Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
Caridad M. García Peña,1 Leonid Torres Amaro,2 Rosa Menéndez Castillo,3 Esther Sánchez,4 Vivian Martínez Espinosa,5 María Lidia González5 y Carlos Rodríguez6
Se desarrolló y validó un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución, aplicable al control de la calidad de la droga seca de Guacamaya francesa (Senna alata L. Roxb.) con detección ultravioleta a 340 nm. El método por cromatografía líquida de alta resolución empleado para cuantificar los sennósidos A y B, componentes mayoritarios, fue validado y resultó específico, lineal, preciso y exacto.
Palabras clave: Sennósido A, Sennósido B, Senna alata L. Roxb., cromatografía líquida de alta resolución.
La Guacamaya francesa pertenece a la familia de las Caesalpinaceas. Su acción farmacológica la define como antiherpética, antibacteriana y antifúngica. La droga está constituida por las hojas y en ocasiones puede presentar flores. La Senna alata L. Roxb presenta como componentes mayoritarios los sennósidos (A y B), los que presentan en su estructura química grupos funcionales que posibilitan la cuantificación por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR).1
El desarrollo de técnicas o métodos analíticos novedosos o la adecuación de algunos ya reportados es un problema cotidiano. Siempre que esto suceda se exige como parte integral del estudio, la validación del método en cuestión. La validación proporciona un alto grado de confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico así como también en la calidad de los resultados.2-6
En la actualidad reviste gran importancia la validación de métodos analíticos, fundamentalmente cuando se trabaja con productos naturales, debido a la complejidad de la matriz, donde es necesario obtener datos y resultados experimentales que demuestren la aptitud para el uso que se destina.7,8
La CLAR representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno, porque es un método muy selectivo, sensible y específico.9
En el presente trabajo se desarrolló y validó un método analítico por CLAR, aplicable al control de la calidad de la droga cruda de dicha especie, empleándose el procedimiento de preparación de muestras y sustancias de referencias, desarrollado por la doctora Zekita Setsuko, para la determinación de los sennósidos en otras especies de Senna, donde demostró que con este procedimiento se lograba extraer totalmente los productos activos de interés en las muestras y la disolución de las sustancias de referencias químicas, y se comprobó que no ocurre ionización de las referencias (Técnica desarrollada por la doctora Zekita Setsuko: Determinación de sennósidos en la Senna acustifolia, procedente del Japón).
En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 340 nm, un dosificador (Loop) de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna Lichrospher 250 x 4 mm , RP 18, 5 µm, utilizándose para esta una temperatura de 50 °C.
La fase móvil empleada consistió en una mezcla desgasificada de 2 componentes, solución de bromuro de tetra-n-etilamonio (se disolvieron 2,45 g bromuro de tetra-n-etilamonio en 1000 mL de una mezcla de ácido acético 1 mol/L y solución buffer acetato de sodio (1 en 10) a pH 5,0): acetonitrilo en proporción (17:8) con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.
Para el análisis se pesaron separadamente 0,01 g de sustancia de referencia química de sennósido A y B, procedentes de Japón, y se disolvieron en 20 mL de una solución de hidrógeno carbonato de sodio (1 en 100), se colocaron en ultrasonido (Branson 3RSD) durante 5 min, utilizándose estas soluciones como soluciones stock A y B, respectivamente.
La solución de referencia fue preparada a partir de 5 mL de la solución stock A y 10 mL de la solución stock B, se trasvasaron a un matraz aforado de 50 mL y se le adicionó metanol para utilizarla como solución de referencia.
Las muestras, cultivadas y secadas en la Estación de Plantas Medicinales "Juan Tomás Roig" perteneciente al CIDEM, fueron preparadas de la manera siguiente: a 0,5 g de la droga vegetal pulverizada, se le adicionaron 25 mL de metanol diluido (7 en 10) y durante 30 min fueron agitados en zaranda (Branson). Posteriormente se centrifugaron a 3 000 rev/mim durante 10 min, el sobrenadante se trasvasó a un matraz aforado de 50 mL. A los residuos obtenidos se le adicionaron 10 mL de metanol diluido (7 en 10) y se centrifugaron nuevamente a 3 000 rev/mim durante 10 min. El sobrenadante obtenido se le adicionó al volumétrico, posteriormente se adicionó metanol diluido (7 en 10) hasta completar volumen.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizaron las sustancias de referencia de los sennósidos A y B y la muestra de Senna alata L. Roxb.2,3
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones patrones de Sennósido A y B en un rango de concentraciones de 3,0 a 70,0 mg/mL, evaluándose el coeficiente de correlación, la ecuación de la recta, la prueba de linealidad y la prueba de proporcionalidad.4,5
Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 5 determinaciones para cada uno de los sennósidos y se efectuaron valoraciones por 2 analistas, en 2 días diferentes, para comprobar la precisión intermedia del método; para su evaluación se realizó un análisis de varianza, a través de la determinación del coeficiente de variación, prueba de Fischer y de la t de Student.6,7
En el estudio de la exactitud y linealidad del método se empleó el método de recuperación adicionando una cantidad conocida de sustancias de referencia química de sennósidos A y B, respectivamente, preparando muestras con diferentes niveles de sennósido A y; evaluándose los parámetros de la prueba de la t de Student, de Cochran, ecuación de la recta y coeficiente de correlación.8
]]> Todos los resultados obtenidos fueron evaluados estadísticamente con la ayuda del programa Microcal Origin 5.0 para Windows.La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método realizado para el control de la calidad de la droga seca. Como se observa en los cromatogramas correspondientes a las soluciones de referencias del sennósido A y el sennósido B, (I) y (II), respectivamente, la muestra (III), no se observó ninguna señal en las zonas de elusión de los componentes activos a cuantificar. Además se pudo apreciar que el tiempo de retención de los sennósidos en la muestra coincide con el tiempo de retención de las sustancias de referencias química.
Fig. Resultados del estudio de especificidad. I) Cromatograma de la solución de referencia del sennósido A; II) cromatograma de la solución de referencia del sennósido B; III) cromatograma de la muestra de Senna alata L. Roxb. IV) cromatograma de la muestra de Senna alata L. Roxb contaminada con sustancia de referencia del sennósido A; V) cromatograma de la muestra de Senna alata L. Roxb contaminada con sustancia de referencia del sennósido B.
Simultáneamente se realizó un scanning a los picos correspondientes de los sennósidos A y B, en un rango de 200 a 500 nm, obteniéndose una pureza del 99,1 y 99,5 %, respectivamente.
Las ecuaciones de las rectas, se expresan según: y= 2,58902 E7 X - 1,44661 E5 ( sennósido A) y y= 2,10647 E7 X - 3,34358 E5 (sennósidos B), y los coeficientes de correlación lineal de 0,99887 y 0,99943, respectivamente. Al aplicar la prueba de linealidad para los sennósidos A y B, utilizando el coeficiente de variación de los factores de respuesta, se obtuvieron CVf = 3,7 y 4,2 %, respectivamente, lo que demostró una adecuada linealidad según el límite establecido (CVf < 5 %).
Los resultados en el estudio de la precisión del método, para los sennósidos B y A, se reportan en las tablas 1 y 2.
Tabla 1. Resultados de la precisión del método cromatográfico para el sennósido B
| Analista I (%) | ]]> Analista II (%) | ||
| Día I | Día II | Día I | Día II |
| 0,582 | 0,589 | 0,608 | 0,602 |
| 0,595 | ]]> 0,604 | 0,602 | 0,579 |
| 0,570 | 0,605 | 0,612 | 0,608 |
| 0,567 | 0,579 | 0,599 | ]]> 0,589 |
| 0,590 | 0,605 | 0,578 | 0,610 |
| CV= 1,87 % | CV= 1,77 % | CV= 1,97 % | CV= 1,98 % |
| Fcal = 4,98 | ]]> Ftab = 6,39 | ||
| tcal = 2,98 | ttab = 3,51 | ||
Tabla 2. Resultados de la precisión del método cromatográfico para el sennósido A
| Analista I (%) | Analista II (%) | |||
| Día I | Día II | Día I | ]]> Día II | |
| 0,272 | 0,269 | 0,279 | 0,281 | |
| 0,268 | 0,274 | 0,268 | 0,274 | |
| 0,263 | ]]> 0,270 | 0,281 | 0,280 | |
| 0,277 | 0,267 | 0,284 | 0,269 | |
| 0,265 | 0,261 | 0,277 | ]]> 0,272 | |
| CV= 1,87 % | CV= 1,59 % | CV= 1,95 % | CV= 1,68 % | |
| Fcal = 5,56 | Ftab = 6,39 | |||
| tcal = 3,39 | ttab = 3,51 | |||
En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos del estudio de la exactitud del método, para cada uno de los sennósidos.
]]> Tabla 3. Resultados estadísticos del estudio de exactitud| Parámetros | Resultados | Límites | |
| Sennósido A | Sennósido B | ||
| Ecuación de la recta | Y= 2,89 x - 3,57 | Y= 3,46 x - 2,99 | Y = a x + b |
| Prueba de linealidad | CVf = 3,96 % | CVf = 4,56 % | CVf < 5,0 % |
| Recuperación media | ]]> 98,6 % | 98,0 % | 97,0-3,0 % |
| Prueba de proporcionalidad | tcal = 2,89 | tcal = 2,75 | tcal < ttab |
| Influencia del factor concentración | Gcal = 0,9018 | ]]>
Gcal = 0,9326 Gtab = 0,9669 | Gcal < Gtab |
Los resultados obtenidos del análisis de la especificidad del método demuestran la especificidad del método al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusión de los sennósidos A y B.
Los tiempos de retención obtenidos en las sustancias de referencias y en las muestras coinciden con los obtenidos por la doctora Zekita Setsuko, en trabajos realizados por CLAR en la Senna acustifolia procedentes del Japón, las cuales presentan mayor cantidad de sennósidos A que B, mientras que la Senna alata cultivada en nuestro país, presenta como componente mayoritario en relación con los sennósidos el B.
El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza de los picos de los sennósidos A y B, en el rango de 200 a 500 nm, demostró que no existía solapamiento de otros componentes.
La curva de calibración a 340 nm resultó ser lineal en el rango de concentraciones comprendido entre 3,0 a 70 mg/mL.
Al aplicar la prueba del intercepto, este resultó ser no significativo ya que la tcal fue menor que la ttab, para una probabilidad de 0,05. En la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf se obtuvo un coeficiente de variación menor del 5 %, lo que demuestra la adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido, por lo que se demuestra el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentración estudiado.
En el estudio de la repetibilidad se alcanzaron coeficientes de variación adecuados, menores que el 2 %, lo que demuestra la buena precisión del método. Los valores obtenidos para el estudio de la precisión intermedia demuestran que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días para una probabilidad de 0,05 % ya que los valores de Fcal son menores que la Ftab. Al realizar la prueba de Student los valores calculados resultaron menores que los tabulados para una probabilidad de 0,05, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas, para cada sennósido, con un nivel de significación del 5 %.
En el rango seleccionado en el estudio de exactitud, para cada sennósido, los valores de porcentaje de recobros estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos (97-103 %) y los valores de los coeficientes de variación para cada uno de los niveles de concentración estudiados resultaron menores que el 2 %. En la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran se obtuvieron que las Gexp fueron menores que las Gtab; por tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes e indican que la concentración no influye en la variabilidad de estos. No existen diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 % de recuperación al aplicar la prueba de la t de Student, ya que las tcal fueron menores que las ttab, por lo que el método es exacto. Las curvas de recuperación reportada de mg agregados contra los mg recuperados demostraron un comportamiento lineal. Las pruebas de significación del intercepto resultaron no significativas y los valores de las pendientes no difieren significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de las pendientes, los interceptos y los coeficientes de correlación demostraron la exactitud y linealidad del método.
]]> En conclusión, el método analítico desarrollado por CLAR, para cuantificar los sennósidos A y B, en el control de la calidad de la Guacamaya francesa (Senna alata L. Roxb) resultó específico, lineal, preciso y exacto.An analytical method was developed and validated by high resolution liquid chromatography applicable to the quality control of the dry drug of French guacamaya (Senna alata L. Roxb.) with ultraviolet detection at 340 nm. The method by high resolution liquid chromatography used to quantify the sennosides A and B, the greatest components, was validated and it proved to be specific, lineal, precise and exact.
Key words: Sennoside A, Sennoside B, Senna alata L. Roxb, high resolution liquid chromatography.
1. Acosta L, Rodríguez C. Plantas medicinales. Bases para la producción sostenible. OMS. 2006. p. 151-2.
2. Castro M, Gascón S. Validación de métodos analíticos. Sección Catalana de A.E.F.I. Comisión de Normas de Buena Fabricación y Control de la Calidad. Sept , 1989. p. 1-94.
3. United States Pharmacopoeial Convention. USP 23. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville , Mack Printing; 1995. p. 1982-4.
4. Standar Procedure: Protocol for the validation of analytical method.1992. p. 22-3.
5. ICH Topic Q2B. Validation of Analytical Procedures. Methodology. Step 4. Guideline, Nov. 6/1996.
6. Sarrio RV, Silvestre LJ. Validation of Analytical Assays and Test Methods for the Pharmaceutical Laboratory. The Regulatory Forum. Bioserch. 1996.
7. Text on Validation of Analytical Procedures. Federal Register, Vol. 60. No. 40; Wednesday March 1, 1995. Docked No. 94 D-0016.
8. Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods. Analytical Methods Technical Committee of the Chemistry, Manufacturing Controls Coordinating Committee of CDER at FDA, November 1, 1994.
9. Quattrocchi OA, De Andrizzi SA, Laba RF. Introducción a la HPLC. Aplicación y práctica. Buenos Aires: Artes Gráficas Farro S.A; 1992. p. 106-122, 284, 302-28
Recibido: 11 de octubre de 2006. Aprobado: 17 de noviembre de 2006.
M. C. Caridad M. García Peña. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de La Revolución. La Habana, CP 10 600, Cuba. Correo electrónico: caridad@cidem.quimefa.cu
1 Master en Ciencias. Investigadora Agregada.
2 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Investigador Agregado.
3 Investigadora Auxiliar. ]]>
4 Master en Química Farmacéutica. Investigadora Auxiliar.
5 Técnica en Tecnología Farmacéutica.
Técnico en Agronomía.