al efectuarse una prueba de significación de Fisher, así como entre las medias obtenidas, lo que se demostró por la prueba de significación de la t de Students para un nivel de confiabilidad de p= 0,05 con n-2 g.l.

El estudio de exactitud cumple con los requisitos establecidos, el coeficiente de correlación es mayor que 0,99, la desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel) es menor que el 2 %, el intervalo de confianza del intercepto y de la pendiente incluye el valor cero y el uno, respectivamente y el coeficiente de variación es menor que el 5,0 %. El recobrado se encuentra entre 94-103 %.

Los límites de detección y cuantificación resultaron 0,9 y 1,0 ng, respectivamente.

El método analítico resultó lineal, preciso, específico y exacto en el rango de concentraciones estudiadas para la cuantificación de carbamazepina en plasma.

Summary

Analytical method by high resolution liquid chromatography for the determination of carbamazepine in human plasma

One of the requirements to develop the studies of bioavailability and bioequivalence is to have analytic methodologies validated for the work with samples in biological fluids. A method was developed by high resolution liquid chromatography for the determination of carbamazepine in human plasma. A mixture of hydrogen phosphate of sodium: acetonitrile (65:35) adjusted to pH= 3.3 with phosphoric acid, flow of 1.2 mL/min and ultraviolet detection at 210 nm, was used as mobile phase. Propylparabene was used as an internal standard. According to the established regulations for the validation of the methods in biological fluids, the following parameters were studied: stability of the samples, lineality, specificity, precision, accuracy and limit of detection and quantification. The method proved to be specific and sensitive with a detection and quantification limit of 0.9 and 1.0 ng, respectively. The method was lineal, precise and exact in the range of concentrations of 1. 07 at 12.67 µg/mL. The mean recovery was not statistically different from 100.0 %. The analito in the proposed biological matrix remained in the studied period. The methodology described in this work is applied in our case to the study that evaluates the bioavailability and bioequivalence of a Cuban formulation of carbamazepine in healthy volunteers.

Key words: Carbamazepine, high resolution liquid chromatography (HRLC), validation.

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Recibido: 11 de octubre de 2006. Aprobado: 17 de noviembre de 2006.
Lic. Narda M. Jiménez Alemán. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de La Revolución. La Habana, CP 10 600, Cuba. Correo electrónico: cidem@infomed.sld.cu

1 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas.
2 Doctor en Ciencias Farmacéuticas.
3 Técnico en Tecnología Farmacéutica.